Objetivo: Verificar o remodelamento da pele e produção de anticorpos em modelo experimental de esclerodermia em coelhos, após indução de tolerância nasal com colágeno tipo V. Métodos: Coelhas Nova Zelândia (N=12) foram imunizadas com 1mg/ml de colágeno V (Col V) em adjuvante completo de Freund e dois reforços com adjuvante incompleto de Freund. Seis coelhas imunizadas receberam uma dose diária de 25ug de Col V, iniciado via nasal (grupo tolerado) 150 dias do começo das imunizações e seis animais foram somente imunizadas (grupo imunizado). Um grupo imunizado com adjuvante de Freund serviu como controle. Biopsias de pele foram coletadas em 0, 75, 120, 150 e 210 dias e coradas pelo H&E, tricrômico de Masson e Sírius red para analise morfológica e morfométrica. Os colágenos I, III e V, além de TGFbeta e PDGF foram imunomarcados por imunofluorescência. Os soros dos animais foram coletados em 0, 150 e 210 dias para determinar anticorpos anti-colágenos I, III, IV e V e anti-nucleares. Resultados: Os animais imunizados mostraram progressivo decréscimo da derme papilar, atrofia de anexos, aumento no depósito dos colágenos I, III e V e aumento da expressão de TGFbeta e PDGF. Os tolerados apresentaram aumento dos anexos cutâneos e significante diminuição no depósito dos colágenos I, III e V, TGFbeta e PDGF. O grupo de imunizados e de tolerados apresentaram anticorpos anti-colágenos III e IV e antinucleares. Conclusões: A indução de tolerância nasal com Col V diminuiu o remodelamento da pele observado no modelo experimental de esclerodermia e inibiu a síntese de citocinas fibrogênicas. Portanto, a tolerância nasal com Col V pode ser uma opção terapêutica promissora para o controle do remodelamento cutâneo em pacientes com esclerodermia. / Objective: Our aim was to verify the skin remodeling and antibody production in experimental model of scleroderma in rabbits, after induction of tolerance by daily nasal administration of human type V collagen (Col V). Methods: Female New Zealand rabbits (N=12) were immunized with 1mg/ml of Col V in complete Freund\'s adjuvant, followed by more two boosters in incomplete Freund\'s adjuvant. Six immunized rabbits received daily nasal administrating of 25ug of Col V (tolerated group), started 150 days after the first immunization, and the others animals (N=6) were only immunized (immunized group). Finally a group of rabbits immunized with Freund\'s adjuvant served as control. Skin biopsies were collected at 0, 75, 120, 150 and 210 days, and stained with H&E, Masson\'s trichrome and Sirius red for morphological and morphometric analysis. Types I, III and V collagen, TGFbeta and PDGF were immunostained by immunofluorescence. The sera of animals were colleted at 0, 150 and 210 days to determine anti types I, III, IV and V collagen and antinuclear antibodies. Results: The immunized animals showed progressive decrease of papillary dermis, appendages atrophy, increase of types I, III and V collagen deposition and increased expression of TGF-beta and PDGF. The tolerated rabbits presented increase of cutaneous appendages and significant decrease of types I, III and V and TGF-beta and PDGF. Both immunized and tolerated rabbits presented anti types III and IV antibodies and antinuclear antibodies. Conclusions: Col V nasal tolerance reduced skin remodeling in experimental model of scleroderma and inhibited synthesis of fibrotic cytokines. Therefore, the nasal tolerance with type V collagen can be a promising therapeutic option to control the skin remodeling in patients with scleroderma.

Recentemente, descobrimos que coelhos, Nova Zelândia, imunizados com colágeno tipo V humano mais adjuvante de Freund apresentavam fibrose e vasculite de órgãos normalmente afetados na esclerose sistêmica. Deste modo, nós estudamos o processo de fibrilogênese para identificar possíveis fatores envolvidos na alteração do remodelamento observado neste modelo de esclerodermia. Adicionalmente, fizemos uma comparação preliminar com pele humana obtida de pacientes com esclerodermia (n=3). Coelhos fêmeas, Nova Zelândia (n=14), foram imunizados subcutaneamente com duas doses de 1mg de colágeno V mais adjuvante completo de Freund, com intervalo de 30 dias, seguido de duas imunizações em adjuvante incompleto de Freund, via intramuscular, com intervalo de 15 dias. Os animais do grupo controle (n- 14) foram inoculados somente com adjuvante completo e incompleto de Freund, nas mesmas condições dos imunizados. Foram realizadas análises histológicas das peles dos animais e pacientes através da coloração com tricrômico de Masson e imunofluorescêcia, a fim de detectar fibras de colágeno e interação dos colágenos I, III e V. A análise da pele dos animais demonstrou depósito precoce de fibras de colágeno na derme após 7 dias da sensibilização, com aumento destes depósitos após 75 e 120 dias respectivamente. Depósito de colágeno na pele e atrofia de anexos foram mais intensos nos animais sacrificados em 120 dias e se correlacionaram com a quantidade aumentada de colágeno. Surpreendentemente, o colágeno V foi expresso em animais e pacientes, formando fibras densas e atípicas na derme. Sugerimos que esta expressão anômala de colágeno V, morfologicamente diferente, possa justificar o remodelamento observado na placa esclerodérmica / Recently, we discovered that New Zealand rabbits immunized with human type V collagen plus Freund`s adjuvant presented fibrosis and vasculitis of organs usually affected in systemic sclerosis. In this way, we studied the fibrillogenesis process regarding to identify any possible factor involved in altered remodeling observed in this scleroderma-like model. Additionally, we done a very preliminary comparison with human skins obtained from scleroderma patients (N=3). Female New Zealand rabbits (N=14) were immunized subcutaneously with two doses of 1mg collagen V plus complete Freunds adjuvant at a 30 days interval, followed by two additional intramuscular booster immunizations in incomplete Freunds adjuvant at a 15-day interval. Animals from control group (N=14), were only inoculated with complete and incomplete Freunds adjuvant given at same conditions of collagen type V group. Histological analysis of skins from animals and patients were done by Massons trichrome staining, and immunofluorescence method used to detect collagen fibers and interactions of types I, III and V collagen in the remodeling process. The analysis of animal skins showed precocious collagen fibril deposits in the dermis after 7 days of immunization and increase of this process in 75 and 120 days. Skin collagen deposit and atrophy of annexes were progressively more intense in late sacrificed animals and correlated with increased amount of collagen deposition. Surprisingly, type V collagen was over expressed both in animals and patients, forming dense and atypical collagen fibers in the dermis. We suggest that this anomalous expression of morphologically different type V collagen could justify the remodeling observed in scleroderma plaque

Introdução: Recentemente muitas são as funções atribuídas ao colágeno V em condições fisiológicas normais e em algumas doenças, como na esclerodermia. Esta proteína apresenta características estruturais singulares de regulação do diâmetro das fibrilas heterotípicas, e imunogenicidade, sendo capaz de desencadear uma resposta imune independente. Em descobertas recentes, desenvolvidas por nosso grupo, ficou evidenciado que o colágeno V apresenta histoarquitetura anômala, aumentando a sua imunoexpressão na pele e pulmão em estágios iniciais da doença, assim como, aumento do RNAm de suas cadeias, principalmente alfa2(V). Por esta razão e com o intuito de entender sobre os processos moleculares e ultraestruturais que correlacionam o COL V à fibrose na ES, a proposta do presente estudo foi realizar análise morfológica e ultraestrutural das cadeias, alfa1(V) e alfa2(V), da pele de pacientes com ES, assim como avaliar a influência do gene COL5A2 na fibrilogênese. Pacientes e Métodos: As análises foram desenvolvidas utilizando fragmento de pele obtidas de biópsia, tanto de pacientes como controles, sob aprovação do comitê de ética (CAPPesq 0331/10) e de acordo com Declaração de Helsinque. Participaram do estudo 7 pacientes (homens=3, mulheres=4) diagnosticados com ES há dois anos ou menos, e indivíduos voluntários saudáveis (n=7) utilizados como grupo controle. A biópsia das peles foi dividida para dois grupos de análises: estudos histológicos e cultura de fibroblastos; sob solução de formol a 10%, foram realizadas análises histomorfométricas [coloração de Hematoxilina e Eosina (H e E), Tricrômico de Masson, imunofluorescência (IM) para cadeias alfa1(V) e alfa2(V), e reconstrução tridimensional (Zeiss LSM 510 META/UV)], e em solução de glutaraldeído 2% para análise ultraestrutural (microscopia eletrônica de transmissão com imunomarcação com ouro coloidal). A quantificação das cadeias foi realizada por histomorfometria, através de análise de imagem utilizando o software Image Pro-Plus 6.0. Já a cultura de fibroblastos foi desenvolvida para avaliar: distribuição e perfil das cadeias alfa1(V) e alfa2(V) [reconstrução 3D (Zeiss LSM 510 META/UV)],expressão gênica COL5A1, COL5A2 e ITGA2 [qRT-PCR (Applied Biosystems)], e inibição temporária do gene COL5A2. Resultados: Na análise morfológica (H&E e Masson) observou-se modificação da histoarquitetura da pele dos pacientes, com espessamento e retificação da epiderme devido ao aumento na densidade das fibras colágenas, com projeções das papilas dérmicas em direção à derme papilar. Esse resultado foi confirmado na quantificação das cadeias (IM), evidenciado por perda acentuada da cadeia alfa1(V) na derme papilar [12,77 ± 1,344 vs 66,84± 3,36 (p < 0,0001)] e aumento significante da expressão da cadeias alfa1(V) e alfa2(V) na derme reticular alfa1(V) [7,657 ± 0,2133 vs 13,75 ± 0,958 ( p < 0,0001)] e alfa2(V) [5,072 ± 0,4117 vs 21,07 ± 0,790 (p=0,001)] dos pacientes quando comparados ao controle. Assim como visto na imunomarcação com ouro coloidal das cadeias do COLV, houve ausência de expressão linear da cadeia alfa1(V) na derme papilar, contrastando com a expressão da mesma na pele de controles, se contrapondo a forte imunoexpressão das cadeias alfa1(V) e alfa2(V) com uma maior evidência da cadeia alfa2(V) na região espessada pela junção lâmina basal e derme reticular. A reconstrução 3D em cultura de fibroblastos dérmicos demonstrou grande atividade das células de pacientes com ES, confirmado na expressão gênica dos COL5A1, COL5A2 e ITGA2, que se mostraram aumentados significantemente nos pacientes em relação ao controle. Por fim, após inibição do COL5A2 houve uma tendência ao aumento na expressão do COL5A1, e superexpressão da ITGA2. Conclusão: A alteração dérmica observada em pacientes com ES esta correlacionada com a modificação na distribuição das cadeias alfas do COLV, principalmente por perda acentuada da alfa1(V)3 homotrímera na derme papilar e superexpressão da alfa2(V) em capilares e vasos, interferindo na formação de matriz extracelular normal, sugerindo uma alteração pós traducional desta proteína, e que maiores estudos sobre a inibição da cadeia alfa2(V) são importantes para uma futura terapia gênica para atenuar os sintomas desencadeados nesta patologia / Introduction: Recently many functions are attributed to type V collagen in normal physiological conditions and in some diseases, such as scleroderma. This protein presents unique structural features for regulating the diameter of fibrils heterotypic and immunogenicity being capable of eliciting an immune response independent. In recent discoveries, developed by our group, it was evident that collagen V presents anomalous histoarchitecture, increasing the immunoexpression in the skin and lung in the early stages of the disease, as well as increased mRNA of his chains, mainly alpha2(V). For this reason and in order to understand the molecular and ultrastructural processes that correlate COL V fibrosis in SSc, the purpose of this study was to perform morphological and ultrastructural analysis of the chains alpha1(V) and alpha2(V) of the patient´s skin with ES, as well as to assess the influence of the COL5A2 gene in fibrillogenesis. Patients and Methods: The analyses were developed using skin fragment obtained from biopsy, both of patients and controls, under the approval of the ethics committee (CAPPesq 0331/10) and in accordance with the Declaration of Helsinki. The study included 7 patients (male = 3, female = 4) diagnosed with ES for two years or less, and healthy volunteers (n = 7) used as a control group. The biopsy of the skin was divided in two groups of analyzes: histological studies and cultured fibroblasts; Under formaldehyde solution 10%, histomorphometric analysis [staining with hematoxylin and eosin (H e E), Masson\'s trichrome, immunofluorescence (IM) to alpha1(V) and alpha2(V) chains, and three-dimensional reconstruction (Zeiss LSM 510 META were performed/UV), and in a solution of 2% glutaraldehyde for ultrastructural analysis (transmission electron microscopy with immunostaining with colloidal gold). Quantitation was performed by the chain histomorphometry by image analysis using Image Pro-Plus 6.0 software. Already a fibroblast culture was developed to assess: distribution and profile of the alpha1(V) and alpha2(V) chains, 3D reconstruction (Zeiss LSM 510 META / UV), gene expression of COL5A1, COL5A2 and ITGA2 [RT-qPCR (Applied Biosystems)], and temporary inhibition of the COL5A2 gene. Results: In the morphological analysis (H&E and Masson) was observed modification of histoarchitecture patient\'s skin, with thickening and rectification of the epidermis due to increased density of collagen fibers, with projections of dermal papillae toward the papillary dermis. This result was confirmed by quantification of the chains (IM), evidenced by marked loss of the alpha1(V) chain in the papillary dermis [12.77 ± 1.344 vs 66.84 ± 3.36 (p < 0.0001)] and significant increase in the expression of alpha1(V) and alpha2(V) chains, in the reticular dermis alpha1(V) chain [0.2133 ± 7.657 vs 0.958 ± 13.75 (p < 0.0001)] alfa2(V) chain [5.072 ± 0.4117 vs 21.07 ± 0.790 (p = 0.001)] of patients when compared to control. As seen in the immunostaining with colloidal gold chains of COLV, there was no linear expression of the alpha1(V) chain in the papillary dermis, contrasting with the same expression on the skin of controls, in contrast to strong immunoexpression of alpha1(V) and alpha2(V) chains, with a higher evidence of alpha2(V) chain in the junction region by a thickened basement membrane and reticular dermis. The 3D reconstruction of dermal fibroblasts in culture demonstrated large cell activity of patients with SSc, confirmed the gene expression of COL5A1, COL5A2 and ITGA2, which showed significantly increased in patients compared to control. Finally, after inhibition of COL5A2 there was a trend to increase in the expression of the COL5A1, and overexpression of ITGA2. Conclusion: The dermal alteration observed in SSc patients is correlated with the change in the distribution of the collagen alpha (V) chains, mainly by marked loss of alpha1(V)3 homotrimer the papillary dermis and overexpression of the alpha2(V) in capillaries and vessels, interfering with the normal extracellular matrix formation, suggesting a post-translational modification of this protein, and further studies on the inhibition of chain alpha2(V) are important for future gene therapy to attenuate the symptoms of this pathology triggered

Recentemente, descobrimos que coelhos, Nova Zelândia, imunizados com colágeno tipo V humano mais adjuvante de Freund apresentavam fibrose e vasculite de órgãos normalmente afetados na esclerose sistêmica. Deste modo, nós estudamos o processo de fibrilogênese para identificar possíveis fatores envolvidos na alteração do remodelamento observado neste modelo de esclerodermia. Adicionalmente, fizemos uma comparação preliminar com pele humana obtida de pacientes com esclerodermia (n=3). Coelhos fêmeas, Nova Zelândia (n=14), foram imunizados subcutaneamente com duas doses de 1mg de colágeno V mais adjuvante completo de Freund, com intervalo de 30 dias, seguido de duas imunizações em adjuvante incompleto de Freund, via intramuscular, com intervalo de 15 dias. Os animais do grupo controle (n- 14) foram inoculados somente com adjuvante completo e incompleto de Freund, nas mesmas condições dos imunizados. Foram realizadas análises histológicas das peles dos animais e pacientes através da coloração com tricrômico de Masson e imunofluorescêcia, a fim de detectar fibras de colágeno e interação dos colágenos I, III e V. A análise da pele dos animais demonstrou depósito precoce de fibras de colágeno na derme após 7 dias da sensibilização, com aumento destes depósitos após 75 e 120 dias respectivamente. Depósito de colágeno na pele e atrofia de anexos foram mais intensos nos animais sacrificados em 120 dias e se correlacionaram com a quantidade aumentada de colágeno. Surpreendentemente, o colágeno V foi expresso em animais e pacientes, formando fibras densas e atípicas na derme. Sugerimos que esta expressão anômala de colágeno V, morfologicamente diferente, possa justificar o remodelamento observado na placa esclerodérmica / Recently, we discovered that New Zealand rabbits immunized with human type V collagen plus Freund`s adjuvant presented fibrosis and vasculitis of organs usually affected in systemic sclerosis. In this way, we studied the fibrillogenesis process regarding to identify any possible factor involved in altered remodeling observed in this scleroderma-like model. Additionally, we done a very preliminary comparison with human skins obtained from scleroderma patients (N=3). Female New Zealand rabbits (N=14) were immunized subcutaneously with two doses of 1mg collagen V plus complete Freunds adjuvant at a 30 days interval, followed by two additional intramuscular booster immunizations in incomplete Freunds adjuvant at a 15-day interval. Animals from control group (N=14), were only inoculated with complete and incomplete Freunds adjuvant given at same conditions of collagen type V group. Histological analysis of skins from animals and patients were done by Massons trichrome staining, and immunofluorescence method used to detect collagen fibers and interactions of types I, III and V collagen in the remodeling process. The analysis of animal skins showed precocious collagen fibril deposits in the dermis after 7 days of immunization and increase of this process in 75 and 120 days. Skin collagen deposit and atrophy of annexes were progressively more intense in late sacrificed animals and correlated with increased amount of collagen deposition. Surprisingly, type V collagen was over expressed both in animals and patients, forming dense and atypical collagen fibers in the dermis. We suggest that this anomalous expression of morphologically different type V collagen could justify the remodeling observed in scleroderma plaque

Objetivo: Verificar o remodelamento da pele e produção de anticorpos em modelo experimental de esclerodermia em coelhos, após indução de tolerância nasal com colágeno tipo V. Métodos: Coelhas Nova Zelândia (N=12) foram imunizadas com 1mg/ml de colágeno V (Col V) em adjuvante completo de Freund e dois reforços com adjuvante incompleto de Freund. Seis coelhas imunizadas receberam uma dose diária de 25ug de Col V, iniciado via nasal (grupo tolerado) 150 dias do começo das imunizações e seis animais foram somente imunizadas (grupo imunizado). Um grupo imunizado com adjuvante de Freund serviu como controle. Biopsias de pele foram coletadas em 0, 75, 120, 150 e 210 dias e coradas pelo H&E, tricrômico de Masson e Sírius red para analise morfológica e morfométrica. Os colágenos I, III e V, além de TGFbeta e PDGF foram imunomarcados por imunofluorescência. Os soros dos animais foram coletados em 0, 150 e 210 dias para determinar anticorpos anti-colágenos I, III, IV e V e anti-nucleares. Resultados: Os animais imunizados mostraram progressivo decréscimo da derme papilar, atrofia de anexos, aumento no depósito dos colágenos I, III e V e aumento da expressão de TGFbeta e PDGF. Os tolerados apresentaram aumento dos anexos cutâneos e significante diminuição no depósito dos colágenos I, III e V, TGFbeta e PDGF. O grupo de imunizados e de tolerados apresentaram anticorpos anti-colágenos III e IV e antinucleares. Conclusões: A indução de tolerância nasal com Col V diminuiu o remodelamento da pele observado no modelo experimental de esclerodermia e inibiu a síntese de citocinas fibrogênicas. Portanto, a tolerância nasal com Col V pode ser uma opção terapêutica promissora para o controle do remodelamento cutâneo em pacientes com esclerodermia. / Objective: Our aim was to verify the skin remodeling and antibody production in experimental model of scleroderma in rabbits, after induction of tolerance by daily nasal administration of human type V collagen (Col V). Methods: Female New Zealand rabbits (N=12) were immunized with 1mg/ml of Col V in complete Freund\'s adjuvant, followed by more two boosters in incomplete Freund\'s adjuvant. Six immunized rabbits received daily nasal administrating of 25ug of Col V (tolerated group), started 150 days after the first immunization, and the others animals (N=6) were only immunized (immunized group). Finally a group of rabbits immunized with Freund\'s adjuvant served as control. Skin biopsies were collected at 0, 75, 120, 150 and 210 days, and stained with H&E, Masson\'s trichrome and Sirius red for morphological and morphometric analysis. Types I, III and V collagen, TGFbeta and PDGF were immunostained by immunofluorescence. The sera of animals were colleted at 0, 150 and 210 days to determine anti types I, III, IV and V collagen and antinuclear antibodies. Results: The immunized animals showed progressive decrease of papillary dermis, appendages atrophy, increase of types I, III and V collagen deposition and increased expression of TGF-beta and PDGF. The tolerated rabbits presented increase of cutaneous appendages and significant decrease of types I, III and V and TGF-beta and PDGF. Both immunized and tolerated rabbits presented anti types III and IV antibodies and antinuclear antibodies. Conclusions: Col V nasal tolerance reduced skin remodeling in experimental model of scleroderma and inhibited synthesis of fibrotic cytokines. Therefore, the nasal tolerance with type V collagen can be a promising therapeutic option to control the skin remodeling in patients with scleroderma.

Introdução: Recentemente muitas são as funções atribuídas ao colágeno V em condições fisiológicas normais e em algumas doenças, como na esclerodermia. Esta proteína apresenta características estruturais singulares de regulação do diâmetro das fibrilas heterotípicas, e imunogenicidade, sendo capaz de desencadear uma resposta imune independente. Em descobertas recentes, desenvolvidas por nosso grupo, ficou evidenciado que o colágeno V apresenta histoarquitetura anômala, aumentando a sua imunoexpressão na pele e pulmão em estágios iniciais da doença, assim como, aumento do RNAm de suas cadeias, principalmente alfa2(V). Por esta razão e com o intuito de entender sobre os processos moleculares e ultraestruturais que correlacionam o COL V à fibrose na ES, a proposta do presente estudo foi realizar análise morfológica e ultraestrutural das cadeias, alfa1(V) e alfa2(V), da pele de pacientes com ES, assim como avaliar a influência do gene COL5A2 na fibrilogênese. Pacientes e Métodos: As análises foram desenvolvidas utilizando fragmento de pele obtidas de biópsia, tanto de pacientes como controles, sob aprovação do comitê de ética (CAPPesq 0331/10) e de acordo com Declaração de Helsinque. Participaram do estudo 7 pacientes (homens=3, mulheres=4) diagnosticados com ES há dois anos ou menos, e indivíduos voluntários saudáveis (n=7) utilizados como grupo controle. A biópsia das peles foi dividida para dois grupos de análises: estudos histológicos e cultura de fibroblastos; sob solução de formol a 10%, foram realizadas análises histomorfométricas [coloração de Hematoxilina e Eosina (H e E), Tricrômico de Masson, imunofluorescência (IM) para cadeias alfa1(V) e alfa2(V), e reconstrução tridimensional (Zeiss LSM 510 META/UV)], e em solução de glutaraldeído 2% para análise ultraestrutural (microscopia eletrônica de transmissão com imunomarcação com ouro coloidal). A quantificação das cadeias foi realizada por histomorfometria, através de análise de imagem utilizando o software Image Pro-Plus 6.0. Já a cultura de fibroblastos foi desenvolvida para avaliar: distribuição e perfil das cadeias alfa1(V) e alfa2(V) [reconstrução 3D (Zeiss LSM 510 META/UV)],expressão gênica COL5A1, COL5A2 e ITGA2 [qRT-PCR (Applied Biosystems)], e inibição temporária do gene COL5A2. Resultados: Na análise morfológica (H&E e Masson) observou-se modificação da histoarquitetura da pele dos pacientes, com espessamento e retificação da epiderme devido ao aumento na densidade das fibras colágenas, com projeções das papilas dérmicas em direção à derme papilar. Esse resultado foi confirmado na quantificação das cadeias (IM), evidenciado por perda acentuada da cadeia alfa1(V) na derme papilar [12,77 ± 1,344 vs 66,84± 3,36 (p < 0,0001)] e aumento significante da expressão da cadeias alfa1(V) e alfa2(V) na derme reticular alfa1(V) [7,657 ± 0,2133 vs 13,75 ± 0,958 ( p < 0,0001)] e alfa2(V) [5,072 ± 0,4117 vs 21,07 ± 0,790 (p=0,001)] dos pacientes quando comparados ao controle. Assim como visto na imunomarcação com ouro coloidal das cadeias do COLV, houve ausência de expressão linear da cadeia alfa1(V) na derme papilar, contrastando com a expressão da mesma na pele de controles, se contrapondo a forte imunoexpressão das cadeias alfa1(V) e alfa2(V) com uma maior evidência da cadeia alfa2(V) na região espessada pela junção lâmina basal e derme reticular. A reconstrução 3D em cultura de fibroblastos dérmicos demonstrou grande atividade das células de pacientes com ES, confirmado na expressão gênica dos COL5A1, COL5A2 e ITGA2, que se mostraram aumentados significantemente nos pacientes em relação ao controle. Por fim, após inibição do COL5A2 houve uma tendência ao aumento na expressão do COL5A1, e superexpressão da ITGA2. Conclusão: A alteração dérmica observada em pacientes com ES esta correlacionada com a modificação na distribuição das cadeias alfas do COLV, principalmente por perda acentuada da alfa1(V)3 homotrímera na derme papilar e superexpressão da alfa2(V) em capilares e vasos, interferindo na formação de matriz extracelular normal, sugerindo uma alteração pós traducional desta proteína, e que maiores estudos sobre a inibição da cadeia alfa2(V) são importantes para uma futura terapia gênica para atenuar os sintomas desencadeados nesta patologia / Introduction: Recently many functions are attributed to type V collagen in normal physiological conditions and in some diseases, such as scleroderma. This protein presents unique structural features for regulating the diameter of fibrils heterotypic and immunogenicity being capable of eliciting an immune response independent. In recent discoveries, developed by our group, it was evident that collagen V presents anomalous histoarchitecture, increasing the immunoexpression in the skin and lung in the early stages of the disease, as well as increased mRNA of his chains, mainly alpha2(V). For this reason and in order to understand the molecular and ultrastructural processes that correlate COL V fibrosis in SSc, the purpose of this study was to perform morphological and ultrastructural analysis of the chains alpha1(V) and alpha2(V) of the patient´s skin with ES, as well as to assess the influence of the COL5A2 gene in fibrillogenesis. Patients and Methods: The analyses were developed using skin fragment obtained from biopsy, both of patients and controls, under the approval of the ethics committee (CAPPesq 0331/10) and in accordance with the Declaration of Helsinki. The study included 7 patients (male = 3, female = 4) diagnosed with ES for two years or less, and healthy volunteers (n = 7) used as a control group. The biopsy of the skin was divided in two groups of analyzes: histological studies and cultured fibroblasts; Under formaldehyde solution 10%, histomorphometric analysis [staining with hematoxylin and eosin (H e E), Masson\'s trichrome, immunofluorescence (IM) to alpha1(V) and alpha2(V) chains, and three-dimensional reconstruction (Zeiss LSM 510 META were performed/UV), and in a solution of 2% glutaraldehyde for ultrastructural analysis (transmission electron microscopy with immunostaining with colloidal gold). Quantitation was performed by the chain histomorphometry by image analysis using Image Pro-Plus 6.0 software. Already a fibroblast culture was developed to assess: distribution and profile of the alpha1(V) and alpha2(V) chains, 3D reconstruction (Zeiss LSM 510 META / UV), gene expression of COL5A1, COL5A2 and ITGA2 [RT-qPCR (Applied Biosystems)], and temporary inhibition of the COL5A2 gene. Results: In the morphological analysis (H&E and Masson) was observed modification of histoarchitecture patient\'s skin, with thickening and rectification of the epidermis due to increased density of collagen fibers, with projections of dermal papillae toward the papillary dermis. This result was confirmed by quantification of the chains (IM), evidenced by marked loss of the alpha1(V) chain in the papillary dermis [12.77 ± 1.344 vs 66.84 ± 3.36 (p < 0.0001)] and significant increase in the expression of alpha1(V) and alpha2(V) chains, in the reticular dermis alpha1(V) chain [0.2133 ± 7.657 vs 0.958 ± 13.75 (p < 0.0001)] alfa2(V) chain [5.072 ± 0.4117 vs 21.07 ± 0.790 (p = 0.001)] of patients when compared to control. As seen in the immunostaining with colloidal gold chains of COLV, there was no linear expression of the alpha1(V) chain in the papillary dermis, contrasting with the same expression on the skin of controls, in contrast to strong immunoexpression of alpha1(V) and alpha2(V) chains, with a higher evidence of alpha2(V) chain in the junction region by a thickened basement membrane and reticular dermis. The 3D reconstruction of dermal fibroblasts in culture demonstrated large cell activity of patients with SSc, confirmed the gene expression of COL5A1, COL5A2 and ITGA2, which showed significantly increased in patients compared to control. Finally, after inhibition of COL5A2 there was a trend to increase in the expression of the COL5A1, and overexpression of ITGA2. Conclusion: The dermal alteration observed in SSc patients is correlated with the change in the distribution of the collagen alpha (V) chains, mainly by marked loss of alpha1(V)3 homotrimer the papillary dermis and overexpression of the alpha2(V) in capillaries and vessels, interfering with the normal extracellular matrix formation, suggesting a post-translational modification of this protein, and further studies on the inhibition of chain alpha2(V) are important for future gene therapy to attenuate the symptoms of this pathology triggered

Le Syndrome d’Ehlers-Danlos classique (EDSc) est une maladie génétique du tissu conjonctif lié, dans 90% des cas, à des mutations sur les gènes du collagène V (COLV). Elle se caractérise par une peau fine, vulnérable et hyper-extensible, des défauts de cicatrisation et une hypermobilité articulaire. Afin d’établir un lien entre le génotype et le tableau clinique des patients, j’ai étudié l’impact de mutations identifiées sur le N-propeptide de la chaine α1 de COLV, particulièrement la mutation S254L associée à un syndrome chevauchant EDSC/UCMD (Dystrophie Musculaire Congénitale d’Ullrich), sur la maturation de COLV, la production et l’organisation de la matrice extracellulaire (MEC), et sur l’intégrité et la fonction des fibroblastes du derme.J’ai ainsi montré que seule la mutation S254L abolit le clivage BMP-1 du N-propeptide, étape importante de la maturation de COLV. Le COLV muté est normalement sécrété dans la MEC qui va toutefois présenter une organisation anarchique des fibres de collagène et du réseau de collagène VI. À l’aide de tests de blessure sur couche cellulaire, j’ai observé que les fibroblastes EDSc (fb/EDSc) et S254L (fb/SL) ont un niveau de cicatrisation inférieur à celui observé chez les fibroblastes sains (fb/WT). Ce défaut de recouvrement est associé à des défauts de migration et à un plus faible niveau de prolifération. De plus, les fb/SL ont une surface d’adhésion inférieure à celle des fb/WT. J’ai également observé une augmentation du flux autophagique chez les fb/EDSc et fb/SL par rapport aux fb/WT. L’autophagie des fb/SL, contrairement au fb/EDSc, n’est pas associée à un stress du réticulum endoplasmique mais à la mitophagie, un mécanisme permettant la dégradation spécifique des mitochondries qui sont altérées chez les fb/SL.Mon étude portant sur les mutations du N-propeptide a ainsi permis de caractériser certains des processus biologiques associés à la pathogénèse de l’EDSc et ceux spécifiquement liée au syndrome chevauchant EDS/UCMD. / Classic Ehlers-Danlos syndrome is a heritable connective tissue disorder, characterized by fragile and hyperextensible skin, and joint hypermobility. 90% of patients harboured a mutation in the COL5A1 gene, which encode the pro α1(V) chain of the collagen V, that could assemble with the pro α2(V) chain to form the predominant isoform of collagen V, the heterotrimer α1(V) ₂ α2(V). This isoform is expressed in bones, skin and tendons and is able to control collagen fibrillogenesis. Here we described for the first time a mutation, localized in the BMP-1 cleavage site on the α1(V) chain in a patient exhibiting muscular contractures and weakness, an abnormal skin and problems with nerve conductions, which could remind an UCMD pathology, which is normally due to mutations in the collagen VI molecule. We first showed that this new mutation totally abolished the maturation of the pro α1(V) chain by the BMP-1 enzyme but didn’t affect the secretion of the collagen V in the ECM. Analysis of fibroblasts from this patient showed that the collagen V is secreted but that the collagen fibrils are not correctly organized in the ECM of the cells. Our analysis also revealed that fibroblasts migration is affected, compared to wild-type cells and that number, area and length of vinculin-containing focal adhesion are reduced. Interestingly, there is an increase of the autophagic flux in those cells, associated with mitophagy but without ER stress. These data highlight that a mutation in the COL5A1 gene could leads to a new pathology in which skin, muscle and nerves are affected.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Rationale: Tissue remodeling and complement activation are asthma hallmarks. Type V collagen [col(V)], a cryptic antigen, becomes exposed during lung remodeling. IL-17 is key to anti-col(V) immunity, and regulates complement activation. We have reported that col(V)-induced tolerance down regulates IL-17 and prevents immune-mediated lung diseases. Objectives: Determine a role for anti-col(V) immunity in asthma. Methods: Serum anti-col(V) antibodies were measured in asthma patients, and immunohistochemistry utilized to detect interstitial col(V) in fatal asthma. Balb/c mice were tolerized with col(V) prior to sensitization with ovalbumin (OVA), and subsequent OVA intranasal challenge. Airway hyper-responsiveness (AHR) to methacholine was measured; and RT-PCR utilized to determine local Il17 transcripts. Bronchoalveolar lavage levels of C3a¸ C5a and OVA-specific IgE were measured; and immunohistochemistry utilized to detect expression of complement regulatory proteins, expression, CD46/Crry and CD55, in lung tissue. Results: Compared to normal subjects, anti-col(V) antibodies were increased in asthmatics; and interstitial col(V) was over expressed in fatal asthma. OVA-induced AHR up regulated anti-col(V) antibodies systemically, and increased OVA-specific IgE and C3a in BAL, and parenchymal Il17 transcripts. Col(V)-induced tolerance abrogated AHR, down regulated OVA-induced T cell proliferation, as well as total and OVA-specific IgE, C3a, IL-17 expression and tracheal smooth muscle contraction. Crry/CD46 and CD55, key to preventing complement activation, were down regulated on goblet cells in murine allergic airway disease. Conclusions: Anti-col(V) immunity correlates with asthma pathogenesis, and col(V)-induced tolerance may be a novel therapeutic for asthma. Decreased expression of Crry/CD46 and CD55 on goblet cells may in part account for complement activation in asthma.

O colágeno V vem emergindo como um potente indutor de morte celular (apoptose) via caspase. Nosso objetivo, neste estudo, foi examinar a interface entre o colágeno dos tipos I, III e V, apoptose tumoral e endotelial, angiogênese e células imunes, assim como o impacto desses fatores no prognóstico de pacientes com carcinomas não de pequenas células (CNPC) de pulmão. As amostras foram obtidas de 65 pacientes com CNPC de pulmão cirurgicamente excisados. Foram utilizados imunofluorescência e histomorfometria para colágenos I, III e V; imunohistoquímica e histomorfometria para avaliar apoptose endotelial e epitelial pelas caspases 5, 6, 8, 9 e via TUNEL, antiapoptose pela expressão do Bcl-2 e Bcl-6, densidade microvascular utilizando CD34, atividade vascular através da endotelina, VCAM e CD54, além da laminina. As células imunes foram imunomarcadas pelo CD3, CD4, CD8, CD20, CD56 Cd1a, S100, CD68 e as seguintes citocinas foram quantificadas: IL-4, IL-6, IL-8 e TGF-. O modelo de sobrevida de Cox mostrou que, quando controlados pelo estadiamento patológico linfonodal N, somente o colágeno do tipo V e a apoptose endotelial via caspase-9 foram significativamente associados com a sobrevida. Uma medida de corte ao nível da mediana para o colágeno do tipo V e caspase-9 dividiu os pacientes em dois grupos distintos de prognóstico. Aqueles com colágeno V maior do que 9,40% e apoptose vascular maior que 1,09% apresentaram baixo risco de morte (0,27 e 0,41, respectivamente), comparados com aqueles com colágeno V inferior a 9,40% e apoptose vascular inferior a 1,09%. Foi observada também menor densidade de células imunes e citocinas no microambiente tumoral do que não tumoral. O modelo de sobrevida de Cox, associando todas as variáveis estudadas, mostrou que baixo risco de morte associou-se com tabagismo menor que 41 maços/ano, estadiamento linfonodal N0, tratamento cirúrgico, ao tipo histológico carcinoma de células escamosas, fração de linfócitos CD4 > 16,2%, macrófagos CD68 > 4,5%, citocina IL-4 > 0,8%, citocina IL-6 > 2,2%, células dendríticas Cd1a > 1,6% e colágeno V > 9,4%. Coletivamente, os dados indicaram que o CNPC de pulmão não desencadeou uma resposta imune efetiva no sítio tumoral. Além disso, baixa síntese no colágeno V e apoptose endotelial pela caspase-9 em CNPC de pulmão estão fortemente associadas à sobrevida, sugerindo que estratégias destinadas a prevenir a baixa síntese de colágeno V, baixos índices de apoptose e resposta imune inata e adaptativa têm impacto no prognóstico dos CNPC de pulmão e podem ser marcadores promissores em novas abordagens na imunoterapia, podendo, assim, ter grande impacto no tratamento do câncer de pulmão / Type V collagen emerging promise as inductor of death response (apoptosis) via caspase. Our aim was to verify the remodeling of the microenvironment by type V collagen, tumoral/vascular apoptosis, angiogenesis, immune response and their impact on prognosis of patients with non-small cell lung carcinomas (NSCLC). Collagen, apoptosis, angiogenesis and immune cells were examined in tumor tissues from 65 patients with surgically excised NSCLC. We used immunofluoresce, immunohistochemistry, morphometry, 3D reconstruction and real-time PCR to evaluate the amount, structure and mRNA chains expression of type V collagen, endothelium and epithelial apoptosis caspases 5, 6, 8, 9 and via TUNEL; anti-apoptotic expression Bcl-2 and Bcl-6; immune cells CD3, CD4, CD8, CD20, CD56 Cd1a, S100 and CD68 and IL-4, IL-6, IL-8 e TGF- cytokines; microvessel density (CD34) and vascular activity by endotelin, V-CAM and Cd54. Impact of these markers was tested on follow-up until death from recurrent lung cancer. Decreased and abnormal synthesis of collagen V leads to increased angiogenesis by low endothelial death rate, and low immune response. Cox model analysis demonstrated that controlled for N stage, just two variables were significantly associated with survival time: collagen V and endothelium apoptosis caspase 9 +. Once these two variables were accounted for, none of the others related to survival. A cutpoint at the median for collagen V and endothelium apoptosis caspase 9 divided patients into two groups with distinctive prognosis. Those with collagen V > 9.40% and endothelium apoptosis caspase 9 > 1.09% have low risk of death (0.27 and 0.41, respectively) than those with collagen V < 9.40% and endothelium apoptosis caspase 9 + < 1.09%.In addition low levels of immune cells and cytokines in the tumour environment when compared with non-tumour environment. Cox model analysis with all variables showed low risk of death for tabagism < 41 packs/year, N0 stage, SCC, CD4+ > 16.81%,macrophages/monocytes > 4.5%cytokine IL-4 > 0,8%, cytokines IL-6 > 2,2%, dendritic cells Cd1a > 1,6% and collagen V > 9,4%. Collectively, the data indicated that NSCLC did not trigger a substantive immune cell infiltrate at tumour sites. More over Collagen V and endothelium apoptosis caspase 9 + in resected NSCLC are strongly related to prognosis, suggesting that strategies aimed at preventing the low collagen V synthesis, or local responses to low endothelium apoptosis and immune cell infiltration has impact on NSCLC prognosis and may be a promising marker for new immunotherapeutic approaches and may have a greater impact in lung cancer

O colágeno V vem emergindo como um potente indutor de morte celular (apoptose) via caspase. Nosso objetivo, neste estudo, foi examinar a interface entre o colágeno dos tipos I, III e V, apoptose tumoral e endotelial, angiogênese e células imunes, assim como o impacto desses fatores no prognóstico de pacientes com carcinomas não de pequenas células (CNPC) de pulmão. As amostras foram obtidas de 65 pacientes com CNPC de pulmão cirurgicamente excisados. Foram utilizados imunofluorescência e histomorfometria para colágenos I, III e V; imunohistoquímica e histomorfometria para avaliar apoptose endotelial e epitelial pelas caspases 5, 6, 8, 9 e via TUNEL, antiapoptose pela expressão do Bcl-2 e Bcl-6, densidade microvascular utilizando CD34, atividade vascular através da endotelina, VCAM e CD54, além da laminina. As células imunes foram imunomarcadas pelo CD3, CD4, CD8, CD20, CD56 Cd1a, S100, CD68 e as seguintes citocinas foram quantificadas: IL-4, IL-6, IL-8 e TGF-. O modelo de sobrevida de Cox mostrou que, quando controlados pelo estadiamento patológico linfonodal N, somente o colágeno do tipo V e a apoptose endotelial via caspase-9 foram significativamente associados com a sobrevida. Uma medida de corte ao nível da mediana para o colágeno do tipo V e caspase-9 dividiu os pacientes em dois grupos distintos de prognóstico. Aqueles com colágeno V maior do que 9,40% e apoptose vascular maior que 1,09% apresentaram baixo risco de morte (0,27 e 0,41, respectivamente), comparados com aqueles com colágeno V inferior a 9,40% e apoptose vascular inferior a 1,09%. Foi observada também menor densidade de células imunes e citocinas no microambiente tumoral do que não tumoral. O modelo de sobrevida de Cox, associando todas as variáveis estudadas, mostrou que baixo risco de morte associou-se com tabagismo menor que 41 maços/ano, estadiamento linfonodal N0, tratamento cirúrgico, ao tipo histológico carcinoma de células escamosas, fração de linfócitos CD4 > 16,2%, macrófagos CD68 > 4,5%, citocina IL-4 > 0,8%, citocina IL-6 > 2,2%, células dendríticas Cd1a > 1,6% e colágeno V > 9,4%. Coletivamente, os dados indicaram que o CNPC de pulmão não desencadeou uma resposta imune efetiva no sítio tumoral. Além disso, baixa síntese no colágeno V e apoptose endotelial pela caspase-9 em CNPC de pulmão estão fortemente associadas à sobrevida, sugerindo que estratégias destinadas a prevenir a baixa síntese de colágeno V, baixos índices de apoptose e resposta imune inata e adaptativa têm impacto no prognóstico dos CNPC de pulmão e podem ser marcadores promissores em novas abordagens na imunoterapia, podendo, assim, ter grande impacto no tratamento do câncer de pulmão / Type V collagen emerging promise as inductor of death response (apoptosis) via caspase. Our aim was to verify the remodeling of the microenvironment by type V collagen, tumoral/vascular apoptosis, angiogenesis, immune response and their impact on prognosis of patients with non-small cell lung carcinomas (NSCLC). Collagen, apoptosis, angiogenesis and immune cells were examined in tumor tissues from 65 patients with surgically excised NSCLC. We used immunofluoresce, immunohistochemistry, morphometry, 3D reconstruction and real-time PCR to evaluate the amount, structure and mRNA chains expression of type V collagen, endothelium and epithelial apoptosis caspases 5, 6, 8, 9 and via TUNEL; anti-apoptotic expression Bcl-2 and Bcl-6; immune cells CD3, CD4, CD8, CD20, CD56 Cd1a, S100 and CD68 and IL-4, IL-6, IL-8 e TGF- cytokines; microvessel density (CD34) and vascular activity by endotelin, V-CAM and Cd54. Impact of these markers was tested on follow-up until death from recurrent lung cancer. Decreased and abnormal synthesis of collagen V leads to increased angiogenesis by low endothelial death rate, and low immune response. Cox model analysis demonstrated that controlled for N stage, just two variables were significantly associated with survival time: collagen V and endothelium apoptosis caspase 9 +. Once these two variables were accounted for, none of the others related to survival. A cutpoint at the median for collagen V and endothelium apoptosis caspase 9 divided patients into two groups with distinctive prognosis. Those with collagen V > 9.40% and endothelium apoptosis caspase 9 > 1.09% have low risk of death (0.27 and 0.41, respectively) than those with collagen V < 9.40% and endothelium apoptosis caspase 9 + < 1.09%.In addition low levels of immune cells and cytokines in the tumour environment when compared with non-tumour environment. Cox model analysis with all variables showed low risk of death for tabagism < 41 packs/year, N0 stage, SCC, CD4+ > 16.81%,macrophages/monocytes > 4.5%cytokine IL-4 > 0,8%, cytokines IL-6 > 2,2%, dendritic cells Cd1a > 1,6% and collagen V > 9,4%. Collectively, the data indicated that NSCLC did not trigger a substantive immune cell infiltrate at tumour sites. More over Collagen V and endothelium apoptosis caspase 9 + in resected NSCLC are strongly related to prognosis, suggesting that strategies aimed at preventing the low collagen V synthesis, or local responses to low endothelium apoptosis and immune cell infiltration has impact on NSCLC prognosis and may be a promising marker for new immunotherapeutic approaches and may have a greater impact in lung cancer