Ulm, Univ., Diss., 2002.

Regensburg, Univ., Diss., 2009.

Das kürzlich publizierte MTUS1-Gen zeigt Eigenschaften eines Tumorsuppressor-Gens. So liegt die MTUS1-Expression in verschiedenen Tumorzelllinien vermindert vor und bei rekombinanter Expression in der schnell wachsenden Pankreaskarzinomzelllinie MiaPaCa-2 konnte die Proliferation signifikant reduziert werden. Darüber hinaus interagiert MTUS1 mit dem AT2-Rezeptor und scheint durch die Inhibierung des RTK-Signalwegs die Zellproliferation zu regulieren. Nach den Untersuchungen der MiaPaCa-2-Zelllinie konnte eine Mutation in der Exonsequenz und der vorhergesagten Promotorregion als Ursache der niedrigen MTUS1-Expression ausgeschlossen werden. Die Analyse des Promotorbereichs hinsichtlich des Methylierungsmusters der CpG- und CpNpG-Inseln brachte deutliche Methylierungsunterschiede in den CpNpG-Inseln der MiaPaCa-2-Zellen gegenüber HUVEC-Zellen zu Tage. Die anschließende Untersuchung der vorhergesagten Promotorregion mit Hilfe eines Promotor-Assays brachte die Gewissheit, dass es sich bei der untersuchten Sequenz um einen Transkription regulierenden Genabschnitt handelt. Durch die Transfektion von HUVEC-Zellen mit MTUS1-siRNA konnten nachweislich Zellen mit einem funktionellen MTUS1-Knockout hergestellt werden. Diese Zellen zeigten mit der verminderten MTUS1-Expression ein signifikant erhöhtes Wachstum. Die Ergebnisse der Zellversuche legen die Vermutung nahe, dass MTUS1 deshalb als Tumorsuppressor-Gen agieren kann, weil es die Zellproliferation reguliert und so der funktionelle MTUS1-Knockout mit einem erhöhten Zellwachstum einhergeht. Als Mechanismus der Geninaktivierung kommt die Hypomethylierung der vorhergesagten Promotorsequenz in Frage. Die Untersuchung der Colontumorgewebe und Normalgewebe von zehn Patienten mit Colonkarzinom zeigte eine deutliche Reduktion der MTUS1-Protein-Expression in 50% der Tumorgewebe. Bei diesen Patienten konnte ebenfalls eine signifikant reduzierte mRNA-Expression nachgewiesen werden. Wie bereits bei den MiaPaCa-2-Zellen nachgewiesen, zeigte sich eine Hypomethylierung der CpNpG-Inseln in den Geweben mit geringer MTUS1-Expression. Diese veränderte Methylierung könnte die Erklärung für die verminderte Transkription des MTUS1-Gens sein. Mit dem MTUS1-Knockout-Maus-Modell wurde die Grundlage für das bessere Verständnis der Funktion von MTUS1 in vivo geschaffen. Nach erfolgreicher Blastozysteninjektion und Zucht der homozygoten Knockout-Mäuse, konnte auf DNA-, mRNA- und Protein-Ebene die geglückte Ausschaltung des MTUS1-Gens bestätigt werden. Bei der Langzeituntersuchung der Tiere zeigten sich vor allem Abweichungen im Blutbild, wonach die homozygoten und heterozygoten Tiere auffallend hohe Werte an Leukozyten und Lymphozyten aufwiesen. Durch die pathologische Untersuchung konnte eine extramedulläre Hämatopoese und lymphatische Infiltrate in verschiedenen Organen nachgewiesen werden und gaben Hinweise auf eine Bluterkrankung. Nach diesen pathologischen Ergebnissen zeigten 23% der homozygoten und 17% der heterozygoten Tiere Symptome eines B-Zell-Lymphoms. Bei den Wildtyp-Tieren konnten keine pathologischen Auffälligkeiten gezeigt werden. Fast ein Viertel der homozygoten Mäuse wiesen eine Herzhypertrophie auf, oft einhergehend mit einer chronischen Glomerulonephritis und einer Atelektase der Lunge. Eine denkbare Erklärung für die blutdruckunabhängige Entstehung der Herzhypertrophie wäre eine Beeinflussung von Wachstumsfaktoren, da bereits nachgewiesen wurde, dass eine durch MTUS1 vermittelte Inhibierung von Insulin-, bFGF- und EGF-gesteuerten Signalkaskaden eine Inaktivierung von ERK2 zur Folge hatte. Mit Hilfe einer X-Gal-Färbung von verschiedenen Organen einer Wildtyp-, heterozygoten und homozygoten Maus konnten Erkenntnisse über die Genaktivität von MTUS1 in den verschiedenen Organen gewonnen werden. Zusammenfassend lässt sich von einer hohen MTUS1-Expression in den meisten Epithelzellen und Endothelzellen sprechen, außerdem weisen die Kardiomyozyten im Herz und die Purkinjefasern im Gehirn eine hohe Expression auf. Bei der Untersuchung von homozygoten und Wildtyp-Bauchhautfibroblasten wurde schließlich eine geringere Zellgröße der homozygoten Fibroblasten festgestellt. Mit der X-Gal-Färbung konnte nachgewiesen werden, dass das MTUS1-Protein vorwiegend in der Nähe des Zellkerns lokalisiert ist. Eine der untersuchten homozygoten Fibroblastenlinien zeigte gegenüber den anderen Fibroblasten eine deutlich erhöhte Proliferation. Das könnte ein Hinweis auf eine antiproliferative Wirkung von MTUS1 und eine Erklärung für die kleinere Zellgröße der homozygoten Fibroblasten sein. Als Zusammenfassung aller hier gezeigten Ergebnisse konnte die Hypothese untermauert werden, dass es sich bei MTUS1 um ein Tumorsuppressor-Gen handelt, das seine antiproliferativen Eigenschaften wahrscheinlich in Kooperation mit dem AT2-Rezeptor durch die Inhibierung des RTK-Signalwegs vermittelt. / The recently published MTUS1 gene exhibits characteristics of a tumor suppressor gene. Thus the MTUS1 expression is decreased in different tumor cell lines and the recombinant expression of MTUS1 could reduce the proliferation in the fast growing pancreatic tumor cell line MiaPaCa-2. Beyond that, MTUS1 interacts with the AT2 receptor and seems to regulate the cell proliferation by the inhibition of the RTK signaling pathway. After the investigations of the MiaPaCa-2 cell line, a mutation in the exon sequence or the predicted promoter region could be excluded as a cause of the low MTUS1 expression. The analysis of the promoter range regarding the methylation pattern of the CpG and CpNpG islands did not reveal differences in the methylation of the CpG islands, but clear discrepancies in the CpNpG islands of the MiaPaCa-2 cells in contrast to the HUVEC cells. The subsequent investigation of the predicted promoter sequence with a promoter assay approved the hypothesis that the examined sequence has properties for the regulation of gene transcription. HUVEC cells with a functional MTUS1 knockout could be obtained by the transfection with MTUS1 siRNA. The experiment with these cells exhibited that cells without MTUS1 expression can proliferate significantly faster. The assumption that MTUS1 could act like a tumor suppressor gene by affecting the regulation of the cell proliferation is thereby confirmed. The investigation of the tumor tissue and normal tissue of ten patients with colorectal carcinoma revealed a clear reduction of the MTUS1 protein expression in 50% of the tumor tissues. In these tissues a significantly reduced MTUS1 mRNA expression could also be proven. The methylation pattern of the CpG islands showed no differences between tumor and normal tissue, but there was a hypomethylation of the CpNpG islands in the tissue with less MTUS1 Expression. This methylation pattern could be the explanation for the decreased transcription of the MTUS1 gene. With the MTUS1 knockout mouse model the basis for a better understanding of the MTUS1 function in vivo has been created. After successful injection of stem cells into blastocysts and breeding of the homozygote knockout mice, the elimination of the MTUS1 gene could be proven on DNA, mRNA and protein level. The long-term investigation showed discrepancies in the haemogram of the wildtype, heterozygote and homozygote mice. The homozygote and heterozygote animals had remarkably high values of leukocytes and lymphocytes, while the values of the erythrocytes and the thrombocytes decreased. The pathological investigation could detect extramedullary haematopoiesis in spleen, lymph node and kidneys of the heterozygote and homozygote mice, in addition lymphocytic infiltrates in spleen, kidneys, lung, liver, lymph node and salivary gland were discovered, probably referring to a blood illness. To these pathological results 23% of the homozygote and 17% of the heterozygote animals showed symptoms of a B-cell-lymphoma. The wildtype animals showed no abnormality regarding the extramedullary haematopoiesis or the lymphocytic infiltration in organs. Nearly a quarter of the homozygote mice exhibited a hypertrophy of the heart, often accompanied with a chronic glomerulonephritis and an atelectasis of the lung. The interaction with growth factors could be an explanation for the blood pressure independent hypertrophy because MTUS1 can inhibit the insulin, bFGF and EGF signaling cascades. With the help of the X-gal staining of different organs from wildtype, heterozygote and homozygote mice, informations about the MTUS1 activity could be gathered. In summary MTUS1 showed a high expression in epithelial and endothelial cells, in the cardiomyocytes in the heart and the pukinje cells in the brain. During the analysis of the homozygote and wildtype fibroblasts a smaller height of the homozygote fibroblasts was determined. With the X-gal staining it could be proven that the MTUS1 protein is located predominantly in the perinuclear region. One of the examined homozygote fibroblast lines showed a significant higher proliferation rate in comparison to the wildtype and two other homozygote fibroblast lines. This could be again a reference of the antiproliferative effect of MTUS1 and an explanation for the smaller cell height of the homozygote fibroblasts. The summary of all results supports the hypothesis that MTUS1 has characteristics of a tumor suppressor gene. For the antiproliferative effect MTUS1 seems to cooperate with the AT2 receptor to inhibit the RTK signaling pathway.

Die Karzinomentstehung im Kolon lässt sich entsprechend der Adenom-Karzinom-Sequenz u.a. auf die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen zurückführen. Loss of heterozygosity (LOH) in verschiedenen chromosomalen Bereichen konnten bereits mit einer signifikant schlechteren Patientenprognose oder einem schlechteren Ansprechen einer Chemotherapie korreliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 2 Multiplex-PCR Reaktionen zur Untersuchung von DNA-Proben etabliert. Anschließend wurden 100 Tumoren in den chromosomalen Regionen 1p32-36, 4p14-16 und 17p12 auf allelische Deletionen untersucht und diese mit der Patientenprognose korreliert. Es konnte ein signifikant schlechteres Überleben bei einem gleichzeitigen Vorliegen von LOH auf den Regionen 4p15.2 (D4S2397) und 17p12 (D17S1303) gefunden werden (p=0,0367). Ferner konnte ein Trend zur schlechteren Prognose bei einem gleichzeitigen Auftreten von LOH in den Regionen 17p12 (D17S1303) und 1p32-36 (HY-TM1) gezeigt werden (p=0,15). Um klinisch nutzbare Untersuchungsverfahren zur Prognosebestimmung bei Patienten mit Kolonkarzinom entwickeln zu können, werden noch weitere molekulargenetische Folgestudien nötig sein. / According to the adenoma-carcinoma-sequence, the carcinogenesis of the colon can be ascribed among other things to the inactivation of tumor suppressor genes. Loss of heterozygosity (LOH) in various chromosomal areas were shown as being associated with a significant worse patient prognosis or a reduced response to chemotherapy. In this work 2 multiplex-PCRs were established to analyze DNA-samples. 100 tumor-samples were scanned for allelic deletions of the chromosomal regions 1p32-36, 4p14-16 and 17p12 and correlated with the prognosis of the patients. There was a significant worse survival when having a coexistent LOH at the regions 4p15.2 (D4S2397) and 17p12 (D17S1303) (p=0,0367). Furthermore there was a trend found for a worse prognosis for patients with a coexistent LOH at 17p12 (D17S1303) and 1p32-36 (HY-TM1) (p=0,15). There are further molecular genetic studies necessary to develop clinical useful tests to estimate the prognosis of a patient with colorectal cancer.

Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2007.

Stuttgart, Univ., Diss., 2001.

University, Diss., 2001--Mainz.

Die Entstehung und Progression maligner Tumoren ist ein mehrstufiger Prozeß, der auf einer Vielzahl genetischer Alterationen beruht. Essentielle Schritte sind die Aktivierung von Proto-Onkogenen und die Inaktivierung von Tumor-Suppressorgenen. Infolge dessen können die Zellen unabhängig von externen Wachstumssignalen ungebremst proliferieren, die Apoptose wird gehemmt, die Angiogenese wird aktiviert, und es kommt schließlich zur Metastasierung. Zu den bekanntesten Proto-Onkogenen, die in humanen Tumoren aktiviert werden, gehören die RAS Gene. Sie sind in einer Vielzahl von Tumoren mutiert und führen zu einer Stimulation der Proliferation. Um den Einfluß aktivierter RAS Onkogene auf die Regulation der Genexpression zu untersuchen wurden Genexpressionsprofile in Zellkultur-Modellen und humanen Tumoren erstellt. In einem Fibroblasten- und einem Epithelzell-basierten System konnten mehrere hundert, RAS-abhängig differenziell exprimierte Genen identifiziert werden. Aufgrund der bekannten Funktionen ihrer Genprodukte spielen sie eine wichtige Rolle im Verlust der Zellzyklus-Kontrolle, der Kontrolle der Signalübertragung, in der Angiogenese-Induktion sowie in der Invasion und damit Metastasierung. Die Zusammenhänge zwischen der Aktivierung bestimmter Signalkaskaden wie z.B. Raf-Mek-Erk oder PI-3K und der Expression von definierten Genmustern wurden hergestellt. Weiterhin konnte mit Hilfe von Microarray Analysen eine Vielzahl potentieller Tumormarker und Zielgene für therapeutische Intervention im Ovarialkarzinom identifiziert werden. Die Rolle der KlasseII Tumorsuppressor Gene Caveolin-1 und H-REV107-1 in humanen Ovarialkarzinomen wurde detailliert untersucht und ihre Rolle in der Regulation des Zellüberlebens nachgewiesen. Caveolin-1, ein negativer Regulator der RAS-abhängigen Signalübertragung, wird in über 80% der untersuchten humanen Ovarialkarzinome gehemmt. Hierbei spielen epigenetische Mechanismen eine Rolle, die jedoch nicht Caveolin-1 selbst, sondern einen unbekannten Regulator des Caveolin-1 Gens betreffen. Das H-REV107-1 Gen, ein Wachstumsregulator mit unbekannter Funktion wird in ca. 50% der untersuchten Ovarialkarzinome nicht mehr exprimiert. Ähnlich wie bei Caveolin-1, führt eine gezielte Expression des Gens in Tumorzellen zur Apoptose. Die Suche nach Interaktionspartnern des H-REV107-1 Gens führte zur Identifizierung der ubiquitär exprimierten Phosphatase2A (PP2A). Die Bindung zwischen H-REV107-1 und PP2A wurde weiter charakterisiert und ihre Rolle in der H-REV107-1 vermittelten Apoptose analysiert. / Development and progression of human tumours is a multistep process depending on numerous genetic alterations. Essentiell steps herein are the mutational activation of oncogenes and the inactivation of tumour suppressor genes. As a result of these alterations, the cells acquire the potential of unlimited growth independent of external growth factor signals, apoptosis is diminished, angiogenesis is stimulated and finally metastasis can occur. Among the best known proto-oncogenes, mutated in a number of human tumours, are the RAS genes. To investigate the role of RAS oncogenes in transformation-related transcriptional alterations, expressionsprofiling was performed from cell culture models and human tumours. Several hundred genes were identified to be de-regulated in a RAS-dependent manner in a fibroblast and an epithelial cell-based model. The protein products encoded by these genes play important roles in the loss of cell cycle control, control of signal transduction, angiogenesis induction as well as invasion and metastasis. Groups of de-regulated genes could be assigned to distinct signaling pathways such as the Raf-Mek-Erk or the PI-3 kinase dependent pathways. In addition, a number of potential tumour markers and potential target structures for therapeutic intervention were identified in ovarian carcinomas with the help of microarray studies. The role of the class II tumor suppressor genes Caveolin-1 and H-REV107-1 in human ovarian carcinomas was further investigated and their role in the regulation of cell survival was demonstrated. Caveolin-1, a negative regulator of RAS-dependent signal transduction, is supressed in more than 80% of the ovarian carcinomas analysed. This suppression is mediated by epigenetic mechanisms which due not target Caveolin-1 itself but an unknown regulator of the Caveolin-1 gene. The H-Rev107-1 gene, a growth regulator with unknown function, is no longer expressed in nearly 50% of the ovarian carcinomas analysed. Similar to Caveolin-1, also re-expression of H-REV107-1 results in apoptosis in the tumour cells. The search for proteins interacting with H-REV107-1 led to the identification of the ubiquitously expressed phosphatase 2A (PP2A). The interaction between H-REV107-1 and PP2A was further characterised and its role in the H-REV107-1 mediated apoptosis investigated.

Das Klasse II Tumorsuppressor-Gen H-REV107-1, ist in normalen Geweben ubiquitär exprimiert, zeigt jedoch häufig Expressionsverluste, vorzugsweise in Tumoren des Brustgewebes, des Ovars und der Lunge. Das H-REV107-1 Protein wirkt in vitro und in vivo als Wachstumssuppressor. Um den Mechanismus der H-REV107-1 bedingten Wachstumshemmung zu verstehen, haben wir mit Hilfe des LexA-basierten Hefe-2-Hybrid Systems interagierende Proteine identifiziert. Diese Suche wurde mit einem H-REV107-1 Deletionskonstrukt durchgeführt, dem die Membran-bindende Domäne fehlte. Diese Analyse lieferte eine Vielzahl von potentiellen Interaktionspartnern, darunter der Retinsäure Rezeptor RARG, das Calcium-bindende Proteine S100A6, der Translations-Elongationsfaktor ETF und das weitgehend unbekannte Protein p14.5 Die Bindungen des H-REV107-1 Proteins an die beiden potentiellen Kandidaten, den Transkriptionsfactor PC4 und die regulatorische Untereinheit der Protein Phosphatase 2A (PR65), wurden genauer untersucht. Wir haben dabei einen Proteinkomplex aus H-REV107-1, PC4 und STAT1 (Signal Transducer and Activator of Transcription 1) identifiziert, der vermutlich eine Rolle in der IFNgamma - abhängigen Wachstumshemmung in Ovarialkarzinom Zellen spielt. Da sich die Expression des H-REV107-1 Gens durch IFNgamma über den Transkriptionsfaktor IRF-1 stimulieren läßt, und in verschiedenen Zelllinien sowohl zur Hemmung des Wachstums, als auch zur Apoptose führt, vermuteten wir verschiedene Mechanismen der Wachstumshemmung durch den IFNgamma-Signalweg und H-REV107-1. Weitere Analysen der H-REV107-1 - vermittelten Apoptose zeigten, daß die Interaktion zwischen H-REV107-1 und PR65 eine wichtige Rolle in diesem Prozeß spielt. Um die Proteindomäne zu identifizieren, welche für die direkte Wechselwirkung von H-REV107-1 mit PR65 verantwortlich ist, wurden H-REV107-1 Mutanten generiert und mittels Co-Immunpräzipitation getestet. Die Prolin-reiche Sequenz am N-Terminus des H-REV107-1 Proteins konnte als verantwortliche Domäne für die Interaktion bestimmt werden. Die funktionelle Analyse dieser Interaktion zeigte die Hemmung der Protein Phosphatase 2A (PP2A) Aktivität in Ovarialkarzinom Zellen durch H-REV107-1. Der Einsatz der Mutanten im Phosphatase-Aktivitätstest zeigte, daß die selbe Domäne, die die Interaktion vermittelt, auch für die Hemmung der Phosphatase 2A verantwortlich ist. Diese Fakten deuteten auf eine wichtige Rolle der Phosphatase 2A in Ovarialkarzinom Zellen hin, weil sowohl die Verwendung des PP2A Inhibitors (Okadainsäure), als auch die Transfektion der Zellen mit einem H-REV107-1 - Expressionsplasmid zur Apoptose führten. Damit konnten wir zeigen, daß PP2A für das Überleben der Ovarialkarzinomzellen notwendig ist, und die Reaktivierung des H-REV107-1 Proteins durch IFNgamma zur Hemmung der Phosphatase und damit zur Apoptose führt. / The H-REV107-1 class II tumor suppressor gene is ubiquitously expressed in normal tissues and down-regulated in human breast, ovarian and lung tumours. H-REV107-1 has the capacity to suppress growth of tumour cells in vitro and in vivo. To understand the mechanism of H-REV107-1 mediated growth suppression I performed a search for H-REV107-1 interacting proteins using a LexA-based yeast two-hybrid system. I screened a human kidney cDNA library with a truncated form of the H-REV107-1 as a bait. This analysis revealed numerous potential interaction partners. Among them the retinoic acid receptor gamma (RARG), the calcium-binding protein S100A6, the translation termination factor ETF1, and the potential translational inhibitor protein P14.5. The interaction of H-REV107-1 with the transcriptional co-activator PC4 and with the regulatory subunit A of protein phosphatase 2A (PR65) was analysed in detail. H-REV107-1 binds ectopically expressed and endogenous PC4. In addition, a multiprotein complex between H-REV107-1, PC4 and the signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) was demonstrated. This complex is likely to be involved in IFNgamma-mediated growth suppression of ovarian carcinoma cells. Endogenous H-REV107-1 can be induced after application of IFNgamma through the IRF-1 transcription factor. This up-regulation of H-REV107-1 leads either to growth suppression via a G1 arrest or to apoptosis depending on the cell line, suggesting different mechanisms of IFNgamma-, and H-REV107-1- mediated growth suppression. Further investigation of the mechanism of H-REV107-1-dependent apoptosis revealed an important role of the interaction between H-REV107-1 and the PR65 protein. The use of several H-REV107-1 mutant proteins generated after disruption of the highly conserved domains identified the proline-rich N-terminal domain responsible for the interaction with PR65 in Co-immunoprecipitation studies. Functional investigation of the H-REV107-1 - PR65 interaction demonstrated that wild-type H-REV107-1 is able to inhibit PP2A activity, however a mutant protein lacking the N-terminal domain was devoid of this function. We sought to identify the functional relevance of the PP2A activity in ovarian carcinoma cells with normally have suppressed the H-REV107-1 gene. Treatment of OVCAR-3 cells with the PP2A inhibitor Okadaic acid and transient transfection of the cells with wild-type H-REV107-1 resulted in the activation of caspase-9, suggesting a role for PP2A in the survival of ovarian carcinoma cells. We suggest, that the down-regulation of H-REV107-1 in ovarian carcinomas is a prerequisite for the PP2A-dependent activation of yet unknown signalling pathways mediating tumour cell survival. Reactivation of H-REV107-1 gene expression via IFNgamma leads to the inhibition of PP2A activity and tumour cell death.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden mittels molekular-zytogenetischer Methoden die chromosomalen Aberrationen in c-myc aktivierten ARFnull- und INK4a/ARFnull-Mauslymphomen untersucht. Die zytogenetischen Ergebnisse wurden mit dem Therapieverlauf der Mäuse nach Cyclophosphamid-Behandlung verglichen. In den ARFnull-Lymphomen erkannten wir den Gewinn des Chromosoms 14 als einen Marker für gute und den Gewinn des Chromosoms 6 als Marker für schlechte Behandlungserfolge. Auf den Chromosomen 6 und 14 der Maus liegen demnach bisher unbekannte Gene, welche für die Wahl der Behandlungsmethode ARF-defizienter Tumore von entscheidender Bedeutung sind. Der zweite Teil der Arbeit befaßt sich mit Common Fragile Sites (CFS), die als "hot spots" für chromosomale Brüche und Umbauten in Tumorgenese und Karyotypevolution diskutiert werden. CFSs treten als seltene Lücken im Chromatin oder als partiell deletierte bzw. rearrangierte Chromosomen auf. Ihre Zahl wird durch Zugabe von Replikations-hemmenden Chemikalen, wie Aphidicolin (APC), erheblich gesteigert. Wir untersuchten die CFS-Expression in Lymphozytenkulturen der Mausstämme BALB/c und C57BL/6. Die APC-induzierten CFS-Häufigkeiten der Chromosomenbanden wiesen im Vergleich zwischen beiden Mausstämmen eine signifikante Korrelation und damit eine starke Konservierung auf. Ebenfalls wurde zwischen Maus / Mensch-syntenischen Bereichen eine Konservierung der CFS-Häufigkeiten detektiert. Die Tendenz zur CFS-Bildung ist also ein spezifisches Merkmal jedes chromosomalen Abschnitts, das evolutionär konserviert ist. Weiterhin wurden einzelne CFSs mit molekular-zytogenetischen Methoden genauer kartiert. Auf diese Weise beschrieben wir erstmals eines der zehn häufigsten CFSs menschlicher Lymphozyten, FRA7K, und erweiterten somit die Anzahl molekular charakterisierter humaner CFSs auf insgesamt 13. Für fünf dieser CFSs analysierten wir mittels FISH-Analyse die homologen Bereiche im Mausgenom hinsichtlich ihrer CFS-Expression. Die beobachteten Läsionen traten jeweils in exakt den entsprechenden Sequenzen auf. Vereint man diese fünf Beispiele (FRA2G/Fra2D, FRA7G/Fra6A3.1, FRA7H/Fra6B1, FRA7K/Fra12C1 und FRA9E/Fra4C2) mit bekannten Homologen aus der Literatur, so wurde für insgesamt acht CFSs eine Konservierung zwischen Mensch und Maus auf molekularer Ebene gefunden. Trotz zahlreicher Untersuchungen ist der zelluläre Mechanismus, der die Ausbildung von CFSs an spezifischen Stellen des Genoms bewirkt, bis heute weitgehend unklar. Bekannt ist, daß CFSs durch Replikationsinhibition induziert werden und in Metaphase-Zellen sichtbar werden, welche DNA-Replikations-Checkpoints unterlaufen haben.Sämtliche jüngeren Studien beschrieben Inseln erhöhter DNA-Helix-Flexibilität (Schwankungen im Biegungswinkel des Moleküls) in den Bereichen von CFSs. Wir berechneten die DNA-Helix-Flexibilität entlang der Sequenz für alle molekular kartierten humanen und Maus-CFSs sowie für stabile Kontrollregionen. Anders als in der Literatur beschrieben, fanden wir für Mensch und Maus, daß sich CFSs und Kontroll-DNAAbschnitte in ihrer Dichte an Inseln mit erhöhter DNA-Helix-Flexibilität nicht unterschieden. Nahezu alle Regionen der häufigen molekular charakterisierten CFSs umfassen große Gene, deren Exons mehr als 650 kb genomische Sequenz überspannen. Im Gegensatz dazu traten große Gene in den stabilen Kontrollregionen deutlich seltener auf. Öffentlich zugängliche RNA-Expressionsdaten dieser Gene zeigten, daß CFSs bevorzugt in Bereichen mit transkriptionell aktiven, großen Genen entstehen. Darauf und auf dem Wissen aus der Literatur begründen wir die Hypothese, daß eine Blockierung der DNAReplikationsgabel, vor allem in Bereichen großer transkriptionell aktiver Gene - eventuell begründet durch deren offenere Chromatinstruktur - und das anschließende Unterlaufen von Zellzyklus-Checkpoints an der Bildung von CFSs und damit in einem Anstieg von Doppelstrangbrüchen beteiligt sind.