Head and neck cancers are etiologically associated with smoking and alcohol consumption. Part of these tumors is induced by HPV and their incidence is increasing in the last decade. Patients with virally induced tumors have better prognosis even though they are usually diagnosed with tumors in advanced stage. One of the possible explanations may be better stimulation of the immune system by viral antigens. Macrophages are cells of the innate immune system which belong to professional phagocytes. They are called TAM upon infiltration to the tumor where they represent heterogeneous group of cells. Two main phenotypes are antitumor M1 and protumor M2 macrophages. TAMs are a major component of tumor microenvironment of many types of tumors, one of them are also head and neck cancers. In my thesis I focused on the immunohistochemical detection of M1 and M2 macrophages in the head and neck tumors of viral and non-viral etiology and at the same time RT-qPCR analyses of gene expression of macrophage-associated and/or immunosuppressive genes IDO1, ARG1, CD163, NOS2 a PTGS2 was performed. My data showed that HPV- negative tumors had higher number of M2 macrophages with typical markers CD163, ARG1 and PTGS2. It is known that patients with these tumors have worse prognosis of the disease. Due to high...

EINLEITUNG Das maligne Melanom stellt aufgrund seiner frühen Metastasierung und der Resistenz gegenüber den bisher bekannten Therapieansätzen eine der aggressivsten Tumorentitäten dar. Allerdings handelt es sich beim Melanom um einen antigenen und immunogenen Tumor. Dies schürt die Hoffnung, dass durch das bessere Verständnis der Mechanismen, die der Metastasierung, aber auch der Dysregulation des Immunsystems zugrunde liegen, Rückschlüsse auf neue Therapieansätze, beispielsweise unter Einbeziehung der Immunabwehr, gezogen werden können. Darüber hinaus würde die Entwicklung von Radiotracern, die eine frühzeitige Diagnose und möglicherweise auch die Auswahl von Patienten für eine personalisierte Tumortherapie ermöglichen, die Heilungschancen des malignen Melanoms wesentlich verbessern. Das Eph-Ephrin-System wiederum stellt ein vielfältiges Zellkommunikations-System dar, das sowohl in lebenswichtige als auch in pathologische Prozesse involviert ist. Beispielsweise nehmen Eph-Rezeptoren und Ephrine Einfluss auf die gerichtete Bewegung von neuronalen, endothelialen und inflammatorischen Zellen. Zudem beeinflussen sie die Bewegung von Tumorzellen und tragen so zur Tumorprogression bei. Ausgehend von diesem Hintergrund wurde die Hypothese formuliert, dass die Eph-Ephrin-vermittelte Interaktion von Melanomzellen und Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms beeinflusst. Im Speziellen sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert. Darüber hinaus sollte getestet werden, ob der Rezeptor EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, aber über eine mutierte und damit funktionsunfähige Kinasedomäne verfügt, eine regulative Rolle übernimmt und antitumorigen wirkt. Aufbauend auf den Erkenntnissen zur Bedeutung von EphB4, EphB6 und EphrinB2 beim malignen Melanom sollten zudem verschiedene Ansätze zur Bildgebung der oben genannten Eph-Rezeptoren und Ephrine mittels PET etabliert und geprüft werden. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass die Membranproteine EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei den ausgewählten humanen Melanomzellen und den inflammatorischen Zellen exprimiert werden und somit potentielle Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen darstellen. Infolge der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen, die als Modell für Tumor-assoziierte Makrophagen dienten, kam es zu einer verminderten Adhäsion und/oder Migration der Melanomzellen sowie im Falle der A375- und A2058-Melanomzellen zu einer verstärkten Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-6. Aufgrund der breiten Wirkung von IL-6 ergeben sich daraus vielfältige Einflussmöglichkeiten auf das Tumormikromilieu. Diese wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht näher charakterisiert, da erste Ergebnisse eine Beteiligung des Eph-Ephrin-Systems ausschlossen. Während die Überexpression von EphB6 keinen Einfluss auf die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften der A375-Melanomzellen hatte, führte die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 zu einer verminderten Migration der Zellen im intakten Zellverband. Des Weiteren bewirkte EphB4 eine verstärkte Adhäsion der A375-Zellen an das Extrazellularmatrix-Protein Fibronektin, wodurch die Migration dieser Melanomzellen, im Sinne einer Metastasierung, zusätzlich beeinträchtigt wird. Die erhöhte mRNA-Expression des Liganden EphrinB2 in den A375-Melanomzellen führte zu einer verminderten chemotaktischen Migration der Zellen. Um den Einfluss von EphB4 auf die Tumorprogression und Tumorangiogenese beim malignen Melanom in vivo untersuchen zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein murines Xenograft-Modell mit subkutanen A375 pIRES- bzw. A375 EphB4-Tumoren etabliert. Die Auswertung der Tumorvolumina sowie der [18F]FDG-, [18F]FMISO- und Hoechst 33342-Anreicherung in den Tumoren ergab, dass die erhöhte EphB4-Proteinbiosynthese zu tendenziell kleineren Tumoren führte. Diese waren zudem signifikant schwächer perfundiert und wiesen im Inneren größere hypoxische Areale auf als die A375 pIRES-Tumoren. Somit zeigte EphB4 neben seiner antimetastasischen Wirkung in vitro auch eine antitumorigene Wirkung in vivo, wobei letztere möglicherweise auf eine Störung der Gefäßbildung zurückzuführen ist. Da eine adäquate Blutversorgung der Tumoren für die Metastasierung von Tumorzellen von Bedeutung ist, könnte dies auch auf eine antimetastatische Wirkung in vivo hinweisen. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuer, 18F-markierter EphB4 Kinaseinhibitor (Verbindung [18F]2) getestet. Dieser zeigte im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell eine geringe Tumoranreicherung, die von der EphB4-Proteinbiosynthese in den Tumoren unabhängig war. Darüber hinaus kam es zur schnellen hepatobiliären Ausscheidung von Verbindung [18F]2, was deren radiopharmazeutischer Anwendung im Wege steht. SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK Insbesondere die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 hatte im Falle der untersuchten A375-Melanomzellen zu einer verminderten Migration und zu einer erhöhten Adhäsion der Zellen geführt. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass EphB4 die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften dieser Zellen in vitro beeinträchtigt. Darüber hinaus deuteten Untersuchungen am A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell auf eine antitumorigene Wirkung des EphB4-Rezeptors in vivo hin. Aufgrund dessen muss der anfänglich formulierten Hypothese, dass EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert, widersprochen werden. Eine regulative Beteiligung des Kinase-defizienten Rezeptors EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht sicher nachgewiesen werden. Allerdings ergeben sich aufgrund der Expression der Rezeptoren EphB4 und EphB6 sowie deren Ligand EphrinB2 sowohl auf den untersuchten Melanomzellen als auch auf den verschiedenen Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen interessante Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen. Deren Einfluss auf die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Das im Rahmen der vorliegenden Arbeit etablierte A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell ermöglicht die In vivo-Charakterisierung von Radiotracer, die gegen Rezeptor-Tyrosinkinasen im Allgemeinen oder aber selektiv gegen EphB4 gerichtet sind. Da Verbindung [18F]2 eine ungünstige Pharmakokinetik zeigte, was wahrscheinlich auf die hohe Lipophilie des Radiotracers zurückzuführen ist, sollten sich zukünftige Untersuchungen mit der chemischen Modifikation dieser Verbindung beschäftigen, mit dem Ziel die Lipophilie und damit die biologische Halbwertszeit des Radiotracers zu verbessern. Zusätzlich sollte die Entwicklung von Radiotracern auf der Basis von löslichen Eph-Rezeptoren und Ephrinen (sEph bzw. sEphrin) weiter vorangetrieben werden.:1 EINLEITUNG 1.1 Die Bedeutung des Tumor-Mikromilieus bei der Entstehung des malignen Melanoms 1.2 Die Metastasierung des malignen Melanoms als limitierender Einflussfaktor auf die Tumortherapie 1.3 Die Rolle des Eph-Ephrin-Systems bei der Tumorprogression und Metastasierung 1.4 Zielstellung 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material 2.1.1 Eukaryotische Zellen 2.1.2 Prokaryotische Zellen 2.1.3 Versuchstiere 2.1.4 Plasmide 2.1.5 Kits 2.1.6 Antikörper 2.1.7 Verbrauchsmaterialien 2.1.8 Chemikalien, Medien und Enzyme 2.1.9 Puffer und Lösungen 2.1.10 Geräte 2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 RNA-Isolierung aus Zellen 2.2.2 DNase-Behandlung 2.2.3 Quantitative Echtzeit RT-PCR (qRT-PCR) 2.2.4 Klonierung von humanem EphB4, EphB6 und EphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pIRES2-AcGFP1 2.2.4.1 Prinzip 2.2.4.2 Restriktionshydrolyse 2.2.4.3 Dephosphorylierung und Glättung der cDNA mittels Alkalischer Phosphatase und Klenow-Fragment 2.2.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 2.2.4.5 Gelextraktion 2.2.4.6 Ligation 2.2.4.7 Herstellung Transformations-kompetenter E. coli 2.2.4.8 Transformation kompetenter E. coli 2.2.4.9 Plasmid-Isolierung 2.2.5 Klonierung von humanem sEphB4, sEphB6 und sEphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pSecTag2B 2.2.5.1 Prinzip 2.2.5.2 PCR zur Gewinnung der cDNA für sEphrinB2, sEphB4 und sEphB6 2.2.5.3 Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion 2.2.5.4 TOPO-TA-Klonierung, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.2.5.5 Restriktionshydrolyse, Ligation, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.3 Zellbiologische Methoden 2.3.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 2.3.2 Kontrolle von Zellkulturen auf Mykoplasmen-Kontamination 2.3.3 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen 2.3.4 Transfektion und Antibiotikaselektion von COS-7-Zellen 2.3.5 Transfektion und Antibiotika-Selektion von A375-Zellen 2.3.6 Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse und -sortierung (FACS) von transfizierten A375-Zellen 2.3.7 Fluoreszenzmikroskopie von transfizierten A375-Zellen 2.3.8 Bestimmung der Zellproliferation und Zellvitalität mittels Wachstumskurve 2.3.9 Differenzierung humaner THP-1-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen Zellen (THP-1(M)) 2.3.10 Differenzierung humaner HL-60-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen (HL-60(M)) und Granulozyten-artigen (HL-60(G)) Zellen 2.3.11 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) und anschließende Trennung mittels Magnet-aktivierter Zell Separierung (MACS) 2.3.12 Adhäsionsassay 2.3.12.1 Adhäsion an Fibronektin 2.3.12.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 2.3.13 Migrationsassay 2.3.13.1 Boyden-Kammer-Assay 2.3.13.2 Wundheilungsassay 2.4 Proteinbiochemische Methoden 2.4.1 Proteinisolierung aus Zellkulturen 2.4.2 Proteinisolierung aus Gewebeproben 2.4.3 Proteinbestimmung 2.4.4 SDS-PAGE 2.4.5 Western Blotting und Immundetektion 2.4.6 Enzym-gekoppelter Immunadsorptionsassay (ELISA) 2.4.6.1 IL-6-ELISA 2.4.6.2 pEphB4-ELISA 2.4.7 Gewinnung und Reinigung der rekombinanten, löslichen Eph Rezeptoren sEphB4 und sEphB6 2.4.7.1 Gewinnung von COS-7-Zellkulturüberständen 2.4.7.2 Reinigung von sEphB4 und sEphB6 aus den COS-7-Zellkulturüberständen mittels Ni2+-Affinitätschromatographie 2.4.7.3 Regeneration der Ni2+-NTA-Agarose 2.4.7.4 Entfernung von Salzen und Imidazol mittels Schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) 2.4.7.5 Entfernung von Salzen und Imidazol mit Hilfe von Zentrifugalkonzentratoren 2.4.7.6 Gefriertrocknung 2.5 Tierexperimentelle Arbeiten 2.5.1 Etablierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 2.5.2 Fluoreszenz-Bildgebung 2.5.3 Magnet-Resonanz-Tomographie 2.5.4 Untersuchung der Tumorperfusion mittels Hoechst 33342 2.6 Radiochemische und Radiopharmakologische Methoden 2.6.1 Darstellung und Radiomarkierung von EphB4-Kinaseinhibitoren 2.6.2 Untersuchung des Einflusses der Verbindungen 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität mittels MTT-Test 2.6.3 Untersuchung der zellulären Bindung und Aufnahme der Verbindung [18F]2 2.6.4 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 2.6.5 Bioverteilung 2.6.6 Metabolitenanalyse 2.6.7 Autoradiographie 2.7 Histologische Methoden 2.7.1 Anfertigung von Gefrierschnitten 2.7.2 Nachweis von Hoechst 33342 in Gefrierschnitten 2.7.3 Anfertigung von Paraffinschnitten 2.7.4 Nachweis von EphB4 in Paraffinschnitten 2.8 Statistische Auswertung 3 ERGEBNISSE 3.1 Genexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.2 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.3 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) 3.3.1 Etablierung eines Kokultur-Modells mit anschließender Trennung der humanen Melanomzellen von den HL 60(M)-Zellen 3.3.2 Einfluss der Kokultur auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der humanen Melanomzellen 3.3.2.1 Adhäsionsassay 3.3.2.2 Migrationsassay 3.3.3 Einfluss der Kokultur auf die Sekretion von Interleukin-6 durch die humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.4 Überexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei A375 Melanomzellen 3.4.1 Fluoreszenzmikroskopie und FACS 3.4.2 mRNA-Expression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.3 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.4 Proliferationsverhalten 3.5 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten von A375-Melanomzellen 3.5.1 Einfluss auf die Adhäsion 3.5.1.1 Adhäsion an Fibronektin 3.5.1.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 3.5.2 Einfluss auf die Migration 3.5.2.1 Boyden-Kammer-Assay 3.5.2.2 Wundheilungsassay 3.5.3 Einfluss der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der A375-Melanomzellen 3.6 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das inflammatorische Potential von A375-Melanomzellen und HL 60(M)-Zellen 3.7 Charakterisierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 3.7.1 Charakterisierung des Tumorwachstums 3.7.2 Nachweis der EphB4-Proteinbiosynthese 3.7.3 Charakterisierung des Tumormetabolismus und der Tumorperfusion mit [18F]FDG 3.7.4 Charakterisierung der Tumorperfusion mit Hoechst 33342 3.7.5 Charakterisierung der CD31-Proteinbiosynthese 3.7.6 Charakterisierung hypoxischer Areale mit [18F]FMISO 3.8 Charakterisierung eines neuen, 18F-radiomarkierten EphB4-Kinaseinhibitors als Radiotracer zur Bildgebung von EphB4 mittels Kleintier-PET 3.8.1 Einfluss von Verbindung 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität 3.8.2 Einfluss von Verbindung 2 auf die EphB4-Phosphorylierung 3.8.3 Charakterisierung der Zellaufnahme von Verbindung [18F]2 3.8.4 Charakterisierung des In-vivo-Metabolismus von Verbindung [18F]2 im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell 3.8.4.1 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 3.8.4.2 Autoradiographie 3.8.4.3 Bioverteilung 3.8.4.4 Metabolitenanalyse 3.9 Reinigung und Charakterisierung rekombinanter, löslicher Eph-Rezeptoren 3.9.1 Proteinbiosynthese und Sekretion von sEphB4 und sEphB6 3.9.2 Reinigung von rekombinantem sEphB4 und sEphB6 aus COS-7-Zellkulturüberständen 4 DISKUSSION 4.1 Therapiemöglichkeiten und Bedeutung von Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen beim malignen Melanom 4.2 Vorkommen von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Melanomzellen und inflammatorischen Zellen 4.3 Einfluss der Kokultur von Melanomzellen mit HL-60(M) auf die metastatischen und inflammatorischen Eigenschaften der Zellen 4.4 Einfluss von EphB4 auf das Wachstum und die Vaskularisierung von A375-Tumoren in vivo 4.5 Kinaseinhibitoren als potentielle Radiotracer für die In vivo-Bildgebung von Eph-Rezeptoren 4.6 Entwicklung löslicher Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden als Grundlage für die In vivo-Bildgebung des Eph-Ephrin-Systems 5 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 DANKSAGUNG 9 VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONFERENZBEITRÄGE

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Einleitung: Ziel dieser Arbeit war es, das RENCA-Nierenzell-Karzinommodell anhand der Hypoxie-induzierten Nekrosen, der Makrophageninfitration sowie der iNOS-Expression und –aktivität zu charakterisieren. Methoden: Für die Erzeugung lokaler Tumoren, wurden Balb/c-Mäusen in vitro kultivierte RENCA-Zellen subkutan appliziert. Die Quantifizierung des Makrophageninfiltrates sowie die Charakterisierung der Hypoxie im Tumorgewebe erfolgten mittels immunhistochemischer Färbungen. Für die Darstellung der Stickstoffmonoxid-Aktivität kamen neben der Immunhistochemie die Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Anwendung. Der Nitrit-Gehalt der Tumorproben wurde mittels Griess-Reaktion bestimmt. Ergebnisse: Spontan hypoxische Tumornekrosen sind assoziiert mit einer signifikant geringeren Gefäßdichte. Das Ausmaß der Nekrosen korreliert mit dem Alter der Tumoren. Alte Tumoren (28 Tage) zeigen eine höhere Makrophageninfiltration als junge Tumoren (12 bis 19 Tage). Obwohl die iNOS-Expression auf Proteinebene keinen signifikanten Unterschied zwischen alten und jungen Tumoren ergab, findet sich auf mRNA-Ebene eine signifikant erhöhte iNOS-Expression in alten Tumoren. Hinsichtlich der αActinin-4-Expression konnte kein signifikanter Unterschied gesehen werden. Schlussfolgerung: Bei annähernd gleicher iNOS- und αActinin-4-Expression beziehungsweise erhöhter iNOS-mRNA-Expression ist die Konzentration an Nitrit in Tumoren mit hypoxischer Nekrose reduziert. Daraus kann man schließen, dass die Aktivität der NO-Synthase unter hypoxischen Bedingungen reduziert ist. Dies stützt wiederum die Vermutung, einer die iNOS-Aktivität steuernden normoxie-abhängigen Assoziation von αActinin-4 und iNOS. Die Aktivitätsinhibierung der iNOS könnte somit ein Mechanismus sein, durch den Hypoxie die Zytotoxizität von TAM inhibiert. Die abnehmende Gefäßdichte mit zunehmendem Tumoralter könnte möglicherweise auf eine Regression der Tumorgefäße zurückzuführen sein. Denkbar wäre, dass die Gefäßregression durch makrophagenabhängige Zytokine begünstigt wird.

Apoptosis-induced proliferation (AiP) is a compensatory mechanism to maintain tissue size and morphology following unexpected cell loss during normal development, and may also be a contributing factor to cancer growth and drug resistance. In apoptotic cells, caspase-initiated signaling cascades lead to the downstream production of mitogenic factors and the proliferation of neighboring surviving cells. In epithelial Drosophila tissues, the Caspase-9 homolog Dronc drives AiP via activation of Jun N-terminal kinase (JNK); however, the specific mechanisms of JNK activation remain unknown. Using a model of sustained AiP that produces a hyperplastic phenotype in Drosophila eye and head tissue, I have found that caspase-induced activation of JNK during AiP depends on extracellular reactive oxygen species (ROS) generated by the NADPH oxidase Duox. I found these ROS are produced early in the death-regeneration process by undifferentiated epithelial cells that have initiated the apoptotic cascade. I also found that reduction of these ROS by mis-expression of extracellular catalases was sufficient to reduce the frequency of overgrowth associated with our model of AiP. I further observed that extracellular ROS attract and activate Drosophila macrophages (hemocytes), which may in turn trigger JNK activity in epithelial cells by signaling through the TNF receptor Grindelwald. We propose that signaling back and forth between epithelial cells and hemocytes by extracellular ROS and Grindelwald drives compensatory proliferation within the epithelium, and that in cases of persistent signaling, such as in our sustained model of AiP, hemocytes play a tumor promoting role, driving overgrowth.