Inzulinu podobné a jiné růstové faktory a nádory Insulin like and other growth factors and tumors Disertační práce Plzeň 2011 Mgr. Radek Kučera Summary The interaction between growth factors and cancer incidence and development has been discussed recently. First works suggesting possible connection between increased production of insulin like growth factors with an increased incidence of tumors came already from early 80s of the last century. The aim of my work was focused on evaluation of possible relation between insulin like growth factors or their binding proteins and tumors from different perspectives, to assess their significance and try to determine what role the IGFs and IGFBPs may play in the current tumor diagnostics. The work itself is divided into two parts, the theoretical and practical ones. In the theoretical part, I summarized the action of IGF in human body and also focused on previous findings on the role of IGF system in cancer diagnoses. In the practical part, divided into three subsections, I focused on investigation of relations in a large set of patients with different cancer diagnoses, in a group of women with breast cancer and, finally, I focused on changes of IGF1 levels during follow-up. Theoretical part Insulin-like growth factors (IGF) are peptides, that participate on growth...

Objetivos do Estudo: O aumento do crescimento de melanoma foi avaliado em camundongos expostos a hipóxia intermitente. As proteínas que caracterizam a agressividade do tumor ainda não foram investigadas. O estudo teve como objetivo verificar se a hipóxia intermitente simulada pela apneia do sono afeta marcadores de melanoma na progressão tumoral. Desenho: Estudo prospectivo controlado em animais. Senário: Hospital Universitário. Participantes: Doze camundongos C57BL/6. Intervenções: Camundongos foram expostos a hipóxia intermitente ou simulada. Durante 8 horas por dia, o grupo hipóxia foi submetido a um total de 480 ciclos de 30 segundos de hipóxia progressiva SpO2 nadir de 8 ± 1%, seguidos por 30 segundos de normóxia. Um milhão de células de melanoma B16F10 foi injetado por via subcutânea. No dia 14, após a eutanásia, os tumores foram removidos, fixados e corados. Médias e resultados: coloração imunohistoquímica de Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGF, Caspase-1 e HIF-1α foi quantificada por dois observadores que utilizaram captura digital e processamento em três lâminas de cada animal para cada marcador. O tamanho e o peso dos tumores foram semelhantes nas experiências de hipóxia e simulada. A percentagem da mediana [25-75 quartis] de área positiva corada para Ki-67 foi de 23% [15-28] no grupo hipóxia e 0,3% [0,2-1,1] no grupo controle (P = 0,02); para PCNA, as percentagens foram 31% [25-38] e 7% [5-18], respectivamente (P = 0,009). As diferenças entre os grupos para os marcadores restantes não foram significativas. Conclusões: Os marcadores da transcrição do RNA ribossomal e da síntese de DNA são mais expressos em tumores de camundongos expostos a hipóxia intermitente do que em controles, indicando que a apneia do sono pode levar a uma maior agressividade do tumor. / Study Objectives: Increased melanoma growth has been reported in mice exposed to intermittent hypoxia. Proteins that characterize tumor aggressiveness have not been investigated. The study aims to verify whether intermittent hypoxia mimicking sleep apnea affects markers of melanoma tumor progression. Design: Prospective controlled animal study. Settings: University hospital. Participants: Twelve C57bl/6 mice. Interventions: Mice were exposed to intermittent or sham hypoxia. During 8 hours per day, the hypoxia group was submitted to a total of 480 cycles of 30 seconds of progressive hypoxia to a nadir FIO2 of 8±1%, followed by 30 seconds of normoxia. One million B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously. On the 14th day, after euthanasia, tumors were removed, fixed and stained. Measurements and Results: Immunohistochemistry staining for Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGFβ, Caspase-1 and HIF-1α was quantified by two observers using digital capture and processing in three slides from each animal for each marker. The size and weight of the tumors were similar in hypoxia and simulated experiments. Median [25-75 quartiles] percentage of positive area stained for Ki-67 was 23% [15-28] in the hypoxia group and 0.3% [0.2-1.1] the control group (P=0.02); for PCNA, the percentages were 31% [25-38] e 7% [5-18], respectively (P=0.009). The differences between the groups for the remaining markers were not significant. Conclusions: Markers of ribosomal RNA transcription and of DNA synthesis are more expressed in tumors of mice exposed to intermittent hypoxia than of controls, indicating that sleep apnea can lead to greater tumor aggressiveness.

Objetivos do Estudo: O aumento do crescimento de melanoma foi avaliado em camundongos expostos a hipóxia intermitente. As proteínas que caracterizam a agressividade do tumor ainda não foram investigadas. O estudo teve como objetivo verificar se a hipóxia intermitente simulada pela apneia do sono afeta marcadores de melanoma na progressão tumoral. Desenho: Estudo prospectivo controlado em animais. Senário: Hospital Universitário. Participantes: Doze camundongos C57BL/6. Intervenções: Camundongos foram expostos a hipóxia intermitente ou simulada. Durante 8 horas por dia, o grupo hipóxia foi submetido a um total de 480 ciclos de 30 segundos de hipóxia progressiva SpO2 nadir de 8 ± 1%, seguidos por 30 segundos de normóxia. Um milhão de células de melanoma B16F10 foi injetado por via subcutânea. No dia 14, após a eutanásia, os tumores foram removidos, fixados e corados. Médias e resultados: coloração imunohistoquímica de Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGF, Caspase-1 e HIF-1α foi quantificada por dois observadores que utilizaram captura digital e processamento em três lâminas de cada animal para cada marcador. O tamanho e o peso dos tumores foram semelhantes nas experiências de hipóxia e simulada. A percentagem da mediana [25-75 quartis] de área positiva corada para Ki-67 foi de 23% [15-28] no grupo hipóxia e 0,3% [0,2-1,1] no grupo controle (P = 0,02); para PCNA, as percentagens foram 31% [25-38] e 7% [5-18], respectivamente (P = 0,009). As diferenças entre os grupos para os marcadores restantes não foram significativas. Conclusões: Os marcadores da transcrição do RNA ribossomal e da síntese de DNA são mais expressos em tumores de camundongos expostos a hipóxia intermitente do que em controles, indicando que a apneia do sono pode levar a uma maior agressividade do tumor. / Study Objectives: Increased melanoma growth has been reported in mice exposed to intermittent hypoxia. Proteins that characterize tumor aggressiveness have not been investigated. The study aims to verify whether intermittent hypoxia mimicking sleep apnea affects markers of melanoma tumor progression. Design: Prospective controlled animal study. Settings: University hospital. Participants: Twelve C57bl/6 mice. Interventions: Mice were exposed to intermittent or sham hypoxia. During 8 hours per day, the hypoxia group was submitted to a total of 480 cycles of 30 seconds of progressive hypoxia to a nadir FIO2 of 8±1%, followed by 30 seconds of normoxia. One million B16F10 melanoma cells were injected subcutaneously. On the 14th day, after euthanasia, tumors were removed, fixed and stained. Measurements and Results: Immunohistochemistry staining for Ki-67, PCNA, S100-B, HMB-45, Melan-A, TGFβ, Caspase-1 and HIF-1α was quantified by two observers using digital capture and processing in three slides from each animal for each marker. The size and weight of the tumors were similar in hypoxia and simulated experiments. Median [25-75 quartiles] percentage of positive area stained for Ki-67 was 23% [15-28] in the hypoxia group and 0.3% [0.2-1.1] the control group (P=0.02); for PCNA, the percentages were 31% [25-38] e 7% [5-18], respectively (P=0.009). The differences between the groups for the remaining markers were not significant. Conclusions: Markers of ribosomal RNA transcription and of DNA synthesis are more expressed in tumors of mice exposed to intermittent hypoxia than of controls, indicating that sleep apnea can lead to greater tumor aggressiveness.

MicroRNAs (miRNAs) represent a class of small noncoding RNAs that regulate gene expression. Recent studies have shown that miRNAs are mis-expressed in various human cancers and that some miRNAs have the potential to act as tumor suppressors or oncogenes. MiR-10b is one miRNA that has been shown to be deregulated in breast cancer. However, current findings regarding miR-10b’s role in breast cancer are controversial. MiR-10b was originally reported to be downregulated in breast cancer compared to normal breast tissue. Subsequently, miR-10b was argued to be upregulated in metastatic breast cancer cell lines, acting as a potent pro-metastatic agent via regulation of HOXD10. This report was soon challenged by another group who reported that miR-10b expression in a large patient cohort correlated inversely and significantly with tumor size, grade, and vascular invasion, but did not correlate with development of distant metastases or survival. These latter data suggest that miR-10b may impede specific functions associated with breast cancer progression. In this thesis, I present my analysis of miR-10b function in breast carcinoma cells, which revealed that it suppresses their migration and invasion. To define a mechanism that accounts for this suppressive function, I identified T-lymphoma invasion and metastasis 1 (TIAM1), a guanine nucleotide exchange factor for Rac1, as a miR-10b target and demonstrated that miR-10b inhibits TIAM1-dependent Rac1 activation, migration, and invasion. In addition, I identified the VEGF receptor fms-related tyrosine kinase 1 (FLT-1) as a second target of miR-10b and discovered a novel function for FLT-1 in promoting breast carcinoma cell migration and invasion. My results show, for the first time, that Rac activation can be regulated by a specific miRNA and provide a novel mechanism for the regulation of TIAM1 and FLT-1 in breast cancer. These data support the conclusion from clinical data that miR-10b expression correlates inversely with breast cancer progression, and suggest that miR-10b functions to impede breast carcinoma progression by regulating key target genes involved in cell motility.

Pacientes com linfoma difuso de grande célula B (LDGCB) do mesmo grupo de risco pelos critérios do Índice de Prognóstico Internacional (IPI), tratados com quimioterapia convencional à base de antraciclina, podem ter resposta terapêutica não esperada para seu grupo de risco. Isso pode ser explicado pelo fato do prognóstico dos LDGCB, que têm origem no centro germinativo (CG), ser superior aos originados após o CG (NCG). No intuito de aprimorar a avaliação de prognóstico e a abordagem terapêutica em LDGCB de IPI ajustado para a idade (IPIa) de risco intermediário alto e alto, elaboramos projeto de pesquisa, para verificar o papel dos marcadores imuno-histoquímicos (IH) e do transplante de medula óssea autólogo (ATMO), em primeira remissão completa (RC), neste grupo de pacientes. Avaliamos o impacto da expressão dos marcadores CD10, Bcl-6, MUM-1, Bcl-2 e p63 na obtenção de RC, sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG), isoladamente e de acordo com a origem em CG e NCG. Avaliamos 82 pacientes abaixo dos 60 anos, dos quais 16 (19,5%) receberam ATMO em primeira RC, além de serem comparados com os pacientes tratados com quimioterapia convencional e mantidos em observação após RC. A IH foi avaliável em 73 casos, 24 (32,9%) tiveram origem no CG e 49 (67,1%) NCG, sem diferença de sobrevida entre os grupos. A proteína Bcl-2 foi positiva em 27 (37%) pacientes e foi o único fator preditivo independente para SG à análise multivariada, com tendência de significância para RC. As SG e SLD em cinco anos para os 16 pacientes que receberam ATMO foi de 75% e 85,2%, respectivamente, a taxa de recidiva de 6,5% e diferença estatisticamente significativa para SLD (p = 0,015) em comparação aos pacientes apenas observados. Concluímos que o ATMO foi seguro e capaz de melhorar a sobrevida em LDGCB de risco intermediário alto e alto, e que a expressão de Bcl-2 pode ser utilizada na programação terapêutica inicial desses pacientes. / Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) patients from the same risk group according to the International Prognostic Index (IPI) treated with conventional anthracycline-based chemotherapy may show an unexpected therapeutic response. This can be explained by the fact that the prognosis of DLBCL originating in germinal center (GC) cells is superior than that originating out of germinal center (NGC). In order to improve the prognostic evaluation and the therapeutic approach to DLBCL patients with high intermediate to high age-adjusted IPI (aIPI), a research project was designed for the analysis of immunohistochemical markers and the role of autologous stem cell transplantation (ASCT) in first complete remission (CR) for this group of patients. The impact of the expression of CD10, Bcl-6, MUM-1, Bcl-2 and p63 markers on complete remission (CR), disease-free survival (DFS) and overall survival (OS), either individually and according to cell origin was evaluated by means of immunohistochemistry. Eighty-two patients aged under 60 years old were assessed, of which 16 (19.5%) underwent ASCT in first CR and were compared to patients receiving conventional chemotherapy and being monitored after CR. Immunohistochemistry was assessable in 73 cases, 24 (32.9%) being classified as GC-type and 49 (67.1%) as NGC-type, with no survival difference between the two groups. Bcl-2 expression was found in 37% (27) of the patients and was the single independent predicting factor of OS prognosis according to multivariate analysis. A significant tendency of expression of this protein was also observed for achieving CR, which was essential for longer survival, as shown by multivariate analysis. OS and DFS within 5 years were of 75% and 85.2% respectively for the group of 16 patients treated with ASCT, which resulted in lower relapse rates (6.5%) with statistically significant difference for DFS (p=0.015) when compared to the group of patients who achieved CR and was kept under monitoring. In this study ASCT was found to be a safe procedure for improving survival rates of DLBCL patients with high intermediate to high aIPI risk. Also, the expression of Bcl-2 protein was found to be useful as one of the variables to be analysed in the therapeutic approach to these patients

Introdução: O emprego da técnica de RT-PCR na detecção da expressão de genes epiteliais como a CK-19 no sangue periférico de pacientes com câncer de próstata é uma oportunidade para avaliar a progressão tumoral ao nível molecular na ausência de doença clinicamente mensurável. Material e métodos: Inicialmente 10 pacientes com nível sérico de PSA< 2ng/ml e toque retal sugestivo de hiperplasia prostática benigna foram incluídos como grupo controle através de coleta de sangue única para dosagem do transcrito da CK-19. Subsequentemente,foram seguidos de maneira prospectiva 44 pacientes com câncer de próstata (21 com doença localizada e 23 com doença metastática), com coleta de sangue seriada a cada 3 meses por 18 meses. Foi medida a expressão sérica do transcrito da CK-19 por RT-PCR na fração leucocitária do sangue periférico e correlacionada aos níveis séricos de PSA e outras variáveis clinicas e patológicas. Resultados: Nenhum de 10 pacientes controles apresentou expressão do transcrito da CK-19 no sangue periférico. Nos pacientes com câncer de próstata a expressão do transcrito da CK-19 na entrada do estudo não se correlacionou com o escore de Gleason, estádio clínico e os níveis séricos de DHL, Hemoglobina, PSA, Fosfatase alcalina ou Testosterona. A presença de pelo menos uma dosagem positiva de CK-19 durante o seguimento se correlacionou com o tempo para a progressão bioquímica do PSA na amostra como um todo(p=0,049) e no subgrupo com doença metastática(p=0,032). Conclusão: Não houve expressão do transcrito da CK-19 na fração mononuclear do sangue periférico em homens do grupo controle. Nos pacientes com câncer de próstata não houve correlação entre a expressão do transcrito da CK-19 na entrada do estudo e as principais variáveis clínicas e patológicas de prognóstico. Nos pacientes com câncer de próstata, a presença de pelo menos uma dosagem positiva para o transcrito da CK-19 no seguimento se correlacionou com um menor tempo para recidiva bioquímica , especialmente no subgrupo de pacientes com doença metastática tratados com hormonioterapia / Background: The recent introduction of sensitive RT-PCR-based techniques for the detection of epithelial antigen expression, such as CK-19,in the peripheral blood of prostate cancer patients may provide an opportunity to evaluate early tumor progression at the molecular level, even in the absence of measurable disease. Methods: Ten men with PSA <2ng/ml and digital rectal examination suggestive for benign prostatic hyperplasia were included as controls by only one colleted blood sample to measure of CK-19 transcript. We also studied serially collected blood samples of 44 patients with prostate cancer (21 with localized and 23 with metastatic disease) every three months for 18 months. We measured CK-19 transcript expression in the peripheral blood mononuclear fraction (PBMN) of these samples by RT-PCR and correlated it with PSA values and other clinical and pathologic variables. Results: None of the 10 normal control men showed CK-19 transcript expression in their PBMN. In the patients with prostate cancer, CK-19 transcript positivity at entry did not correlate with Gleason score, clinical stage, DHL, hemoglobin level, PSA, alkaline phosphatase or testosterone levels. Having at least one positive CK- 19 result during follow up correlated significantly with time to PSA progression in all coorte (p = 0.049) and in the subgroup of metastatic disease (p = 0.032). Conclusion: There are no expression of CK-19 transcript in the PBMN of control men. In prostate cancer patients there are no correlation between CK-19 at entry and the most important clinical and pathological prognostic variables. Prostate cancer patients that had at least one CK-19 transcript expression in the peripheral blood present lower time to PSA progression, specially metastatic patients receiving hormonal therapy

Introdução: O câncer de bexiga é a quinta neoplasia mais comumente diagnosticada no Ocidente, acometendo cerca de 336.000 novos indivíduos anualmente e levando a morte 132.000 pacientes em todo o mundo. No Brasil, a incidência de tumores vesicais para o ano de 1999 foi de 7.550, representando 2,8% do total de casos novos de câncer diagnosticados em ambos os sexos. Um dos grandes desafios terapêuticos para o câncer de bexiga é a identificação dos pacientes que inicialmente apresentam carcinoma papilífero de baixo grau, mas que irão recorrer ou progredir. Métodos: Neste estudo retrospectivo 64 pacientes foram avaliados por imunohistoquímica para a análise da expressão de E-caderina e &#946;-catenina. As marcações foram classificadas como focal ou difusa e categorizadas em negativo, fraco, moderado e forte. Os resultados foram correlacionados com grau histológico, estadiamento clínico, sobrevida livre de progressão e sobrevida livre de recidiva. O polimorfismo de ninjurin 1 foi genotipado por PCR-RFLP em 66 pacientes e 108 controles. Os genótipos foram correlacionados com grau histológico, estadiamento clínico, sobrevida livre de progressão e sobrevida livre de recidiva. Resultados: Em nossa casuística padrões mais intensos de imuno-expressão de Ecaderina foram estatisticamente associados a estádios clínicos mais avançados para carcinomas uroteliais da bexiga (p=0,005), além de menores tempos de recidiva (0,025) e progressão (0,049). O padrão de marcação difuso foi associado de forma estatisticamente significativa a estádios clínicos mais avançados (p=0,010). Não foram encontradas associações significativas entre os padrões de imuno-expressão de &#946;-catenina com grau histológico, estádio tumoral, recidiva ou progressão dos carcinomas uroteliais da bexiga. O alelo C do polimorfismo D110A de ninjurin 1 foi associado de forma estatisticamente significativa, em nossa amostra, com o aumento do grau histológico (p=0,041). Pacientes portadores do alelo C de ninjurin 1 apresentaram menores períodos para progressão tumoral quando comparados aos homozigotos AA (p=0,010). Conclusão: Nossos resultados sugerem que a expressão de E-caderina está envolvida nos processos tumorigênese do carcinoma urotelial de bexiga e que o polimorfismo D110A de ninjurin 1 pode participar da modulação desta patologia. / Introduction: Bladder cancer is the fifth neoplasm in Western countries, whose occurrence is 336,000 new cases annually, and also being responsible for 132,000 deaths in the worldwide. The incidence of bladder tumors in Brazil were 7,550 cases in 1999, representing 2,8% of overall diagnosed cancer in both gender. One of the main therapeutic challenges is identify which patients that present low grades neoplasms will present recurrence and/or progression. Methods: Sixty four patients were evaluated for E-cadherin e &#946;-catenin immunoexpression in a retrospective study. The staining patterns were classified as focal or difuse and categorized as negative, weak, moderate or strong. Results were correlated with tumor grade, clinical stage, progression and recurrence free survival. Ninjurin 1 polymorphism was evaluated by PCR-RFLP in 66 patients and 108 controls. Genotypes were correlated with tumor grade, clinical stage, progression and recurrence free survival. Results: E-cadherin moderate and strong staining patterns were significantly associated with high clinical stages of urothelial carcinoma of bladder (p=0.005), and short recurrence (p=0.025) and progression (p=0.049). Difuse staining pattern were significantly associated with high clinical stages (p=0.010). Neither histological grade, clinical stages, recurrence and progression free survival were associated with &#946;-catenin staining patters in our samples of urothelial carcinoma of bladder. The allele C of D110A ninjurin 1 polymorphism was significantly associated with high grade tumors (p=0.041). C carries patients compared with AA homozygous presented short disease progression (p=0.010). Conclusion: Our results suggest that E-cadherin expression is involved in urothelial carcinoma of bladder tumorigenesis and that D110A ninjurin 1 polymorphism may contribute to modulate this pathology.

NTRODUÇÃO: O carcinoma cortical da suprarrenal é uma neoplasia rara com uma incidência estimada em 0,5-2,0 por milhão por ano em adultos. No momento, poucas opções terapêuticas para os pacientes com doença metastática são disponíveis, e novas descobertas sobre a sua patogênese são necessárias. O perfil de expressão gênica dos microRNAs (miRNAs) em tumores humanos tem sido caracterizado por uma redução global da expressão dos miRNAs. A enzima DICER1 e seu cofator TRBP (codificado pelo gene TARBP2) estão envolvidos em uma etapa essencial do processamento dos miRNAs. De forma interessante, a desregulação do processamento dos miRNAs em células cancerosas devido ao silenciamento da DICER1 propiciou a emergência de células com fenótipo mais agressivo, acelerando a progressão tumoral. Recentemente, mutações somáticas missense recorrentes no domínio de clivagem RNase IIIb da enzima DICER1 foram identificadas em 29% tumores de ovários não-epiteliais esteroidogênicos (e em até 60% de tumores ovarianos de células de Leydig). Adicionalmente, mutações inativadoras no éxon 5 do gene TARBP2, com consequente prejuízo da função da DICER1, foram identificadas em linhagens celulares de tumores com instabilidade cromossômica. OBJETIVOS: Determinar a expressão gênica e proteica da DICER1 e TRBP em tumores do córtex da suprarrenal de adultos e crianças; Investigar variantes genéticas no domínio de clivagem RNAse IIIb do gene DICER1; Investigar variantes genéticas no éxon 5 do gene TARBP2; Estudar a expressão dos miR-103 e miR-107, envolvidos na regulação da DICER1, e do miR-497, envolvido na regulação da TRBP. MÉTODOS: A expressão proteica da DICER1 e da TRBP foi avaliada por imunohistoquímica em uma micromatriz tecidual contendo 198 tumores do córtex da suprarrenal [154 em adultos (75 adenomas e 79 carcinomas) e 44 em crianças (38 clinicamente benignos e 6 clinicamente malignos)]. A expressão gênica da DICER1 e TARBP2 foi avaliada em um subgrupo de 84 tumores (61 adultos e 23 pediátricos) e a expressão do miR-103, miR-107 e miR-497 em 82 tumores (59 adultos e 23 pediátricos). O sequenciamento dos genes DICER1 e TARBP2 foi realizado em um subgrupo quase idêntico de 83 tumores. RESULTADOS: Em adultos, uma expressão forte para a DICER1 foi encontrada em 24 de 75 adenomas (32%) e em 39 de 79 carcinomas (51%; X2= 4,8, p= 0,028). Similarmente, a hiperexpressão do gene DICER1 foi encontrada em 15 de 25 carcinomas (60%) e em 7 de 30 adenomas (23%; X2= 7,64, p= 0,006). Dentre os carcinomas de adultos, a imunorreatividade fraca para DICER1 foi significativamente mais frequente em carcinomas metastáticos do que em não metastáticos (66% vs. 31%; X2= 9,3, p= 0,002). Além de mais agressivos, os carcinomas com uma expressão fraca da DICER1 foram diagnosticados em pacientes com uma mediana de idade menor (35 vs. 45 anos, p= 0,02), maior tamanho (12,3 vs. 9 cm, p= 0,001), estadio mais avançado (ENSAT 3 ou 4 em 55% vs. 30%, p= 0,04) e maior escore de Weiss (6 vs. 4, p= 0,02). Adicionalmente, a expressão fraca para a DICER1 se correlacionou com uma significativa redução da sobrevida global (p= 0,004) e livre de doença (p= 0,005). Na análise multivariada, Ki67 >- 10% (p= 0,0001) e expressão proteica fraca para DICER1 (p= 0,048) permaneceram como marcadores significativos de recorrência. No grupo pediátrico, a expressão gênica e proteica da DICER1 não foi diferente entre tumores clinicamente malignos e benignos Não identificamos nenhuma variante genética nos quatro sítios de metais do domínio RNAse IIIb do gene DICER1 tanto em adultos como em crianças. Além disso, a expressão proteica e gênica da DICER1 não se correlacionou com a expressão do miR-103 e miR-107. O miR-107 foi hiperexpresso em carcinomas em relação a adenomas de adultos, mas não apresentou impacto na análise de sobrevida. Em relação ao gene TARBP2, a sua expressão gênica e proteica não teve correlação com parâmetros histopatológicos e clínicos em adultos e crianças. Variantes genéticas no sequenciamento do éxon 5 do gene TARBP2 não foram encontradas nesses tumores. Além disso, o miR-497 não foi expresso em nenhum dos tumores da nossa coorte. CONCLUSÕES: A baixa expressão proteica da DICER1 foi um marcador de prognóstico em pacientes adultos com carcinoma cortical da suprarrenal. A perda da expressão da DICER1 em carcinomas metastáticos não foi causada por mutações inativadoras no domínio RNase IIIb do gene DICER1 e nem por alteração na expressão do miR-103 e miR-107, reguladores da sua expressão em outros tecidos. Apesar do miR-107 ter sido hiperexpresso em carcinomas, a sua expressão não teve importância prognóstica. Por fim, a expressão do gene TARBP2 e da proteína TRBP não apresentou importância prognóstica nos tumores do córtex da suprarrenal / INTRODUCTION: Adrenocortical cancer is a rare neoplasia with an estimated incidence of 0.5-2.0/million/year in adults. There are currently few therapeutic options for patients with adrenocortical cancer, and new insights into the pathogenesis of this lethal disease are needed. The microRNA (miRNA) expression profile of human tumors has been characterized by an overall miRNA downregulation. DICER1 enzyme and its cofactor TRBP are a key component of the miRNA processing machinery. It was recently demonstrated that escaping miRNA control in cancer cells due to Dicer downregulation may allow the phenotypic emergence of more aggressive genetic variants, accelerating cancer progression. Recently, DICER1 mutations in the RNase IIIb domain were found in 29% of nonepithelial ovarian tumors, predominantly in Sertoli-Leydig cell tumors (60%). In addition, TARBP2 truncating mutations, causing DICER1 destabilization, were identified in tumor cell lines with microsatellite instability. AIM: To study the mRNA and protein expression of DICER1 and TRBP in adult and pediatric adrenocortical tumors; To investigate DICER1 mutations in metal biding sites located at the RNase IIIb domain; To investigate inactivating mutations in the exon 5 of TARBP2 gene; To determine the expression of miR-103 and miR-107, DICER1 regulators, and miR-497, a TRBP regulator. METHODS: Protein expression of DICER1 and TRBP was evaluated by immunohistochemistry in a tissue microarray with 198 adrenocortical tumors [154 in adults (75 adenomas and 79 carcinomas) and 44 in children (38 clinically benign and 6 malignant)]. Expression of DICER1 and TARBP2 genes was assessed in a subgroup of 84 tumors (61 adults and 23 children) and miRNA expression in 82 tumors (59 adults and 23 children). The DICER1 and TARBP2 gene sequencing was performed in a subgroup of 83 tumors. RESULTS: In adults, a strong DICER1 expression was demonstrated in 39 out of 79 carcinomas (51%) and in 24 out of 75 adenomas (32% X2= 4.8, p= 0.028). Similarly, DICER1 gene overexpression was demonstrated in 15 out of 25 carcinomas (60%) and in 7 out of 30 adenomas (23%; X2= 7.64, p= 0.006). Among adult adrenocortical carcinomas, a weak DICER1 expression was significantly more frequent in metastatic than in non-metastatic adrenocortical carcinomas (66% vs. 31%; X2= 9.3, p= 0.002). Besides being more aggressive, adult adrenocortical carcinomas with a weak DICER expression were diagnosed in younger patients (median 35 vs. 45 yrs, p= 0.02) and had larger size (12.3 vs. 9 cm, p= 0.001), more advanced staging (ENSAT 3 or 4 in 55% vs. 30%, p= 0.04) and higher Weiss score (6 vs. 4, p= 0.02). Additionally, a weak DICER1 expression was significantly correlated with a reduced overall (p= 0.004) and disease-free (p= 0.005) survival. In the multivariate analysis, Ki67 >- 10% (p= 0.0001) and a weak DICER1 expression (p= 0.048) remained as independent predictors of recurrence. In the pediatric group, DICER protein and gene expression was not different between clinically benign and malignant tumors. No variant was identified in the metal binding sites of the RNase IIIb domain of DICER1 gene in both adult and pediatric tumors. Furthermore, DICER1 protein and gene expression did not correlate with miR-103 e miR-107 expression. miR-107 was overexpressed in adult carcinomas compared to adenomas, but it was not a predictor of poor outcome. Regarding TARBP2 gene, its gene and protein expression did not correlate with histopathological and clinical parameters in both children and adults. No variant was identified in exon 5 TARBP2 gene. Additionally, miR-497 was not expressed neither in the normal adrenal cortex and in adrenocortical tumors. CONCLUSION: A weak DICER1 protein expression was significantly associated with poor outcome in adult adrenocortical carcinomas. However, DICER1 deregulation in adult ACCs was not caused by mutations within the RNase IIIb domain and not associated with expression of its regulatory miRNAs. Although miR-107 was overexpressed in adult adrenocortical carcinomas, its expression was not correlated with a reduced survival. Finally, TARBP2 gene and protein expression was not associated with poor outcome in adrenocortical tumors

Introdução: O câncer de próstata (CaP) é o tumor mais comum em homens e a segunda causa de óbito por câncer no Brasil. Com a adoção do rastreamento, a maioria dos pacientes apresenta doença localizada ao diagnóstico, enquanto apenas 4% têm doença metastática. Um dos principais mecanismos responsáveis pela progressão tumoral é a transição epitélio-mesenquimal (TEM). Esse é um programa celular reversível no qual a célula epitelial perde a capacidade de aderência intercelular e assume um fenótipo mesenquimal com potencial invasivo e metastático. A principal característica da TEM é a repressão da E-caderina através de fatores de transcrição que incluem ZEB1, ZEB2, Snail, Slug e Twist1. Os microRNAs também estão envolvidos na regulação do processo, sendo a família do miR-200 uma das mais importantes e uma potente indutora da diferenciação epitelial. Assim sendo, o conhecimento dos fatores envolvidos na TEM no CaP é fundamental para a compreensão do comportamento biológico dessa neoplasia. Objetivos: Analisar a expressão dos genes e microRNAs envolvidos na transição epitélio-mesenquimal em espécimes de câncer de próstata localizado e em linhagens celulares de câncer de próstata metastático. Além disso, correlacionar o perfil de expressão dos genes e microRNAs com parâmetros clínico-patológicos. Material e métodos: O estudo consistiu na análise de espécimes de 51 pacientes com CaP localizado tratados por prostatectomia radical e de linhagens celulares de CaP metastático (LNCaP, DU145 e PC3). O grupo controle foi composto por 10 casos de hiperplasia prostática benigna. A expressão dos genes E-caderina, N-caderina, Vimentina, TGF-beta1, ZEB1, ZEB2, Snail, Slug, Twist1 e PDGF-D e dos microRNAs 200a, 200b, 200c, 429, 141, 203, 205, 183, 373, 21, 9, 1, 495, 29b, 30a, 34a, 155 e 10b foi avaliada através da técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR) nos espécimes e nas linhagens. Para correlação com parâmetros clínico-patológicos, os pacientes foram divididos em grupos em relação ao escore de Gleason, estadiamento patológico, PSA pré-operatório, recorrência bioquímica e doença de baixo e alto risco. Para avaliação do tumor metastático, agrupamos as linhagens celulares e comparamo-las com tumores pT3. Resultados: A grande maioria dos casos apresentou superexpressão de E-caderina e Twist1 e subexpressão de N-caderina, Vimentina, TGF-beta1, ZEB1 e Slug. ZEB2, Snail e PDGF-D apresentaram expressão variável. A família do miR-200 e os miRNAs 203, 205, 183, 373 e 21 apresentaram superexpressão, enquanto que os miRNAs 9, 495, 29b e 1 apresentaram subexpressão. Os demais miRNAs apresentaram perfil de expressão variável. Níveis menores de expressão dos miRNAs 200b, 30a e 1 associaram-se significativamente com estadiamento patológico. Os pacientes com expressão reduzida do miR-200b também apresentaram associação com escore de Gleason >= 8 e com menor tempo de sobrevida livre de recorrência bioquímica. Ainda, níveis baixos do miR-30a e níveis elevados de Vimentina e Twist1 associaram-se com grupo de alto risco. As linhagens metastáticas apresentaram níveis de expressão do miR-183 e do Twist1 significativamente maiores quando comparadas ao tumor localizado. Conclusão: O CaP localizado mantém um fenótipo molecular epitelial. Menor expressão dos miRNAs 200b, 30a e 1 está associada com estadiamento mais avançado, sendo que o miR-200b também associou-se com maior escore de Gleason e menor tempo de sobrevida livre de recorrência bioquímica, e o miR-30a, com grupo de alto risco. A maior expressão de Vimentina e Twist1 apresentou associação com o grupo de alto risco. miR-183 e Twist1 apresentam maiores níveis de expressão em linhagens celulares metastáticas em relação ao tumor primário. De acordo com nossos resultados, os miRNAs 200b, 30a, 1 e 183 e os genes Twist1 e Vimentina podem ter um papel importante na progressão do CaP, além de serem potenciais marcadores prognósticos / Introduction: Prostate cancer (PCa) is the most common cancer in men and the second leading cause of cancer-related mortality in Brazil. After the adoption of screening, most patients present with localized disease at the time of diagnosis, while only 4% have metastatic disease. One of the main mechanisms of tumor progression is the epithelial-mesenchymal transition (EMT). This is a reversible cell-biological program in which an epithelial cell loses intercellular adhesion and acquires a mesenchymal phenotype with invasiveness and metastatic potential. The main event in EMT is the repression of E-cadherin by transcriptional factors, including ZEB1, ZEB2, Snail, Slug, and Twist1. microRNAs are also involved in the regulation of this process, and one of the most important ones is the miR-200 family, which is a powerful inducer of epithelial differentiation. Therefore, the knowledge of the factors involved in EMT in PCa is essential to understand the biological behavior of this neoplasia. Objectives: Analysis of gene and miRNA expression involved in epithelial-mesenchymal transition in specimens of localized prostate cancer and metastatic prostate cancer cell lines. Correlation between the gene and miRNA expression profiles and clinicopathological features. Material and Methods: This study consisted in the analysis of specimens from 51 patients with localized PCa treated by radical prostatectomy and of metastatic PCa cell lines (LNCaP, DU145, PC3). The control group was composed by 10 cases of benign prostatic hyperplasia. Gene expression of E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, TGF-beta1, ZEB1, ZEB2, Snail, Slug, Twist1, and PDGF-D as well as miRNA expression of 200a, 200b, 200c, 429, 141, 203, 205, 183, 373, 21, 9, 1, 495, 29b, 30a, 34a, 155, and 10b were assessed by Real-Time PCR (qRT-PCR). The patients were divided into groups according to Gleason score, pathological stage, preoperative PSA, biochemical recurrence, and low and high-risk disease. For evaluation of metastatic tumor, the cell lines were grouped and compared to pT3 tumors. Results: The vast majority of the cases showed overexpression of E-cadherin and Twist1 and underexpression of N-cadherin, Vimentin, TGF-beta1, ZEB1, and Slug. ZEB2, Snail, and PDGF-D showed a variable expression pattern. miRNA-200 family and miRNAs 203, 205, 183, 373, and 21 were overexpressed, while miRNAs 9, 495, 29b, and 1 were underexpressed. The remaining miRNAs showed a variable expression pattern. Lower expression levels of miRNAs 200b, 30a, and 1 were significantly associated with pathological stage. Patients with lower expression of miR-200b also showed association with Gleason score >= 8 and biochemical recurrence-free survival (BRFS). Furthermore, low expression levels of miR-30a and high expression levels of Vimentin and Twist1 were associated with high-risk group. The metastatic PCa cell lines showed significantly higher expression levels of miR-183 and Twist1 in comparison to the primary tumor. Conclusion: Localized prostate cancer maintains a molecular epithelial phenotype. Lower expression of miRNAs 200b, 30a, and 1 was associated with higher stage. Low levels of miR-200b were also associated with high Gleason score and shorter BRFS, and miR-30a, with high-risk group. High expression levels of Vimentin and Twist1 were associated with high-risk group. miR-183 and Twist1 levels were higher in metastatic cell lines than in the primary tumor. According to our results, miRNAs 200b, 30a, 1, and 183 and the genes Twist1 and Vimentin might play an important role in the progression of PCa and may turn to be important prognostic markers

O câncer de mama é a neoplasia com maior mortalidade entre as mulheres. O emprego de agentes alquilantes no tratamento desta neoplasia pode ocasionar o surgimento de instabilidades genômicas. Tais instabilidades podem estar associadas ao desenvolvimento de neoplasias secundárias como, por exemplo, leucemias. A presente tese avaliou a instabilidade de microssatélites em amostras de sangue, sedimento urinário e plasma de pacientes portadoras de carcinoma mamário ao diagnóstico, 3 e 6 meses após o início do tratamento quimioterápico. Também foi avaliada a concentração do DNA plasmático livre como possível marcador tumoral junto aos marcadores séricos CEA e CA15.3, empregados no acompanhamento do câncer de mama. Foram avaliadas as regiões de microssatélites: Tp53-ALU, Tp53.PCR15.1, BAT 40, BAT26, FMR2 e APC. Entre as 40 pacientes incluídas no presente estudo 88,57% apresentaram instabilidade de microssatélites na fração mononuclear do sangue periférico, 85,8% nas amostras de sedimento urinário e 62,5% no DNA plasmático livre. Não houve concordância significativa entre as instabilidades encontradas nos três tipos de amostra. A concentração de DNA plasmático livre das pacientes quando comparada às doadoras sadias apresentou correlação estatisticamente significativa (p>0,0001), e em paciente em regimes neoadjuvantes que responderam objetivamente à quimioterapia (p=0,02) e não houve correlação com os marcadores séricos CEA e CA15.3. / Breast cancer has the major mortality in women among all kind of cancer. The use of alkylating agents at the treatment of this disease is associated with genomic instability. This instability could be associated with the development of secondary cancer, for example, leukemia. The present thesis evaluated microsatellite instability in blood, pellet cells urinary and plasma in patients with breast cancer at diagnosis, 3 and 6 months after the beginning of chemotherapy. There were evaluated also Free Plasmatic DNA concentration as a possible tumoral marker with the serum markers CEA and CA15.3 used in breast cancer follow up. The microsatellites regions assayed were: Tp53-ALU,Tp53.PCR15.1, BAT 40, BAT26, FMR2 e APC. Among the 40 patients included at the present study 88,57% showed microsallite instability in peripheral mononuclear blood cells, 85,8% in urinary pellet cells samples and 62,5% in Free Plasmatic DNA. There werent statistical significant relationship for the instability found at the three kind of samples assayed. The Free Plasmatic DNA concentration of the patients when compared with healthy donors, showed a statistical significant relationship (p<0,0001). And among patients in neoadjuvant chemotherapy regime who reacted positively by treatment (p=0,02). And there werent statistical significant relationship between Free Plasmatic DNA and serum markers CEA and CA15.3.