Este trabalho apresenta o desenvolvimento de biossensores de pH, ureia e glicose, utilizando óxidos como plataforma para a parte seletiva. Os filmes finos de óxidos condutores foram produzidos por diferentes técnicas de deposição, como spin-coat, dip-coat, spray-pyrolysis e casting. Os materiais fabricados foram AZO e TiO2, ambos depositados sobre substratos de FTO, ITO ou vidro hidroflilizado. O número de camadas foi variado para cada técnica e as caracterizações morfológicas e estruturais foram feitas por MEV, DRX e FTIR. As caracterizações elétricas foram feitas por EGFET e voltametria cíclica. Os filmes foram testados como sensores de pHs na faixa de 2 a 8. O filme depositado com AZO em substrato de FTO pela técnica de spray-pyrolysis apresentou melhor resposta, com sensibilidade de 31,7 mV/pH entre toda a faixa de pHs do 2 ao 8. Já para os filmes de TiO2, o filme produzido por dip-coat com 5 camadas em substrato de FTO apresentou sensibilidade de 37,8 mV/pH entre a faixa de pHs de 2 a 8. Paralelamente, os filmes tiveram suas superfícies funcionalizadas com proteínas como urease ou glicose oxidase. Neste caso, os dispositivos foram testados entre as concentrações de 5 a 200 mg/dL de ureia e glicose. Como biossensor de ureia, o filme de TiO2 depositado por spin-coat com 5 camadas em substrato de FTO apresentou a maior sensibilidade, com valor 3,32 mV/(mg/dL) entre as concentrações de 5 a 120 mg/dL. Para os filmes estudados como biossensores de glicose, o melhor resultado também foi obtido pelo filme de TiO2 depositado por spin-coat com 5 camadas em substrato de FTO, apresentando sensibilidade em torno de 6,18 mV/(mg/dL) entre as concentrações de 5 a 200 mg/dL. Alguns resultados encontrados foram iguais ou melhores aos encontrados na literatura vigente, mesmo que os dispositivos ainda são passíveis de otimização. / This study presents the development of pH, urea and glucose biosensors, by the use of oxides as the base of the sensing membrane. Conducting oxide thin films were prepared by different deposition techniques, such as spin-coat, dip-coat, spray-pyrolysis, and casting. AZO and TiO2 were produced and coated onto FTO, ITO and glass substrates. The number of layers were changed for each deposition technique, and the surface characterizations were made by SEM, XRD and FTIR, while the electrical characterizations were performed with an EGFET device and cyclic voltammetry. The samples were used as pH sensors in the pH range from 2 to 8. The AZO thin film onto FTO substrate deposited by spray-pyrolysis deposition technique presented sensitivity as 31.7 mV/pH for the total pH range from 2 to 8. TiO2 thin films, produced by dip-coat deposition technique with 5 layers onto FTO substrate presented 37.8 mV/pH as sensitivity, for the same pH range. All the films have their surfaces immobilized with proteins as urease or glucose oxidase. In this case, the samples were performed in different concentrations of urea or glucose, respectively, from 5 to 200 mg/dL, for both. Urea biosensors presented good results for measurements performed with the same sample as well as performed with individuals samples, for all the concentrations range. Spin-coated TiO2 thin films with 5 layers onto FTO substrates presented 3.32 mV/(mg/dL) as sensitivity from 5 to 120 mg/dL urea concentrations, while for glucose biosensors presented 6.18 mV/(mg/dL) for the same film between the glucose concentration range from 5 to 20 mg/dL. Some results were equal or better than the results in current literature, even the films are still capable of optimization.

Este trabalho apresenta o desenvolvimento de (bio)sensores baseados em plataformas poliméricas convencionais e nanoestruturadas. Os sensores estudados contém poli(pirrol) como transdutor eletroquímico, responsável pela oxidação de amônia a 0,35 V. Como a enzima urease hidrolisa cataliticamente uréia a amônia, após a imobilização da enzima sobre o poli(pirrol), obtém-se um biossensor para detecção indireta de uréia, via amônia. A detecção de amônia pelo poli(pirrol) foi otimizada em termos da densidade de carga de poli(pirrol) presente no sensor, e do potencial de trabalho. Então verificou-se a ação do polímero poli(5-amino-1-naftol) na redução do sinal dos interferentes ácidos úrico e ascórbico. Após a otimização do sensor-base, estudou-se a influência do tipo de imobilização da urease ao substrato polimérico na sensibilidade e estabilidade do biossensor de uréia. Concluiu-se que a pouca quantidade de enzima imobilizada através das metodologias estudadas era o fator limitante da sensibilidade de detecção, e então implementou-se a nanoestruturação do poli(pirrol), para aumentar a área superficial disponível para a imobilização da urease. Preparou-se filmes de poli(pirrol) nanoestruturado (macroporoso e nanofios), e a compreensão dos fenômenos observados só foi possível ao aliar características geométricas e propriedades físico-químicas intrínsecas de sistemas nanoestruturados. / This work presents the development of (bio)sensors based on conventional and nanostructured polymeric platforms. The analyzed sensors contain poly(pyrrole) as electrochemical transducer, responsible for ammonia oxidation at 0.35 V. As the enzyme urease catalytically hydrolyses urea to ammonia, after enzyme immobilization onto poly(pyrrole), a biosensor for urea indirect detection, via ammonia, is obtained. Ammonia sensing by poly(pyrrole) was optimized in terms of both charge density of poly(pyrrole) present in the sensor and working potential. In sequence, poly(5-amino-1-naphtol) role as interferents (uric and ascorbic acids) signal blocker was verified. After optimization of the base-sensor, the influence of urease immobilization method on both detection sensitivity and biosensor durability was investigated. It was found that the small amount of enzyme immobilized using the compared methods limited detection sensitivities, and then nanostructuration of poly(pyrrole) was implemented, in order to increase the surface area available for urease immobilization. Nanostructured poly(pyrrole) films (macroporous and nanowires) were prepared, and the fully understanding of the observed phenomena was only possible combining geometric characteristics and physical-chemical properties related to nanostructured systems.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-12-13T17:37:03Z No. of bitstreams: 1 Stephany Emyle Barbosa Lins.pdf: 6866025 bytes, checksum: 7c84e9d358e82f482c93a3e2b675dd72 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-13T17:37:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stephany Emyle Barbosa Lins.pdf: 6866025 bytes, checksum: 7c84e9d358e82f482c93a3e2b675dd72 (MD5) Previous issue date: 2014-01-30 / he objective of this study was to evaluate the effect of replacement of wheat bran by cactus pear ( 0, 25, 50, 75 and 100% ) in diets based on sugar cane, to evaluate the intake and digestibility of nutrients, nitrogen balance, fiber ruminal dynamics, microbial protein synthesis and ruminal parameters – pH, N-NH3 concentration and production of short chain fatty acid in sheep. Five Santa Ines sheep, canulated in rumen, with average initial live weight 34.02 ± 3.6 kg, designed in a 5 × 5 latin square. The dry matter, organic matter, crude protein, ether extract, total digestible nutrients and fiber fixed neutral detergent intake showed quadratic effect (P<0,05) with replacement of wheat bran by cactus pear. The apparent digestibility of dry matter, organic matter and crude protein showed a linear increase (P<0,05). This trial showed a quadratic effect (P<0,05) for the passage rate of neutral detergent fiber. The intake and nitrogen absorption showed (P<0,05) similar behaviour to dry matter intake. The replacement of wheat bran by cactus pear favoured the linear increased (P<0,05) of values observed for the nitrogen balance. The N-NH3 concentration did not limit the microbial protein synthesis, showed linear increase (P<0,05) for replacement of wheat bran by cactus pear and showed a quadratic effect (P <0,05) for collection schedules, before feeding, two, four and six hours after the food ingestion. There was a quadratic effect (P<0,05) for the production of microbial crude protein and nitrogen, and ruminal microbial production of short chain fatty acids. The ruminal pH was within the optimum range (6,7±0,5) for adequate fermentation in the rumen, increased linearly (P<0.05) with replacement and showed a quadratic effect (P<0.05) for collection schedules. Recommended the development of performance test, to verify the extent to which the cactus pear can replace wheat bran in diets based on sugarcane, without loss to animal production / Objetivou-se avaliar o efeito da substituição do farelo de trigo por palma (0, 25, 50, 75 e 100%) em dietas a base de cana-de-açúcar, sobre o consumo e digestibilidade dos nutrientes, balanço de nitrogênio, dinâmica ruminal da fibra, síntese de proteína microbiana e parâmetros ruminais - pH, concentração de N-NH3 e produção ácidos graxos de cadeia curta em ovinos. Foram utilizados cinco ovinos da raça Santa Inês, fistulados no rúmen, com peso médio inicial de 34,02 ± 3,6 kg, distribuídos em quadrado latino 5 × 5. Os consumos de matéria seca, matéria orgânica, proteína bruta, extrato etéreo, nutrientes digestíveis totais e fibra em detergente neutro corrigido para cinzas e proteína, apresentaram comportamento quadrático (P<0,05) com a substituição do farelo de trigo pela palma. A digestibilidade aparente da matéria seca, matéria orgânica e proteína bruta aumentou linearmente (P<0,05). A substituição proporcionou efeito quadrático (P<0,05) para a taxa de passagem da fibra em detergente neutro. A ingestão e absorção de nitrogênio apresentaram comportamento (P<0,05) semelhante ao consumo de matéria seca. A substituição do farelo de trigo por palma favoreceu o aumento linear (P<0,05) dos valores observados para o balanço de nitrogênio. As concentrações N-NH3 observadas não limitaram a síntese de proteína microbiana, aumentaram linearmente (P<0,05) com os níveis de substituição do farelo de trigo pela palma e apresentaram efeito quadrático (P<0,05) para os horários de coleta, logo antes da alimentação, duas, quatro e seis horas após a ingestão de alimento. Houve efeito quadrático (P<0,05) para as produções de proteína bruta e nitrogênio de origem microbiana e produções ruminais dos ácidos graxos de cadeia curta. O pH ruminal apresentou-se dentro da faixa ótima (6,7±0,5) para fermentação adequada no ambiente ruminal, aumentou linearmente (P<0,05) com os níveis de substituição do farelo de trigo por palma e apresentou efeito quadrático (P<0,05) para os horários de coleta. Recomenda-se o desenvolvimento de ensaio de desempenho, afim de verificar até que ponto a palma pode substituir o farelo de trigo em dietas à base de cana corrigida sem causar prejuízos a produção animal.

Orientador: Orival Andries Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Educação Fisica / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:11:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa_AugustoCarvalho_M.pdf: 3471127 bytes, checksum: 926adc0a0aba1c9acdd1491ea87d9ae5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito do treinamento de força específica no desempenho na natação. Para isso 14 nadadores competitivos em nível estadual foram divididos em dois grupos: controle (GC / n=6) e experimental (GE / n = 8). Ambos os grupos realizaram o mesmo treinamento durante seis semanas, cinco dias por semana. Adicionalmente o GE realizou um treinamento de força específica denominado treinamento complexo (MC) três vezes por semana em sessões extras durante o mesmo período. Todos os atletas foram avaliados em pré e pós-treinamento por testes específicos, a saber: nado amarrado (força), 3 x 25m (velocidade) e teste de desempenho da distância e estilo de competição. Este último foi avaliado também com os resultados da principal competição (Final). Durante todo o treinamento experimental foram coletadas amostras de sangue nas segundas e sextas-feiras para avaliar respostas da creatina quinase e uréia. De Pré para Pós foram encontradas alterações significantes apenas para a força (p<0,05). O GE também apresentou alteração significante de Pós para Final no desempenho. Os valores de CK e Uréia não apresentaram diferenças intergrupos. É possível concluir que a carga proposta para o MC é eficiente no implemento da força específica sem apresentar indícios preocupantes de lesão muscular e proteólise. Além disso, alterações no deserijpenho podem estar relacionadas com o efeito posterior duradouro do treinamento (EPDT), devido à melhora significante do desempenho do GE no momento Final / Abstract: The aim of this study was to verify the effect of Complex Training (CT) in swimming performance. Fourteen state competitive swimmers were assigned in two groups: control (CG I n=6) and experimental (EG I n=8). Both groups performed the same training in water during six weeks, five days I week. Additionally, EG performed a high specific strength training called CT three times I week in extra training sessions. The swimmer~ were evaluated in Pre and Post training with specific tests: tethered swimming (strength), 3 x 25m (velocity) and performance test with the same stroke and distance of competition. This last one was also evaluated in the main competition's results (Final). In ali the experimental training blood samples were collected on Mondays and Fridays to evaluated creatine quinase (CK) and urea training responses. Significant differences were found only for strength (p<0,05). EG also presented significant differences in performance from Post to Final. CK and urea did not presented intergroups differences. It can be concluded that the loads used in CT is efficient to strength improvement and it did not show serious differences in muscular soreness and proteolysis. Additionally, performance improvement may be relatéd to posterior effect of training (EPDT), because of the performance improvement in Final moment / Mestrado / Ciencia do Desporto / Mestre em Educação Física

Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os efeitos da amonização com diferentes níveis de uréia pecuária e tempo de amonização sobre o valor nutricional do capim-elefante. O experimento foi realizado em esquema fatorial 5x5, utilizando-se cinco concentrações de uréia (0, 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0%) com cinco tempos de amonização (0, 2, 3, 4 e 5 semanas), totalizando vinte e cinco tratamentos com quatro repetições cada. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, e quando houve efeito significativo para os fatores avaliados fez-se o Teste de Tukey, em nível de 5% de probabilidade, utilizando-se o pacote estatístico SAS (2001). O experimento foi realizado na Fazenda Santo Antônio de P adua localizada no município de Catu BA. A espécie forrageira utilizada foi o capim elefante (Pennisetum purpureum Schum), cultivar Cameron. As análises químico bromatológicas foram realizadas na Universidade Federal de Sergipe - UFS e na Universidade Federal da Bahia UFBA. A adição de uréia se mostrou eficiente para incrementar o aporte dos compostos nitrogenados no capim-elefante, com o aumento dos teores de PB, além de disponibilizar maiores teores de NDT. Em relação às frações fibrosas do capim, a amonização possibilitou a solubilização de parte dos componentes destas frações, além de ter aumentado os teores de carboidratos não fibrosos e totais no capim-elefante amonizado. Os melhores tempos de amonização na região trabalhada oscilaram entre duas e cinco semanas, e o nível de uréia que mostrou maior eficácia no tratamento do capim-elefante foi de 2% com base na matéria seca.

Orientador: Carlos Francisco Sampaio Bonafe / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T01:21:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_JoseLuisdaRocha_D.pdf: 2961900 bytes, checksum: 8d0413331d106601d34efccd4f8e6bb7 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os vírus são estruturas auto-associaveis muito eficientes, porém, pouco é conhecido sobre a termodinâmica que governa essa associação dirigida. Em altos níveis de pressão ocorre dissociação do TMV ou desnaturação quando a pressão é combinada com uréia. Para um melhor entendimento de tais processos nós calculamos os parâmetros termodinâmicos aparentes de dissociação e desnaturação do TMV, assumindo uma condição de estado estacionário "steady-state condition". Esses processos podem ser monitorados pela diminuição de espalhamento de luz da solução virai devido ao processo de dissociação e pelo desvio para o vermelho do espectro de emissão de fluorescência, que ocorre com o processo de desnaturação. Nós determinamos a estequiometria aparente de uréia considerando a reação de equilíbrio de dissociação e desnaturação das subunidades do TMV, as quais forneceram, respectivamente, 1,53 e 11,1 mols de uréia/mol de subunidade de TMV. As condições de dissociação e desnaturação foram atingidas em uma via próxima da reversível, permitindo a determinação de parâmetros termodinâmicos. Analises de gel filtração em HPLC, microscopia eletrônica e dicroísmo circular confirmaram os processos de dissociação e desnaturação. Os cálculos das estequiometrias aparentes de uréia de vários vírus baseados em resultados espectroscópicos de artigos recentes mostraram que os processos de dissociação e desnaturação seguem uma estequiometria similar, sugerindo uma interação similar uréia-vírus entre estes sistemas. A desnaturação do TMV utilizando GndHCl foi mais eficiente que a uréia, apresentando estequiometria de 7,50 mols de GndHCl /mol de subunidade de TMV / Abstract: Viruses are very efficient self-assembly structures, but little is understood about the thermodynamics governing this directed assembly. At higher levels of pressure occurs dissociation of TMV or when pressure is combined with urea, denaturation occurs. For a better understanding of such processes, we investigated the apparent thermodynamic parameters of dissociation and denaturation by assuming a steady-state condition. These processes can be measured considering the decrease of light scattering of a viral solution due to the dissociation process, and the red shift of the fluorescence emission spectra, that occurs with the denaturation process. We determined the urea stoicbiometry considering the equilibrium reaction of TMV dissociation and subunit denaturation, which furnished, respectively, 1.53 and 11.1 mois of urea/mol of TMV subunit. The denaturation and dissociation conditions were arrived in a near reversible pathway, allowing the determination of thermodynamic parameters. Gel filtration HPLC, electron microscopy and circular dichroism confirmed the dissociation and denaturation processes. The calculation of apparent urea stoicbiometry of several other viruses based on spectroscopic results from earlier papers showed that dissociation and denaturation processes follow similar stoichiometrics, suggesting a similar virus-urea interaction among these systems. The TMV denaturation was more efficient in the presence of GndHCl, with stoichiometry of 7.50 mois of GndHCl /mol of TMV subunit / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Na busca de alternativas para mensurar a emissão foliar de amônia (NH3) e minimizar as perdas de N-NH3 em pastagens, foram realizados três trabalhos. Os dois primeiros com objetivo de verificar se o absorvedor com espuma, já utilizado na quantificação da volatilização de N-NH3, também é eficiente para mensurar a emissão foliar, sem causar alterações no processo de perda de nitrogênio. O terceiro trabalho, realizado em pastagem de capim Colonião (Panicum maximum Jacq. cv. Colonião) no verão, inverno e primavera, avaliou o efeito da aplicação de lâminas de água, após a adubação com uréia, sobre as perdas de N-NH3 do solo por volatilização e emissão foliar. O absorvedor de amônia com espuma não causa alteração no processo de perda de N-NH3 e colocado 1 cm acima das folhas superiores, é efetivo em capturar o N-NH3 perdido por emissão foliar da pastagem, quando se fertiliza em superfície com nitrato de amônio e uréia. A aplicação de água imediatamente após a adubação com uréia é eficiente para reduzir as perdas de NNH3 por volatilização. No verão, a aplicação de 3,2 mm de água foi suficiente para reduzir as perdas de N-NH3 para menos de 3,1 % do N aplicado, enquanto na ausência de irrigação ocorreram perdas de 30,5%. A taxa de volatilização é influenciada pela quantidade de água disponível no solo, sendo baixa quando a uréia é aplicada em solo seco ou quando o solo seca rapidamente, mesmo que a temperatura ambiente seja elevada. A emissão foliar de N-NH3 não foi influenciada pela aplicação ou não de água, após a adubação com uréia. / In search of alternatives to measure ammonia (NH3) foliar emission and minimize N-NH3 losses in pasture three research works were accomplished. The two first works aimed at checking whether or not the foam absorber, which was already used to quantify N-NH3 volatilization, is also efficient to measure foliar emission without interfering in nitrogen loss process. The third one was performed in Panicum maximum Jacq. cv. Colonião pasture during three different seasons and evaluated the use of irrigation levels after urea fertilization on N-NH3 losses through volatilization and foliar emission. The ammonia foam absorber does not alter N-NH3 loss process and when place at height of 1 cm from the upper leaves it is effective in capturing N-NH3 lost through foliar emission when fertilization is done superficially with ammonium nitrate and urea. Water application immediately after fertilization is efficient to reduce N-NH3 losses through volatilization. During summer the use of 3.2 mm water was enough to decrease N-NH3 loss to less than 3.1% of applied N, while the lack of irrigation caused 30.5% losses. Volatilization rate is influenced by the quantity of water available in the soil, being low when urea is applied to dry soil or when the soil dries fast even if the environment temperature is high. N-NH3 foliar emission was not influenced by water application after urea fertilization.

Sensores são dispositivos capazes de captar um determinado sinal físico -químico do meio e converte-lo num sinal elétrico mensurável por meio de um transdutor. Biossensor é um sensor que tem como parte funcional um receptor biológico específico a determinado analito alvo. Os sinais físico-químicos experimentados por estes dispositivos são convertidos em sinais elétricos de magnitude proporcional à concentração de um ou mais compostos químicos. Neste trabalho, foi construído um sensor de pH utilizando filmes finos comerciais de óxido de estanho dopado com flúor (FTO) como receptor a íons. O sensor foi feito ligando-se amostras de FTO ao terminal de porta de um transistor de efeito de campo do tipo MOS (Metal Oxide Semiconductor). Quando colocado em solução, os íons presentes interagem com a amostra sendo adsorvidos na superfície do filme de FTO. O potencial gerado pelos íons adsorvidos modulam a tensão na porta do transistor e, desta maneira, pode -se determinar a concentração dos íons presentes na solução de acordo com a magnitude da resposta do transistor. A este tipo de dispositivo dá -se o nome de EGFET (Extended Gate Field Effect Transistor). O EGFET construído apresentou responsividade de 55 mV/pH e resposta linear em soluções de pH 2 ao 12. Através de técnicas de imobilização enzimática foi possível ligar covalentemente proteínas urease sobre a superfície dos filmes de FTO, convertendo o sensor de pH em biossensor de ureia. Soluções tampão com diferentes pHs e concentrações foram testadas e determinou -se que as condições ideais para o uso deste biossensor de ureia são soluções tampão com pH = 6 e concentração de 10mM. Nessas condições, o biossensor apresentou uma responsividade de 114,5 mV/p(ureia) e linearidade no intervalo de concentrações de ureia entre 3,2.10 -4 e 3,2.10 -2 mol/L. / Sensors are devices capable of capturing a certain physical-chemical signal from environment and convert it into a measurable electrical signal by a transducer. Biosensor is a sensor which has a biological sensing element as receptor specific to a particular target analyte. The physical-chemical signals experienced by these devices are converted into electrical signals with magnitude proportional to the concentration of one or more chemical compounds. In this work, we built a pH-sensor using commercial thin films of tin oxide doped with fluorine (FTO) as ions receptor. The sensor was made by linking FTO samples to the gate of a field effect transistor MOS type. In solution, the ions interact with the sample being adsorbed on the surface of FTO film. The potential generated by the ions adsorbed on film\'s surface modulate the gate voltage of the transistor and, in this way, we can determine the concentration of ions present in solution correlated with the magnitude of the transistor response. This kind of device is given the name of EGFET (Extended Gate Field Effect Transistor). The EGFET built exhibits sensitivity of 55 mV/pH and linear response in the range of pH 2 to 12. Through enzyme immobilization techniques we could covalently bind urease proteins on the surface of FTO film, changing the pH-sensor in urea biosensor. Buffer solutions with differents pHs and concentrations were tested and was determined that optimal environment conditions for this urea biosensor is buffer solutions with pH = 6 and 10mM of concentration. Under these conditions, the biosensor showed sensitivity of 114.5 mV/p(urea) and linear response in the range of 3,2.10 -4 to 3,2.10 -2 mol/L

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3,6 MDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho estudos de caracterização das subunidades da HbGp, bem como da estabilidade da HbGp em diferentes formas, em função do pH, e em diferentes concentrações de ureia, por diferentes técnicas biofísicas, foram realizados. Os estudos de caracterização por eletroforese SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS e ultracentrifugação analítica (AUC) das subunidades isoladas mostraram que apenas o monômero d obtido da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) tem alto grau de pureza. Para as demais frações mais de uma contribuição foi observada em solução. Assim, para a fração trimérica, duas espécies estão presentes em solução, a espécie predominante (87 %) é atribuída ao trímero abc e a outra espécie (13 %) pode ser associada ao complexo (abc + L). Os dados espectroscópicos e de AUC mostraram que a estabilidade da HbGp depende fortemente do estado de oxidação do heme, do ligante coordenado no centro metálico e da concentração de proteína. Assim, a forma oxidada, a meta-HbGp, mostrou-se menos estável em meio alcalino e na presença de ureia, seguida pelas formas oxi- e cianometa-HbGp. Desta forma, no pH 8,0, a meta-HbGp está totalmente dissociada em trímero abc e monômero d, enquanto a oxi-HbGp está apenas parcialmente dissociada com uma contribuição de 88 % de proteína íntegra em solução e a cianometa-HbGp não sofre dissociação oligomérica. Os valores de coeficiente de sedimentação s20,w e massa molecular (MM) determinados para as espécies em solução são similares aos observados para as correspondentes espécies isoladas por SEC. Na presença de ureia a mesma tendência foi observada para as três formas da HbGp. Porém, para uma caracterização melhor de processo de desnaturação, os dados espectroscópicos foram analisados usando modelos de dois e três estados para obter informações sobre os parâmetros termodinâmicos do sistema. Assim, bons ajustes foram obtidos usando ambos os modelos, no entanto, o modelo de três estados foi mais adequado para descrever o processo. Por este modelo o processo de desnaturação da HbGp pode ser descrito por duas etapas. A primeira etapa, na faixa de 1,0 - 3,0 mol/L de ureia, está associada a transição do estado nativo para o estado intermediário (N &rarr; I), e é caracterizada pela dissociação do oligômero nas diferentes subunidades da HbGp. O estado intermediário apresenta propriedades físico-químicas similares ao estado nativo, sugerindo que o processo de dissociação oligomérica não induz mudanças significativas na estrutura secundária e na região do grupo heme da proteína. Os parâmetros termodinâmicos associados à primeira transição apresentaram erros consideráveis, que podem ser atribuídos à complexidade do estado intermediário com diferentes espécies em solução bem como à semelhança ao estado nativo. A segunda etapa (I &rarr; U) com transição bem definida entre 4,5 - 5,0 mol/L de desnaturante é caracterizada pela desnaturação das subunidades dissociadas. Os dados de AUC e SAXS são consistentes com os dados obtidos por espectroscopia, onde a primeira etapa do processo foi caracterizada pela dissociação oligomérica do oligômero em dodecâmero (abcd)3, tetrâmero abcd, trímero abc e monômero d. Para concentrações acima de 4,0 e 5,0 mol/L de ureia, para oxi-HbGp e cianometa-HbGp, respectivamente, aumentos significativos nos valores de I(0), Dmax e Rg sugerem que as subunidades da HbGp estão desnaturadas em solução. As massas moleculares (MM) obtidas por espectrometria de massas e AUC, e os coeficientes de sedimentação s20,w são consistentes com outros resultados reportados para hemoglobinas ortólogas. Além disso, os resultados aqui apresentados representam um avanço importante na caracterização do processo de desnaturação de proteínas oligoméricas complexas. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3.6 MDa, a high oligomeric stability, a high resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this current work the characterization of the HbGp subunits and the effect of pH and urea upon the oligomeric stability were studied by several biophysical techniques. Our results obtained by electrophoresis SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS and analytical ultracentrifugation (AUC) showed that only the monomer d isolated by size exclusion chromatography (SEC) presented high purity. For the other fractions various species were observed in the solution. Thus, for the trimeric fraction, two species are present in the equilibrium, the main species with percentage contribution of 87 % is assigned to the trimer abc and the species with 13 % in the solution is associated to the complex (abc + L). Additionally, the data obtained by several spectroscopic techniques and AUC show clearly that the oligomeric stability of HbGp depends on the iron oxidation state, the specific ligand coordinated to the iron and the protein concentration. Therefore, our results show that the met-HbGp form is the less stable one in the alkaline medium and in the presence of urea, followed by the oxy- and cyanomet- forms. In this way, at pH 8.0, the met- form is fully dissociated into smaller subunits, such as, trimer abc and monomer d, while the oxy-HbGp is partially dissociated with a significant percentage contribution (88 %) of undissociated protein, and the cyanomet-HbGp does not undergo oligomeric dissociation. The sedimentation coefficients (s20,w) and molecular masses (MM) values for species present in the solution, at different pH, are very close to the values obtained for isolated species. In the presence of urea the same behavior was observed for the three HbGp forms as compared to the alkaline medium. However, for a full characterization of the unfolding process the thermodynamic parameters were obtained by spectroscopic data analysis using models of two and three states. Adequate fits were obtained for both models, but the three states model was very appropriate to describe the HbGp denaturation process. Thus, the denaturation process of HbGp is defined by two phases. The first phase between 1.0 and 3.0 mol/L, of urea is assigned to the transition of native state to an intermediate state (N &rarr; I), and is characterized by dissociation of the oligomer in several subunits. The strong similarity of the intermediate state to the native one suggests that oligomeric dissociation induces little changes in the secondary structure and the region of heme group of the protein. As a consequence, the thermodynamic parameters associated to the first transition have large errors due to the complexity of the intermediate state with different species in the solution, as well as its great similarity to the native state. The second phase (I &rarr; U), associated with a cooperative transition at 4,5 - 5,0 mol/L of denaturant agent, is attributed to the unfolding of the dissociated subunits. Our AUC and SAXS data are very consistent with spectroscopic data. Thus, in the first phase the oligomeric dissociation of whole protein in dodecamer (abcd)3, tetramer abcd, trimer abc and monomer d was observed. For urea concentrations above 4.0 - 5,0 mol/L, for oxy-HbGp and cyanomet-HbGp, respectively, the significant increase in I(0), Dmax and Rg values suggests that the HbGp subunits are denatured in the solution. The molecular masses values (MM) obtained by mass spectrometry and AUC, and the sedimentation coefficients (s20,w) are consistent with others results reported in the literature for orthologous hemoglobins. In addition, the results of this work correspond to an important advance in the characterization of the denaturation process of this complex oligomeric protein.

Abstract Reindeer management in the Fennoscandian area is currently facing challenges such as degradation of winter pastures, which may lead in the most severely affected areas to a concurrent decline in reindeer herd productivity. The use of often expensive supplementary feeding to prevent production losses has increased the demand for studies on the physiological effects of nutritional restriction and supplementary feeding. The knowledge obtained from such studies could be used, for example, to monitor the condition of reindeer in studies assessing herd productivity levels in different pasture conditions and management systems or sustainable use of pasture resources. In this thesis, the effects of season, year, pasture area, body mass, pregnancy and other extrinsic and intrinsic factors on the variation of blood chemical constituents of reindeer were studied in free-ranging animals under natural foraging conditions. The studied blood chemical constituents covered a wide range of parameters related to protein, carbohydrate, lipid and mineral metabolism. The same blood chemical constituents were studied in captive reindeer under defined feeding conditions, allowing an analysis of the effects of dietary protein, energy and mineral intake on the selected blood constituents and their comparison to a conventional measure of the animals' condition, live body mass. According to the results, free-ranging reindeer showed great variation in the concentrations of blood chemical constituents compared to the reference values of domesticated ruminants. Intrinsic factors such as body mass, pregnancy and age had only a minor influence on the variation of the studied parameters, whereas extrinsic factors such as season, year and pasture area, which were characterized by marked changes in environmental and nutritional conditions, explained the majority of the variation. The results obtained from captive animals in defined feeding conditions and from free-ranging animals foraging on natural pastures led to the conclusion that blood total proteins, albumin, urea, creatinine, urea:creatinine ratio, magnesium, inorganic phosphate and, to a lesser extent, globulins and albumin:globulin ratio responded to the changes in feed quality and availability and were the most suitable blood constituents to be used as nutritional biomarkers for reindeer.