<p>The thesis consists of two main parts of nonlinear optical instrumentation development. </p> <p>Fluorescence-detected mid-infrared photothermal (F-PTIR) microscopy is demonstrated for sub-diffraction limited mid-infrared microspectroscopy of model systems and applied to probe phase transformations in amorphous solid dispersions. To overcome the diffraction limit in infrared imaging, a highly localized temperature-dependent photothermal effect is an attractive alternative indicator to infrared absorption. Photothermal atomic force microscopy infrared spectroscopy (AFM-IR) achieves nanometer resolution by monitoring heat caused expansion but only restricted on the surface. For 3D imaging, optically detected photothermal infrared (O-PTIR) combines an infrared laser with a visible probe source with to transduce photothermal refractive index changes (e.g., from changes in beam divergence or scattering). The sensitivity of O-PTIR is ultimately limited by the relatively weak dependence of refractive index with temperature, exhibiting changes of ~0.01% per oC. Fluorescence-detected photothermal mid-infrared (F-PTIR) spectroscopy (Fig. 1) is demonstrated herein to support 3D imaging with improved photothermal sensitivity. In F-FTIR, the sensitivity of fluorescence quantum efficiency to temperature change (~1-2% per oC) is used to transduce transient heat flux from localized IR absorption. The infrared spatial resolution of F-FTIR is defined by fluorescence microscopy and the thermal diffusivity of the sample instead of infrared wavelength. Initial F-PTIR proof of concept studies are described for microparticle assemblies of silica gel and polyethylene glycol, followed by applications of F-PTIR for analysis of localized composition within phase-separated domains induced by water vapor exposure of an amorphous solid dispersion (ritonavir in copovidone).</p> <p>Fluorescence recovery while photobleaching (FRWP) is demonstrated as a method for quantitative measurements of rapid diffusion mapping over the microsecond to millisecond time scale. Diffusion measurements are critical for molecular mobility assessment in cell biology, materials science and pharmacology. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) is a well-known noninvasive optical microscopy method for measuring diffusion coefficients of macromolecules, such as proteins in cells and viscous solutions. However, conventional point-bleach FRAP is challenging to implement with multi-photon excitation and typically only supports diffusion analysis over millisecond time scales due to camera frame rate limitations. FRWP with patterned illumination addresses these limitations of FRAP by probing the fluorescence intensity changes while bleaching a comb pattern within a field of view (FoV). Fast-scanning of an ultrafast excitation beam distributes heat rapidly over multiple adjacent pixels, minimizing local heating effects that could complicate analogous diffusion measurements by point-bleach FRAP with multiphoton excitation. In FRWP, time-scales of the probed diffusion events are defined by a single line-pass time of a resonant scanning-mirror with a period of 125  s. In FRWP, the bleach pattern spans locations across the whole FoV, enabling diffusion mapping through image segmentation. More than a hundred bleaching and recovery events can be recorded during a single 10s measurement. Normal and anomalous diffusion of rhodamine-labeled bovine serum albumin (BSA) molecules was studied as a model system, with applications targeting rapid assessment of therapeutic macromolecule mobility within heterogeneous biological environments.</p>

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Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The sympathetic nervous system strongly modulates the contractile and electrical function of the heart. The anatomical underpinnings that enable a spatially and temporally coordinated dissemination of sympathetic signals within the cardiac tissue are only incompletely characterized. In this work we took the first step of unraveling the in situ 3D microarchitecture of the cardiac sympathetic nervous system. Using a combination of two-photon excitation fluorescence microscopy and computer-assisted image analyses, we reconstructed the sympathetic network in a portion of the left ventricular epicardium from adult transgenic mice expressing a fluorescent reporter protein in all peripheral sympathetic neurons. The reconstruction revealed several organizational principles of the local sympathetic tree that synergize to enable a coordinated and efficient signal transfer to the target tissue. First, synaptic boutons are aligned with high density along much of axon-cell contacts. Second, axon segments are oriented parallel to the main, i.e., longitudinal, axes of their apposed cardiomyocytes, optimizing the frequency of transmitter release sites per axon/per cardiomyocyte. Third, the local network was partitioned into branched and/or looped sub-trees which extended both radially and tangentially through the image volume. Fourth, sub-trees arrange to not much overlap, giving rise to multiple annexed innervation domains of variable complexity and configuration. The sympathetic network in the epicardial border zone of a chronic myocardial infarction was observed to undergo substantive remodeling, which included almost complete loss of fibers at depths >10 µm from the surface, spatially heterogeneous gain of axons, irregularly shaped synaptic boutons, and formation of axonal plexuses composed of nested loops of variable length. In conclusion, we provide, to the best of our knowledge, the first in situ 3D reconstruction of the local cardiac sympathetic network in normal and injured mammalian myocardium. Mapping the sympathetic network connectivity will aid in elucidating its role in sympathetic signal transmisson and processing.

<p>We have studied fundamental aspects of time-resolved two-photon excited fluorescence depolarisation. The thesis presents experimental as well as theoretical progress. We show that a multi-photon induced instrumental response function obtained from a suspension of gold nanoparticles is appropriate for the analysis of two-photon excited fluorescence decays obtained using time-correlated single photon counting detection. Theoretical expressions have been derived for the fluorescence anisotropy decay obtained upon two-photon excitation of various molecular systems in liquid solutions: a) an anisotropic rigid rotor that undergoes rotational diffusion in the presence of ultrafast unresolved restricted reorientations, e.g. librations. b) a molecular group covalently attached to a stationary macromolecule, and undergoing local reorientation in a uniaxial ordering potential. A new approach to the analysis of two-photon excited fluorescence depolarisation experiments was developed, which combines data obtained by using linearly and circularly polarised excitation light, in a global manner. In the analysis, knowledge about unresolved reorientations was obtained from one-photon excitation studies of the corresponding systems. By means of this procedure it has been possible to obtain quantitative information about the molecular two-photon absorption tensor for perylene and two of its derivatives. Thereby the symmetry of the final excited and intermediate vibronic states could be assigned. The analysis reveals that the two-photon transition studied with the 800 nm laser exhibits mixed character. An important finding from the experiments was that the two-photon absorption tensor appears to be solvent dependent. Furthermore, the thesis presents the first theoretical treatment of two-photon excited donor-donor energy migration in the presence of molecular reorientation and which applies the extended Förster theory. Explicit expressions for molecules that belong to the point groups D_2h, D₂ and C_2v are given. Preliminary experiments are finally also reported on a two-photon excited donor-donor energy migration system consisting of a bisanthryl-bisteroid. </p>

Les astrocytes protoplasmiques de la matière grise corticale sont des cellules gliales dont les prolongements très fins et ramifiés sont en contact avec les éléments neuronaux pré- et post-synaptiques d’une part, et les vaisseaux sanguins d’autre part. Ils expriment plusieurs récepteurs des neurotransmetteurs, entre autres des récepteurs purinergiques dont l'activation facilite l’activité calcique astrocytaire et la libération de gliotransmitters (par exemple, le glutamate, le GABA, l'ATP, et la D sérine) qui régulent l’activité des neurones et des cellules gliales situées au voisinage. L’objectif de ma thèse était d’étudier in situ l’activité calcique des astrocytes et de leurs prolongements en réponse à l’application des agonistes purinergiques. Lors de ma thèse, j’ai tout d'abord testé la possibilité d’induire l’expression spécifique de gènes d’intérêt par les astrocytes corticaux de souris adultes par la technique de recombinaison Cre-LoxP. J’ai comparé les performances d’un virus adeno-associé de type 5 (AAV5) flexé (AAV5.FLEX.EGFP) et d’une souris qui exprime un indicateur calcique (GCaMP3) sous contrôle de la recombinase (souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3). L’injection d’AAV5.FLEX.EGFP dans le cortex d’une souris hGFAPcre n’a pas permis l’expression spécifique d’EGFP. La combinaison des souris exprimant le cre recombinase sous contrôle d’un promoteur sélectif des astrocytes (GLAST-CreERT2 et Cx30-CreERT2) avec le AAV5.FLEX.EGFP ou avec une lignée des souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3 permet l’expression spécifique des gènes d’intérêt (EGFP et GCaMP3) par les astrocytes corticaux. J’ai ensuite analysé l’activité calcique des astrocytes qui expriment GCaMP3. J’ai utilisé la microscopie biphotonique et enregistré l’activité calcique spontanée et évoquée par application d’agonistes purinergiques sur des tranches de cortex somatosensoriel primaire de souris adultes GLAST-CreERT2. L’activité calcique spontanée est complexe, généralement locale et désynchronisée, répartie dans les prolongements et la région somatique. Les régions actives ont été identifiées à partir d’une carte de corrélation temporale calculée en MATLAB, et leurs caractéristiques (amplitude, durée, position, fréquence) mesurées grâce à des routines établies sous IGOR. La fréquence et l’amplitude de l’activité calcique paraissent augmenter lors de l’enregistrement, ce qui suggère une sensibilité significative et une photoactivation des astrocytes, en imagerie biphotonique. La durée des impulsions laser modulerait ce phénomène. En présence d'adénosine (1-100 µM) et d’ATP (100 µM), et de façon marginale en présence d’un agoniste P2X7 non sélectif (BzATP 50-100 µM), une activité calcique synchronisée accrue est visible dans le soma et les prolongements astrocytaires en présence de tétrodotoxine qui bloque les potentiels d'action et minimise l’activité synaptique. Le mécanisme de ces réponses synchronisées reste à étudier. Aucun effet significatif n’a été observé en présence d’un agoniste spécifique P2Y1 (MRS2365 50 uM). Mon travail a permis le développement : i) de modèles murins pour l’adressage sélectif de protéines d’intérêt au niveau des astrocytes protoplasmiques ; ii) d’outils d’analyse des signaux calciques astrocytaires au niveau sub-cellulaire. Il a mis en évidence des limites possibles des protocoles standards d'enregistrement de l’activité calcique des astrocytes en imagerie biphotonique. Il confirme l’importance de l’ATP et de l’adénosine pour la signalisation astrocytaire. / Grey matter protoplasmic astrocytes are compact glial cells with highly branched processes, enwrapping synapses, and one or two endfeet contacting the blood vessels. Several neurotransmitter receptors are expressed by astrocytes, among them purinergic receptors. Upon activation of these receptors, intracellular calcium (Ca2+) transients can be induced, that, in turn, trigger gliotransmitter release (e.g. glutamate, GABA, ATP, D-serine) and participate in astrocyte-to-astrocyte signaling as well as in the communication between astrocytes and neurons or other glia. During my PhD work, I first implemented and validated several approaches for targeting transgene expression specifically to cortical astrocytes and employed them to study purinergic signaling in astrocytes. To achieve astrocyte-specific transgene expression, I used either floxed adeno-associated viral (AAV) vectors or a Cre-dependent mouse line and several mouse lines expressing the Cre recombinase under astrocyte-specific promoters. Intracerebral injections of a Cre-dependent AAV serotype 5 containing the ubiquitous CAG promoter and an enhanced green fluorescent protein (AAV5.CAG.flex.EGFP) in adult mice expressing Cre recombinase under the human glial fibrillary protein (hGFAP) promoter resulted in a non-astrocyte specific expression in the cortex. Combining inducible mouse lines expressing Cre recombinase under the glutamate aspartate transporter (GLAST) promoter with the same AAV vector resulted in a virtually astrocyte-specific expression of the reporter gene. As an alternative approach for astrocyte-specific transgene expression, we used a Cre-dependent mouse line expressing the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Crossing this mouse line with the above described GLAST-CreERT2 mouse line or a Connexin30 (Cx30)-CreERT2 line led to selective GCaMP3 expression in cortical astrocytes. Second, I investigated both spontaneous and agonist-evoked Ca2+ transients in astrocytic processes, the investigation of which has presented a major challenge in earlier studies, due to the unspecific and weak labeling by membrane-permeable chemical Ca2+ indicators. Using the strategy developed in the first part of my work allowing an astrocyte-specific expression of the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Using two-photon excitation fluorescence (2PEF) imaging in acute slices of the primary somatosensory cortex, I recorded Ca2+ transients in the astrocytic soma and processes. By aid of a custom-made MATLAB routine based on a temporal Pearson correlation coefficient, active regions could be identified in an unbiased manner. Evoked Ca2+ transients were quantified using custom IGOR routines. Spontaneous desynchronized Ca2+ transients occurred in the processes and rarely in the soma. Ca2+ signals appeared localized in distinct microdomains. Their frequency appeared to increase during long recordings of several hundred images, suggesting that fine astrocytes are vulnerable to photodamage under imaging conditions routine in 2PEF microscopy. The possibility to minimize photodamage, by varying the length of the femtosecond laser pulses is under investigation. Bath application of adenosine (1-100 µM) and adenosine-triphosphate (ATP, 100 µM), as well as the application of the non-selective P2X7 receptor agonist (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine-5'-triphosphate, BzATP, 50-100 µM), in the presence of tetrodotoxin to block neuronal action potentials, evoked synchronized Ca2+ rises in the soma and the processes of astrocytes. The effect of adenosine was dose-dependent. No significant effect of the specific P2Y1 agonist (MRS2365, 50 µM) was seen. Altogether, my work sets up a powerful and versatile toolbox for studying astrocytic Ca2+ signaling at the sub-cellular level. It also pinpoints possible limits of standard two-photon recording protocols to investigate the local Ca2+ signals in fine astrocytic processes.

Les astrocytes protoplasmiques de la matière grise corticale sont des cellules gliales dont les prolongements très fins et ramifiés sont en contact avec les éléments neuronaux pré- et post-synaptiques d’une part, et les vaisseaux sanguins d’autre part. Ils expriment plusieurs récepteurs des neurotransmetteurs, entre autres des récepteurs purinergiques dont l'activation facilite l’activité calcique astrocytaire et la libération de gliotransmitters (par exemple, le glutamate, le GABA, l'ATP, et la D sérine) qui régulent l’activité des neurones et des cellules gliales situées au voisinage. L’objectif de ma thèse était d’étudier in situ l’activité calcique des astrocytes et de leurs prolongements en réponse à l’application des agonistes purinergiques. Lors de ma thèse, j’ai tout d'abord testé la possibilité d’induire l’expression spécifique de gènes d’intérêt par les astrocytes corticaux de souris adultes par la technique de recombinaison Cre-LoxP. J’ai comparé les performances d’un virus adeno-associé de type 5 (AAV5) flexé (AAV5.FLEX.EGFP) et d’une souris qui exprime un indicateur calcique (GCaMP3) sous contrôle de la recombinase (souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3). L’injection d’AAV5.FLEX.EGFP dans le cortex d’une souris hGFAPcre n’a pas permis l’expression spécifique d’EGFP. La combinaison des souris exprimant le cre recombinase sous contrôle d’un promoteur sélectif des astrocytes (GLAST-CreERT2 et Cx30-CreERT2) avec le AAV5.FLEX.EGFP ou avec une lignée des souris Rosa-CAG-LSL-GCaMP3 permet l’expression spécifique des gènes d’intérêt (EGFP et GCaMP3) par les astrocytes corticaux. J’ai ensuite analysé l’activité calcique des astrocytes qui expriment GCaMP3. J’ai utilisé la microscopie biphotonique et enregistré l’activité calcique spontanée et évoquée par application d’agonistes purinergiques sur des tranches de cortex somatosensoriel primaire de souris adultes GLAST-CreERT2. L’activité calcique spontanée est complexe, généralement locale et désynchronisée, répartie dans les prolongements et la région somatique. Les régions actives ont été identifiées à partir d’une carte de corrélation temporale calculée en MATLAB, et leurs caractéristiques (amplitude, durée, position, fréquence) mesurées grâce à des routines établies sous IGOR. La fréquence et l’amplitude de l’activité calcique paraissent augmenter lors de l’enregistrement, ce qui suggère une sensibilité significative et une photoactivation des astrocytes, en imagerie biphotonique. La durée des impulsions laser modulerait ce phénomène. En présence d'adénosine (1-100 µM) et d’ATP (100 µM), et de façon marginale en présence d’un agoniste P2X7 non sélectif (BzATP 50-100 µM), une activité calcique synchronisée accrue est visible dans le soma et les prolongements astrocytaires en présence de tétrodotoxine qui bloque les potentiels d'action et minimise l’activité synaptique. Le mécanisme de ces réponses synchronisées reste à étudier. Aucun effet significatif n’a été observé en présence d’un agoniste spécifique P2Y1 (MRS2365 50 uM). Mon travail a permis le développement : i) de modèles murins pour l’adressage sélectif de protéines d’intérêt au niveau des astrocytes protoplasmiques ; ii) d’outils d’analyse des signaux calciques astrocytaires au niveau sub-cellulaire. Il a mis en évidence des limites possibles des protocoles standards d'enregistrement de l’activité calcique des astrocytes en imagerie biphotonique. Il confirme l’importance de l’ATP et de l’adénosine pour la signalisation astrocytaire. / Grey matter protoplasmic astrocytes are compact glial cells with highly branched processes, enwrapping synapses, and one or two endfeet contacting the blood vessels. Several neurotransmitter receptors are expressed by astrocytes, among them purinergic receptors. Upon activation of these receptors, intracellular calcium (Ca2+) transients can be induced, that, in turn, trigger gliotransmitter release (e.g. glutamate, GABA, ATP, D-serine) and participate in astrocyte-to-astrocyte signaling as well as in the communication between astrocytes and neurons or other glia. During my PhD work, I first implemented and validated several approaches for targeting transgene expression specifically to cortical astrocytes and employed them to study purinergic signaling in astrocytes. To achieve astrocyte-specific transgene expression, I used either floxed adeno-associated viral (AAV) vectors or a Cre-dependent mouse line and several mouse lines expressing the Cre recombinase under astrocyte-specific promoters. Intracerebral injections of a Cre-dependent AAV serotype 5 containing the ubiquitous CAG promoter and an enhanced green fluorescent protein (AAV5.CAG.flex.EGFP) in adult mice expressing Cre recombinase under the human glial fibrillary protein (hGFAP) promoter resulted in a non-astrocyte specific expression in the cortex. Combining inducible mouse lines expressing Cre recombinase under the glutamate aspartate transporter (GLAST) promoter with the same AAV vector resulted in a virtually astrocyte-specific expression of the reporter gene. As an alternative approach for astrocyte-specific transgene expression, we used a Cre-dependent mouse line expressing the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Crossing this mouse line with the above described GLAST-CreERT2 mouse line or a Connexin30 (Cx30)-CreERT2 line led to selective GCaMP3 expression in cortical astrocytes. Second, I investigated both spontaneous and agonist-evoked Ca2+ transients in astrocytic processes, the investigation of which has presented a major challenge in earlier studies, due to the unspecific and weak labeling by membrane-permeable chemical Ca2+ indicators. Using the strategy developed in the first part of my work allowing an astrocyte-specific expression of the genetically encoded Ca2+ indicator GCaMP3. Using two-photon excitation fluorescence (2PEF) imaging in acute slices of the primary somatosensory cortex, I recorded Ca2+ transients in the astrocytic soma and processes. By aid of a custom-made MATLAB routine based on a temporal Pearson correlation coefficient, active regions could be identified in an unbiased manner. Evoked Ca2+ transients were quantified using custom IGOR routines. Spontaneous desynchronized Ca2+ transients occurred in the processes and rarely in the soma. Ca2+ signals appeared localized in distinct microdomains. Their frequency appeared to increase during long recordings of several hundred images, suggesting that fine astrocytes are vulnerable to photodamage under imaging conditions routine in 2PEF microscopy. The possibility to minimize photodamage, by varying the length of the femtosecond laser pulses is under investigation. Bath application of adenosine (1-100 µM) and adenosine-triphosphate (ATP, 100 µM), as well as the application of the non-selective P2X7 receptor agonist (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosine-5'-triphosphate, BzATP, 50-100 µM), in the presence of tetrodotoxin to block neuronal action potentials, evoked synchronized Ca2+ rises in the soma and the processes of astrocytes. The effect of adenosine was dose-dependent. No significant effect of the specific P2Y1 agonist (MRS2365, 50 µM) was seen. Altogether, my work sets up a powerful and versatile toolbox for studying astrocytic Ca2+ signaling at the sub-cellular level. It also pinpoints possible limits of standard two-photon recording protocols to investigate the local Ca2+ signals in fine astrocytic processes.

Il est relativement bien établi que les crises focales entraînent une augmentation régionale du flot sanguin dans le but de soutenir la demande énergétique en hémoglobine oxygénée des neurones épileptiques. Des changements hémodynamiques précoces ont également été rapportés dans la région homologue controlatérale, bien que ceci ait été moins bien caractérisé. Dans cette étude, notre objectif est de mieux caractériser, lors de crises focales, la nature des changements hémodynamiques précoces dans la région homologue controlatérale au foyer épileptique. L'imagerie optique intrinsèque (IOI) et la microscopie deux-photons sont utilisées pour étudier les changements hémodynamiques dans la région homologue controlatérale au site de crises focales induites par l’injection de 4-aminopyridine (4-AP) dans le cortex somatosensitif ipsilatéral de souris. Dans l'étude d'IOI, des changements de l’oxyhémoglobine (HbO), de la désoxyhémoglobine (HbR) et du débit sanguin cérébral ont été observées dans la région homologue controlatérale au site de crises focales lors de toutes les crises. Toutefois, ces changements étaient hétérogènes, sans patron cohérent et reproduisible. Nos expériences avec la microscopie deux-photons n’ont pas révélé de changements hémodynamiques significatifs dans la région homotopique controlatérale lors de trains de pointes épileptiques. Nos résultats doivent être interprétés avec prudence compte tenu de plusieurs limitations: d’une part absence de mesures électrophysiologiques dans la région d’intérêt controlatérale au foyer simultanément à l’imagerie deux-photons et à l'IOI; d’autre part, lors des expériences avec le deux-photons, incapacité à générer de longues décharges ictales mais plutôt des trains de pointes, couverture spatiale limitée de la région d’intérêt controlatérale, et faible puissance suite au décès prématuré de plusieurs souris pour diverses raisons techniques. Nous terminons en discutant de divers moyens pour améliorer les expériences futures. / It has been well demonstrated that focal seizures are associated with a significant increase in regional cerebral blood flow to actively supply discharging neurons with oxygenated hemoglobin. There is also some evidence to suggest that focal seizures elicit early hemodynamic changes in the contralateral homotopic area, although this has been less well documented. In this study, we aim to better characterize the nature of early hemodynamic responses contralateral to the epileptic focus during seizures. We used intrinsic optical imaging (IOI) and two-photon laser microscopy to measure the hemodynamic changes in the homotopic contralateral area following focal seizures induced by an injection of 4-aminopyridine (4-AP) in the mouse somatosensory neocortex. In the study using IOI, oxyhemoglobin (HbO), deoxyhemoglobin (HbR) and cerebral blood flow (CBF) changes were observed in the homotopic area contralateral to the focus during all seizures. However, these changes were rather heterogenous, lacking any consistent or reproducible pattern. Our two-photon study showed no significant hemodynamic changes at the capillary level in the homotopic area contralateral to the ictal focus during epileptic spike trains. However, these findings must be interpreted cautiously in light of several limitations we encountered during the experiments. Specifically, we were unable to simultaneously record electrophysiology in the contralateral homotopic area. Furthermore, during our two-photon experiments, we failed to induce long ictal discharges (inducing only spike trains) had a limited sampling of the contralateral homotopic area and reduced power as a result of low mice survival rate. We conclude by providing alternatives to possibly improve future experiments.

Plusieurs décennies de recherche ont permis de mieux comprendre les effets de l’athérosclérose sur le système cardiovasculaire, d’améliorer la prévention et de développer des traitements efficaces. Les effets de l’athéroslérose sur le cerveau demeurent toutefois mal compris même si le lien entre le fonctionnement cognitif et la santé du système vasculaire est maintenant bien établi. La venue de nouvelles méthodes d’imagerie telle la microscopie laser à 2-photons (TPLM) permet d’étudier l’impact de certaines maladies sur la microvasculature cérébrale en mesurant le flux sanguin dans des vaisseaux uniques situés dans des régions cérébrales millimétriques sous la surface. Les résultats des études in vitro peuvent dorénavant être corrélés à ceux obtenus in vivo. En premier lieu, ce mémoire revoit la théorie ayant permis le développement de la TPLM qui permet de prendre des mesures hémodynamiques in vivo dans des vaisseaux de très petits calibres tels des capillaires cérébraux de souris. Par la suite, son utilisation est décrite chez des souris anesthésiées afin de comparer les mesures d’hémodynamie cérébrale tels la vitesse des globules rouges, le flux de globules rouges, le flux sanguin cérébral, l’hématocrite sanguin et le diamètre des vaisseaux. Finalement, nous avons comparé les données hémodynamiques entre des souris de 3 mois normales (WT ; n=6) et des souris atteintes d’athérosclérose précoce (ATX ; n=6). Les résultats obtenus sur un nombre total de 209 capillaires (103 pour les souris WT et 106 pour les souris ATX) démontrent que les souris ATX possèdent une vitesse des globules rouges (+40%) plus grande, un flux de globule rouge plus grand (+12%) et un flux capillaire plus élevé (+14%) sans démontrer pour aucun de ces paramètres, une différence statistiquement significative. L’hématocrite moyen (35±4% vs 33±2% ; p=0.71) et le diamètre moyen des vaisseaux (4.88±0.22μm vs 4.86±0.20μm ; p=0.23) étaient également comparables. La vitesse des globules rouges a démontré une faible corrélation avec le diamètre des vaisseaux (r=0.39) et avec le flux de globules rouges/seconde (r=0.59). En conclusion, les travaux menés dans le cadre de ce mémoire de maîtrise permettent d'envisager, grâce aux nouvelles méthodes d’imagerie cérébrale telle la TPLM, une meilleure compréhension des mécanismes hémodynamiques sous-jacents à la microcirculation cérébrale. L’effet d’une pression pulsée augmentée, tel que proposée dans l’athérosclérose reste cependant à démontrer avec cette méthode d’imagerie. / Many decades of research have given us a better understanding of the effects of atherosclerosis on different organs. For example, works on the cardiovascular effects of atherosclerosis have improved the prevention, screening and treatment resulting in a better prognosis. The effects of atherosclerosis on cerebral vessels are misunderstood even if the link between brain function and cerebral perfusion is well known. With the improvements in brain imaging, there are more possibilities to better define the physiopathology of brain perfusion and the impact of disease on cerebral microvasculature. First, this work reviews the theory behind the development of two-photon laser microscopy (TPLM) and the measure of hemodynamics in small vessels such as cerebral capillaries in mice. We also describe how we measured cerebral hemodynamics in anesthetized mice: red blood cell speed, red blood cell flux, blood hematocrit, and vessel diameter. We compared results obtained between normal mice (WT ; n=6) and pathological mice (ATX ; n=6), all aged 3 months old. ATX mice are well recognized to develop early atherosclerosis and served as a model for high pulse pressure. We measured 209 cerebral capillaries (103 on WT mice and 106 on ATX mice). ATX mice tend to show a trend toward a higher red blood cell speed (+40%), higher red blood cell flux (+12%) and higher capillary flux (+14%) in ATX mice. Mean hematocrit (35±4% vs 33±2% ; p=0.71) and mean vessel diameter (4.88±0.22μm vs 4.86±0.20μm ; p=0.23) were not statistically different between both groups. Red blood cell speed showed a weak correlation with vessel diameter (r=0.39) and red blood cell flux (r=0.59). In conclusion, the TPLM should permit a better understanding of the effect of vascular disease in cerebral hemodynamics. However, the effect of high pulse pressure on cerebral microvasculature needs to be better defined.

Actuellement, l'élaboration de matériaux nanohybrides organiques/inorganiques suscite l'engouement de nombreux chercheurs du fait de leurs diverses applications potentielles. Le but de ce projet de thèse a été de préparer et caractériser de nouveaux éléments inorganiques et organiques permettant la conception de nanohybrides multi-fonctionnels possédant des propriétés répondant aux problématiques actuelles. Dans cet objectif, nous avons préparé des nanoparticules d'oxyde de zinc (ZnO) en tant que composant inorganique par ablation laser. La surface de ces NPs peut être modifiée par des composés organiques possédant un groupe d'ancrage acide carboxylique. Nous avonssynthétisé et caractérisé des dérivés viologènes, bien connu comme de forts accepteurs d'électron, possédant le groupe d'ancrage. Les nanohybrides de ZnO/viologènes ont été préparés et caractérisés par diverses techniques de spectroscopie. Nous avons développé des voies de synthèse efficaces permettant d'obtenir une série de nouveaux hétérocycles possédant des propriétés de donneur d'électron : dérivés de dibenzo[2,3:5,6]pyrrolizino[1,7-bc]indolo[1,2,3-lm]carbazole. Ces nouvelles molécules présentent une forte stabilité thermique et une forte fluorescence dans le domaine du visible. Leurs propriétés d'absorption à un et deux photons (Proche-infrarouge) ainsi que leur habilité de donneur d'électron ont été étudiés expérimentalement et à l'aide de calculs de mécanique quantique. Les éléments organiques et inorganiques étudiés sont des motifs de choix pour l'élaboration future de nanohybrides utilisables pour diverses applications comme dans le domaine de l'énergie photovoltaïque ou encore l'imagerie médicale. / Currently, the development of organic/inorganic nanohybrid materials arouses the enthusiasm of many researchers owing to their potential applications. The aim of this thesis was to prepare and characterize new inorganic and organic components for the future design of new multi-functional nanohybrids with properties responding to the current challenges. For this purpose, we have prepared nanoparticles of zinc oxide (ZnO) as the inorganic component by laser ablation. The surface of these nanoparticles can be modified by an organic component bearing the carboxylic group as an anchor. We synthesized and characterized a number of viologen derivatives, well known as strong electron acceptors, involving the anchoring groups. The nanohybrids of ZnO/viologens were prepared and characterized by various spectroscopic techniques. We have developed efficient synthetic routes toward a series of new heterocycles possessing the electron donating properties: derivatives of dibenzo[2,3:5,6]pyrrolizino[1,7-bc]indolo[1,2,3-lm]carbazole. These new molecules exhibit high thermal stability and strong fluorescence in the visible range. Their one- and two-photon (Near-infrared) absorption properties and electron donor ability were investigated experimentally and by means of quantum mechanical calculations. The studied organic and inorganic components can serve as promising building blocks of choice for the future development of nanohybrids used in various application domains such as in the fields of photovoltaics and medical imaging.