CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / In search for a better understanding of the biology of tumors, molecular markers related to proliferation, resistance and apoptosis have been intensively studied in the different types of cancer. These markers can help on the elucidation of more specific therapeutic targets for the treatment of various tumors. It was observed that stomach cancer is the second most frequent cause of death in the world. In Brazil, this tumor is among the five major causes of death by cancer and the adenocarcinomas are held responsible for about 95% of all cases. For that matter, the expression of KI-67, PCNA, p53, bcl-2 and c-myc were evaluated independently and in a combined form in stomach adenocarcinomas. Thus, KI-67 and PCNA were confronted in order to determine which one would pose as a better cellular proliferation marker. Finally, a DNA extraction tecnique using CTAB was implemented on tumor tissue as well as the molecular analysis of the p53 gene by SSCP. The positive results were compared with those obtained by the imonohistochemistry analysis. The tumors were collected in surgical procedure, processed and classified histopathologically. The markers were detected by the imunohistochemical method SABP. The DNA was extracted by the CTAB method and the exons 5, 7 and 8/9 of the p53 gene analyzed by SABP. Some of the samples were obtained from biopsy arquives. The age range of the patients was between 61 and 70 years, with 48,1% of the tumors presenting an intestinal origin, 40,7% were diffuse and the other 11,2% were mixed. According to the location, 50% of the tumors were found to be proximal. 41,1% of the tumors were found to be in a low stage (I â IIIA), 44,8% in a high stage (IIIB â IV) and 13,8% were not staged. The imunohistochemical results indicated that KI-67 is the best marker to estimate cellular proliferation in stomach adenocarcinomas. In an independent manner, the tumors showed an 89,3% positivity for KI-67, 62,5% for PCNA, 50% for p53, 60,7% for bcl-2 e 66,7% for c-myc. According to the staging, the difference was significant only to p53 (p = 0,02), with a 66,7% positivity to the tumors in low stage and 16,7% for the ones on a high stage. When evaluated in a combined form, the associations of KI-67+/p53- (p=0,012) (66,67%) and c-myc+/p53- (p=0,02) (63,64%) both for the high stage tumors, were found to be significant. The DNA extraction technique applied to the tumor tissue was found to be satisfactory. For the SSCP analyses, five patients had mutation on the exon 5 (3) and on the exon 7 (2). Based on that, we may conclude that KI-67 is the best marker to access the proliferation of the stomach adenocarcinomas and that there are two proliferation activation pathways: one being dependent and the other independent of the p53 gene. / Na busca de um melhor entendimento da biologia dos tumores, marcadores moleculares relacionados à proliferaÃÃo, resistÃncia e apoptose tÃm sido intensamente pesquisados nos diferentes tipos de cÃncer. Estes marcadores podem auxiliar no estudo de alvos terapÃuticos mais especÃficos para cada tipo de tumor. O cÃncer de estÃmago à a segunda causa de Ãbito mais observado no mundo. No Brasil, este tumor està entre as cinco localizaÃÃes primÃrias mais comuns de Ãbitos por cÃncer, sendo os adenocarcinomas responsÃveis por 95% dos casos. Dessa forma, foi avaliada a expressÃo dos marcadores KI-67, PCNA, p53, bcl-2 e c-myc de forma independente e combinada em adenocarcinomas gÃstricos. TambÃm foi avaliado qual dos marcadores, KI-67 ou PCNA, era mais indicado para acessar a proliferaÃÃo celular. AlÃm disso, foi implantada a tÃcnica de extraÃÃo de DNA de tecido tumoral com CTAB e anÃlise molecular pelo SSCP do gene p53, sendo os resultados positivos comparados com os resultados da imunohistoquÃmica. Os tumores foram coletados em cirurgia, processados e classificados histopatologicamente. Os marcadores foram detectados pelo mÃtodo de imunohistoquÃmica SABP. Foi realizada a extraÃÃo de DNA pelo mÃtodo do CTAB, sendo os Ãxons 5, 7 e 8/9 do gene p53 analisados por SSCP. Algumas amostras foram obtidas de arquivo de biopsia. A faixa etÃria dos pacientes encontrava-se entre 61 e 70 anos de idade, com 48,1% dos tumores do tipo intestinal, 40,7% difusos e 11,2% mistos e com 50% localizados no sÃtio proximal. Em relaÃÃo ao estadiamento, 41,4% dos tumores apresentavam-se no grau baixo (I â IIIA), 44,8% no altorisco (IIIB â IV) e 13,8% sem estadiamento. De acordo com os achados imunohistoquÃmicos, os resultados sugerem que o marcador mais indicado para estimar a proliferaÃÃo celular nos adenocarcinomas gÃstricos à o KI-67. De forma independente os tumores apresentaram positividade em 89,3% para KI-67, 62,5% para PCNA, 50% para p53, 60,7% para bcl-2 e 66,7% e para c-myc. De acordo com o estadiamento, a diferenÃa foi significativa apenas para p53 (p = 0,02), com positividade de 66,7% nos tumores de baixo risco (I â IIIA) e 16,7% nos de altorisco. Quando avaliadas de forma combinada, as associaÃÃes significativas foram entre KI-67+/p53- (p=0,012) nos tumores de alto risco (66,67%) e c-myc+/p53- (p=0,02) tambÃm nos tumores de altorisco (63,64%). A tÃcnica aplicada para a extraÃÃo do DNA do tecido tumoral foi satisfatÃria. Para o SSCP, cinco pacientes apresentaram mutaÃÃo para o Ãxon 5 (3) e Ãxon 7 (2). Com isso, concluÃmos que o marcador mais indicado para acessar a proliferaÃÃo à o KI-67 e que existem duas vias de ativaÃÃo da proliferaÃÃo nos adenocarcinomas gÃstricos: uma dependente de p53 e outra independente de p53.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The Epstein-Barr virus (EBV) has been related to the tumorigenesis of the gastric carcinomas, varying from 1.3-19.3% according to the studied population. Several studies have demonstrated strong evidences of its relation in this process, such as the monoclonality of the viral genome and its the presence in almost all tumor cells. However, most of the mechanisms used by the virus to control this process are still unknown. In this context, the present study aimed to investigate the frequency of the EBV and the association with the BCL-2, BAX and c-MYC proteins. Therefore, 100 cases of gastric carcinoma (67 males and 33 females), obtained from two hospitals in Fortaleza, were assessed to detect the EBV by PCR and in situ hybridization (aimed to the EBER1 transcript) using the standard method and GenPointÂ. Immunohistochemistry technique was done to evaluate the expression of the referred cellular proteins, by streptavidin-biotin-peroxidase method. The distribution by sex, age, tumor anatomic site and the histopathologic analysis, in general, reproduced the pattern of the world scientific bibliographies. Regarding virus detection by in situ hybridization, 8 (8%) cases were positive, 6 of these had shown diffuse pattern of staining, and 2 had demonstrated focal pattern. From 100 cases, only 2 presented infected lymphocytes. In general, the EBV demonstrated higher association with: males (87.5%[p=0.265]), tumors situated in the cardia (37.5% [p=0.549]), advanced stage (IIIB and IV), intestinal type (87.5%[p=0.136]), and moderately differentiated (75%).There were no EBV-positive cases which exhibited BCL-2 staining. Although the BAX and the c-MYC (nuclear) proteins have demonstrated significant positivity index and scores averages in the EBV-positive group, these were lower than the values of the EBV-negative group, notably the c-MYC nuclear protein (Mann-Withney test LI p=0.039 and HS p=0.045). The cytoplasmic staining of the c-MYC protein revealed slightly higher staining values in the EBV-positive group. The balance between the BCL-2 and BAX proteins demonstrated that the majority of the evaluated cases had exhibited apoptosis-orientation, however 62.3% of the EBV-positive cases exhibited equilibrium between these proteins. Twenty-nine cases (28 negative and 1 positive) were submitted to the biotinyl tyramide system (in situ hybridization method - GenPointÂ), demonstrating the same results obtained by the standard technique. From the 61 cases assessed by PCR, 35 (57.4%) were positive, being verified a low concordance index (kappa = -0.026 [Â0.069]) with the standard in situ hybridization technique. The 30bp deletion of LMP1 gene was investigated in 24 out of 35 positive cases, being verified in 37.5% of these. The results obtained in the present study, concerning the EBV frequency and the correlation with clinic-histopathologic data, reproduced findings of researches done in several world regions. The correlation with the proteins suggests that in vivo the virus is not related to the overexpression of BCL-2 and c-MYC (nuclear) that could act in synergism to promote the tumor development. The suppression of the BAX expression might represent a viral mechanism for apoptosis inhibition. The results of the cytoplasmic c-MYC point to a possible involvement of the EBV with transport mechanisms of the nuclear membrane, resulting in its accumulation in the cytoplasm. The low frequency of infected lymphocytes indicates that they are not the main responsible of the high number of positivity in the PCR technique. It could be, at least in part, due to the infected normal and/or pre-neoplastic epithelium, suggesting a new latency pattern which not express the EBER1. / O vÃrus Epstein-Barr (EBV) tem sido associado com a tumorigÃnese dos adenocarcinomas gÃstricos, variando entre 1,3-19,3% de acordo com a populaÃÃo estudada. Diversos estudos tÃm demonstrado importantes evidÃncias do envolvimento do EBV nesse processo, tais como a monoclonalidade do genoma viral e a presenÃa do vÃrus em quase todas as cÃlulas tumorais do sitio primÃrio e em cÃlulas metastÃticas. No entanto, os mecanismos utilizados pelo vÃrus para orquestrar a transformaÃÃo tumoral, ainda nÃo foram totalmente elucidados. Neste contexto, o presente estudo objetivou investigar a freqÃÃncia do EBV e a associaÃÃo com as proteÃnas BCL-2, BAX e c-MYC. Para tanto, 100 casos de adenocarcinomas gÃstricos (67 homens e 33 mulheres), obtidos de dois hospitais de Fortaleza, foram analisados quanto à presenÃa do EBV, detectado atravÃs das tÃcnicas de PCR e de hibridaÃÃo in situ (direcionada ao transcrito viral EBER1) pelo mÃtodo usual e GenPointÂ. Procedeu-se tambÃm, estudo imuno-histoquÃmico das referidas proteÃnas celulares, atravÃs do mÃtodo da estreptoavidina-biotina-peroxidase. A distribuiÃÃo por sexo, idade, sÃtio anatÃmico do tumor e as anÃlises histopatolÃgicas, de modo geral, reproduziram as tendÃncias da literatura mundial. Pela tÃcnica de hibridaÃÃo in situ, 8 (8%) casos foram positivos, 6 destes apresentaram marcaÃÃo difusa e 2 apresentaram marcaÃÃo focal. Apenas 2 apresentaram linfÃcitos infectados. De modo geral, o EBV apresentou maior associaÃÃo com o sexo masculino (87,5% [p=0,265]), com tumores situados na cÃrdia (37,5% [p=0,549]), de estadiamento avanÃado (IIIB e IV), do tipo intestinal (87,5% [p=0,136]) e moderadamente diferenciados (75%). Nenhum dos casos EBV-positivos exibiram marcaÃÃo para BCL-2. Embora as proteÃnas BAX e c-MYC (nuclear) apresentaram Ãndices de positividade e mÃdias de escores significativos no grupo EBV-positivo, estes foram inferiores aos valores do grupo EBV-negativo, sobretudo a proteÃna c-MYC nuclear (Teste de Mann-Withney LI p=0,039 e HS p=0,045). A marcaÃÃo citoplasmÃtica da proteÃna c-MYC revelou valores de marcaÃÃo discretamente superiores no grupo EBV-positivo. O balanÃo entre as proteÃnas BCL-2 e BAX demonstrou que a maioria dos casos estudados apresentavam tendÃncia à apoptose, mas 62,5% dos casos EBV-positivos exibiram um equilÃbrio. Vinte e nove casos (28 negativos e 1 positivo) foram submetidos a outro mÃtodo de hibridaÃÃo in situ que emprega o sistema da biotinil-tiramida (GenPointÂ),demonstrando resultados idÃnticos aos obtidos pela tÃcnica convencional. De 61 casos analisados atravÃs da tÃcnica de PCR, 35 (57,4%) foram positivos, sendo constatado um baixÃssimo Ãndice de concordÃncia (kappa = -0,026 [Â0,069]) com a tÃcnica de hibridaÃÃo in situ. Em 24/35 casos positivos, a deleÃÃo de 30pb do gene LMP1 foi investigada, sendo constatada em 37,5% destes. Os resultados obtidos no presente estudo quanto à freqÃÃncia do EBV e a correlaÃÃo com critÃrios clÃnico-histopatolÃgicos, reproduziram os achados de estudos realizados em diversas partes do mundo. A correlaÃÃo com as proteÃnas sugere que in vivo, o vÃrus nÃo esteja relacionado com a expressÃo de BCL-2 e de c-MYC (nuclear), que poderiam atuar em sinergismo favorecendo o desenvolvimento tumoral. A supressÃo da expressÃo de BAX, pode representar um mecanismo viral para inibiÃÃo da apoptose. Os resultados da c-MYC citoplasmÃtica apontam para um possÃvel envolvimento do EBV com mecanismos de transporte da membrana nuclear, determinando o acÃmulo da proteÃna no citoplasma. A baixa freqÃÃncia de linfÃcitos infectados indica que os mesmos nÃo sÃo os principais responsÃveis pela elevada positividade da tÃcnica de PCR, devendo ser ao menos em parte, decorrente de epitÃlio normal e/ou prÃ-neoplÃsico infectado sugerindo um padrÃo de latÃncia que nÃo expresse EBER1.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The present study aimed to evaluate the expression of genes involved in the tumorigenic process and in the chemoresistance mechanisms of the astrocytic tumors. A clinical and epidemiological analysis, histopathological evaluation and immunohistochemical study of the proteins Ki-67, c-Myc, GFAP, p53, p21WAF1/CIP1, p27KIP1, Bcl-2, Bax, EGFR, erbB-2, p21Ras, MGMT, GSTπ, TS and TopoIIα using streptoavidin-biotin-peroxidase method were performed in 55 different graduations of astrocytomas (WHO) (13 grade I, 14 grade II, 7 grade III, 21 grade IV) and 05 samples of non-tumoral tissue (control group). The distribution by age, sex and tumoral localization of astrocytomas patients in Fortaleza reproduced, in a general way, the worldwide trends. The histopathological findings evaluated with semiquantitative criteria confirmed the classification parameters for astrocytomas established by WHO. The stain for Ki-67 antigen increased as according to astrocytic tumors progression; its detection in more than 8.0% of the tumoral cells distinguished Astrocytomas Grade IV, labeled index between 1.5 and 8.0% differentiated Astrocytomas Grade III and values below 1.5% discriminated low-grade tumors (I and II). The TopoIIα and c-Myc (nuclear) expression demonstrated association with cellular proliferation in astrocytomas, however not in a exclusive way. The c-Myc protein cytoplasmic positive index was bigger among high-grade tumors (71.43%), with maximum expression scores in Astrocytomas Grade IV (LI mean=15.57; H mean=24.42). In general, 76.9% of the Astrocytomas Grade IV tumoral cells revealed moderate positive index for GFAP. The positive index and expression scores for p53 and p27KIP1 (nuclear and cytoplasmic) proteins showed a tendency to increase with the astrocytic tumors progression, while the p21WAF1/CIP1 tumor suppressor detection demonstrated opposite orientation (except in grade IV). The percentage of Bcl-2 and Bax positive tumors increased in accordance with histological grade of astrocytomas, with general positive index of 43.26% and 24.67%, respectively. Bcl-2 staining scores demonstrated propensity to addition according to tumoral evolution, while the scores for Bax was similar in all graduations. The erbB2 protein expression was evidenced only between Astrocytomas Grade IV (positive index=14.28%), while the overexpression of EGFR protein was distinguished in grade I and IV astrocytic tumors, with respectively 46.15% and 61.90% of positive cases. p21Ras protein detection was preponderant in Astrocytomas Grade II (positive index=37.71%), being absent in high-grade tumors (III and IV). The EGFR overexpression and p53 mutation configured mutually exclusive events in astrocytomas tumorigenesis, as well as p21Ras protein and ErbB receptors family overexpression. High positive index for enzymes MGMT, GSTπ and TS was evidenced in astrocytic tumors. MGMT expression scores were high and constant among different histological categories, including non-tumoral specimens (LI mean = 69.43). GSTπ scores demonstrated tendency to reduction in accordance with malignant evolution of astrocytomas, while the values for TS reached higher levels on Astrocytomas Grade IV (H mean=63.33). TopoIIα positive index demonstrated inclination to augment in agreement with the progression of astrocytic tumors, whereas the staining scores had been similar in grade II, III and IV astrocytomas (LI mean=27.71). The results obtained by current investigation indicated Ki-67 antigen as the best cell proliferation marker. The p53 mutation configured an initial and relevant event in astrocytomas, as well as potential indicative of tumor progression. p21WAF1/CIP1 tumor suppressor detection represented important resource for deduction of functional situation of p53 gene, while the p27KIP1 functional activation was not compromised by astrocytomas tumorigenic process. Astrocitomas Bcl-2/Bax ratio denoted increasing of cellular survival orientation in accordance with malignant evolution of these tumors. p21Ras protein overexpression was distinguished as a grade II typical molecular event and a virtual marker of tumor not-progression. c-Myc protein cytoplasmic accumulation configured initial and significant phenomenon in astrocytomas tumorigenesis, being a direct reflex of the nuclear expression of c-myc gene and the tumoral malignance. The combined analysis of the investigated molecular markers confirmed p53 gene mutation as the main tumorigenic pathway of astrocytomas, even though EGFR overexpression has been the predominant alteration in grade IV tumors and the c-myc gene expression has represented a distinct and alternative molecular pathway to different tumor graduations. The remarkable presence of MGMT, GSTπ and TS enzymes configured virtual indication of chemoresistance for many antineoplastic agents, while the high expression of TopoIIα revealed this enzyme as a potential therapeutic target in the astrocytic tumors. / O presente estudo objetivou avaliar a expressÃo de genes envolvidos no processo tumorigÃnico e nos mecanismos de quimiorresistÃncia dos tumores astrocÃticos. Procedeu-se anÃlise clÃnico-epidemiolÃgica, avaliaÃÃo histopatolÃgica e estudo imuno-histoquÃmico das proteÃnas Ki-67, c-Myc, GFAP, p53, p21WAF1/CIP1, p27KIP1, Bcl-2, Bax, EGFR, erbB-2, p21Ras, MGMT, GSTπ, TS e TopoIIα pelo mÃtodo da estreptoavidina-biotina-peroxidase em 55 astrocitomas de diferentes gradaÃÃes (OMS) (13 grau I, 14 grau II, 7 grau III e 21 grau IV) e 05 amostras de tecido cerebral nÃo-tumoral (grupo controle). A distribuiÃÃo por idade, por sexo e pela localizaÃÃo tumoral dos portadores dessas neoplasias reproduziu, de um modo geral, as tendÃncias mundiais. Os achados histopatolÃgicos avaliados segundo critÃrios semiquantitativos confirmaram os parÃmetros de classificaÃÃo dos astrocitomas estabelecidos pela OMS. A marcaÃÃo para o antÃgeno Ki-67 aumentou conforme a progressÃo dos tumores astrocÃticos, sendo que sua detecÃÃo em mais de 8,0% das cÃlulas tumorais distinguiu os Astrocitomas Grau IV, Ãndices entre 1,5 e 8,0% diferenciaram os Astrocitomas Grau III e valores abaixo de 1,5% discriminaram os tumores de baixo grau (I e II). A expressÃo das proteÃnas TopoIIα e c-Myc (nuclear) demonstraram associaÃÃo com a proliferaÃÃo celular nos astrocitomas, todavia de maneira nÃo exclusiva. A positividade citoplasmÃtica para proteÃna c-Myc foi maior entre os tumores de alto grau (71,43%), com escores de expressÃo mÃximos nos Astrocitomas Grau IV (LI mÃdio=15,57; H mÃdio=24,42). Em mÃdia, 76,9% das cÃlulas tumorais dos Astrocitomas Grau IV manifestaram moderada positividade para GFAP. A positividade e os escores de marcaÃÃo para as proteÃnas p53 e p27KIP1 (nuclear e citoplasmÃtica) demonstraram tendÃncia de aumento conforme a progressÃo dos tumores astrocÃticos, enquanto a detecÃÃo do p21WAF1/CIP1 mostrou orientaÃÃo oposta (exceto no grau IV). A porcentagem de tumores positivos para Bcl-2 e Bax aumentou conforme a gradaÃÃo dos astrocitomas, com positividade geral de 43,26% e 24,67%, respectivamente. Os escores de marcaÃÃo para Bcl-2 demonstraram propensÃo ao acrÃscimo segundo a evoluÃÃo tumoral, enquanto os Ãndices para Bax foram semelhantes nas diversas graduaÃÃes. A expressÃo da proteÃna erbB2 foi evidenciada apenas entre os Astrocitomas Grau IV (positividade=14,28%), enquanto a superexpressÃo da proteÃna EGFR destacou-se nos tumores astrocÃticos dos graus I e IV, com respectivamente 46,15% e 61,90% de casos positivos. A detecÃÃo da proteÃna p21Ras foi preponderante entre os Astrocitomas Grau II (positividade=37,71%), estando ausente nos tumores de alto grau (III e IV). A superexpressÃo do EGFR e a mutaÃÃo do p53 configuraram eventos mutuamente exclusivos nos astrocitomas, assim como a superexpressÃo da proteÃna p21Ras e dos receptores da famÃlia ErbB. Constatou-se elevada positividade para as enzimas GSTπ, TS e MGMT nos tumores astrocÃticos. Os Ãndices de expressÃo da MGMT mostraram-se elevados e constantes entre as diferentes categorias histolÃgicas, incluindo os espÃcimes nÃo-tumorais (LI mÃdio=69,43). Os escores para GSTπ demonstraram tendÃncia à reduÃÃo de acordo com evoluÃÃo maligna dos astrocitomas, enquanto os Ãndices para TS atingiram nÃveis mais elevados entre os Astrocitomas Grau IV (H mÃdio=63,33). A positividade para enzima TopoIIα apresentou propensÃo ao aumento conforme a progressÃo dos tumores astrocÃticos, ao passo que os escores de marcaÃÃo foram semelhantes nos astrocitomas dos graus II, III e IV (LI mÃdio=27,71). Os resultados obtidos pela corrente investigaÃÃo apontaram o antÃgeno Ki-67 como o melhor marcador de proliferaÃÃo celular nos tumores astrocÃticos. A mutaÃÃo do p53 configurou evento inicial, relevante e potencialmente indicador de progressÃo tumoral nos astrocitomas. A detecÃÃo do supressor tumoral p21WAF1/CIP1 representou importante recurso para a deduÃÃo da situaÃÃo funcional do gene p53, enquanto a ativaÃÃo funcional do p27KIP1 nÃo foi comprometida pelo processo tumorigÃnico nos astrocitomas. A relaÃÃo Bcl-2/Bax nos astrocitomas revelou a crescente orientaÃÃo à sobrevida celular conforme a evoluÃÃo maligna desses tumores. A superexpressÃo da proteÃna p21Ras destacou-se como um evento molecular tÃpico do grau II e virtual indicador de nÃo-progressÃo tumoral. O acÃmulo citoplasmÃtico da proteÃna c-Myc configurou fenÃmeno inicial e significante na tumorigÃnese dos astrocitomas, sendo reflexo direto da expressÃo nuclear do gene c-myc e da malignidade tumoral. A anÃlise conjunta dos marcadores moleculares investigados confirmou a mutaÃÃo do gene p53 como a principal via tumorigÃnica dos astrocitomas, ainda que a superexpressÃo do EGFR tenha sido a alteraÃÃo predominante nos tumores do grau IV e a expressÃo do gene c-myc tenha representado uma via molecular distinta e alternativa Ãs demais nas diferentes graduaÃÃes tumorais. A marcante presenÃa das enzimas MGMT, GSTπ e TS configurou virtual indicaÃÃo de quimiorresistÃncia para diversos agentes antineoplÃsicos, enquanto a elevada expressÃo da TopoIIα revelou esta enzima como potencial alvo terapÃutico nos tumores astrocÃticos.