A doença de Chagas representa um grave problema de saúde pública, afetando principalmente a população de baixa renda, o que a torna negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente, existe apenas um fármaco disponível para o tratamento, o benzonidazol, porém este apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. O ácido ursólico, um triterpeno de origem natural, possui atividade tripanocida, porém, sua solubilidade aquosa baixa limita sua biodisponibilidade. Para o aumento da biodisponibilidade tem destaque o uso das dispersões sólidas, onde fármacos lipofílicos são dispersos molecularmente ou no estado amorfo em carreadores hidrofílicos, acarretando um aumento do perfil de dissolução. Neste trabalho, dispersões sólidas e misturas físicas contendo ácido ursólico foram preparadas com os carreadores polietilenoglicol 6000, Gelucire 50/13 e dióxido de silício coloidal, Poloxamer 407 e caprato de sódio, empregando as técnicas de fusão e evaporação do solvente. Os sistemas foram caracterizados através das técnicas de microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia do infravermelho com transformada de Fourier, calorimetria exploratória diferencial, microscopia em hot stage e difratometria de raios-X. Em outra etapa, os produtos foram avaliados quanto à solubilidade aquosa, perfil de dissolução in vitro, citotoxicidade em linhagem celular LLC-MK2, e atividade tripanocida em modelo animal. Em conjunto, os resultados mostraram que o fármaco não teve suas propriedades afetadas pela manipulação em misturas físicas, mantendo sua estrutura cristalina. Por outro lado, os experimentos de difratometria de raios-X e as observações microscópicas em hot stage revelaram a alteração do ácido ursólico para o estado amorfo, principalmente para os sistemas preparados pelo método do solvente, enquanto que algumas formulações manipuladas pelo método da fusão exibiram alterações polimórficas. Além disso, evidenciaram-se interações intermoleculares do tipo ligações de hidrogênio para as dispersões sólidas preparadas pelo método do solvente. As alterações do fármaco observadas para as dispersões sólidas preparadas pelo método do solvente aumentaram sua solubilidade e melhoraram seu perfil de dissolução comparado às dispersões sólidas pelo método da fusão e misturas físicas, sendo este aumento maior para os sistemas compostos por Poloxamer 407 + caprato de sódio, seguido por Poloxamer 407, Gelucire 50/13 + dióxido de silício coloidal e PEG 6000, o que pode ser atribuído ao poder tensoativo dos três primeiros carreadores. As formulações mostram-se seguras até a concentração de 128 ?M do fármaco, através da avaliação da citotoxicidade. Por último, o ursólico teve um aumento significativo da atividade tripanocida para a formulação composta pelo tensoativo Poloxamer 407 junto com o promotor de absorção oral caprato de sódio, manipulada pelo método do solvente, sugerindo o aumento da biodisponibilidade do fármaco. / Chagas disease represents a severe problem in public health, affecting mainly the low-income population, making it neglected by the pharmaceutical industry. Currently, there is only one drug available for treatment, benznidazol, however, it presents limited efficacy and is associated with several side effects. Ursolic acid, a naturally occurring triterpene, presents trypanocidal activity, but its low water solubility limits the bioavailability. To increase the biovailability, solid dispersions, where lipophilic drugs are molecularly or in the amorphous state dispersed in hydrophilic carriers, can play an important role, resulting in enhanced dissolution profile of the drug. In this work, solid dispersions and physical mixtures containing ursolic acid were prepared with Polyethyleneglycol 6000, Gelucire 50/13 and silicon dioxide, Poloxamer 407 and sodium caprate as carriers, employing the fusion and solvent evaporation techniques. The products were characterized through scanning electron microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, differential scanning calorimetry, hot stage microscopy and X-ray diffractometry. In another step, the formulations were evaluated regarding the aqueous solubility, in vitro dissolution profile, citotoxicity using LLC-MK2 cell line, and trypanocidal activity in animal model. Together, results showed that the drug did not suffer any change in its properties when in physical mixture. On the other hand, X-ray diffractometry and hot stage microscopy revealed a transition from the crystalline to the amorphous state for ursolic acid, especially for the products prepared by the solvent method. In the fusion method, some formulations exhibited a polymorphic change. Moreover, we identified intermolecular interactions between drug and carrier by hydrogen bonding in the products prepared by the solvent method. These changes observed for solid dispersions prepared by the solvent method resulted in increased water solubility and dissolution profile and these effects were higher for the products prepared with Poloxamer 407 + sodium caprate, followed by Polomer 407 alone, Gelucire 50/13 + silicon dioxide and PEG 6000, which can be attributed to the surfactant property of the three first carriers. The formulations were safe up to 128 ?M of the drug, showed by the citotoxicity evaluation. Very importantly, we highlight that ursolic acid had a significant increase in the trypanocidal activity for the product prepared with the surfactant Poloxamer 407 and the penetration enhancer sodium caprate, prepared by the solvent method, suggesting that in this composition ursolic acid was more bioavailable.

A doença de Chagas causada pelo Trypanosoma cruzi representa um grave problema de saúde pública na América Latina e cada vez mais em todo o mundo, afetando principalmente regiões de baixo poder aquisitivo, e por isso negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente apenas um fármaco está disponível, o benzonidazol, o qual apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. Estudos recentes demonstraram atividade tripanocida do ácido ursólico, entretanto sua utilização é limitada pela alta hidrofobicidade, sendo o uso dos nanocarreadores lipossomais reconhecido como uma estratégia promissora para solucionar tal limitação, além de serem sistemas altamente versáteis e biocompatíveis. Neste trabalho, foram desenvolvidos lipossomas de fosfatidilcolina e colesterol contendo ácido ursólico pela técnica da evaporação do solvente e hidratação do filme lipídico seguida de sonicação, permitindo a obtenção de vesículas unilamelares e com baixa polidispersividade. A partir da avaliação preliminar da estabilidade das dispersões, a adição do colesterol na razão molar 10:1 fosfatidilcolina:colesterol foi essencial para a manutenção do conteúdo encapsulado quando a formulação foi estocada em temperatura ambiente e melhor retenção do conteúdo a 4°C (90%). Após a liofilização o emprego de sucrose na razão molar 1:10 lipídeo:açúcar, a formulação manteve o tamanho e distribuição de tamanho e impediu a agregação das vesículas. A formulação obtida foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão, apresentando diâmetro entre 100 e 120 nm, também observado pelo espalhamento dinâmico da luz. As análises por espectroscopia no infravermelho e calorimetria exploratória diferencial demonstraram uma forte interação do fármaco com a membrana fosfolipídica por interações de hidrogênio, assim como uma menor mobilidade das cadeias lipídicas e formação de uma matriz vítrea a qual foi responsável pela efetiva crioproteção das vesículas. Estudo in vitro do perfil de liberação do fármaco a partir dos lipossomas pela técnica da diálise resultou em alta retenção do conteúdo encapsulado e uma liberação sustentada deste. A partir de ensaio biológico in vitro empregando azul de trypan, a formulação liofilizada contendo ácido ursólico se mostrou segura até a concentração em que seria necessária para carrear 32 ?M do fármaco, considerando a linhagem de mamíferos LLC-MK2. Em relação à atividade tripanocida em linhagem da cepa CL da forma epimastigota empregando MTT, o lipossoma contendo o fármaco foi capaz de causar morte celular do parasita em 100%, considerando-se um possível efeito sinérgico do ácido ursólico e o colesterol, cuja seletividade à membrana do parasita tem sido recentemente demonstrada. Contudo apenas a formulação contendo o ácido ursólico apresentou índice de seletividade aceitável, o que está relacionado com o efeito citoprotetor do ácido ursólico. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi is a serious public health problem in Latin America and is an increasing disease around the world, mainly affecting regions with low purchasing power, and therefore Chagas disease is considered neglected by the pharmaceutical industry. Today, only one product is available, benznidazole, which has limited efficacy and is associated with several side effects. Recent studies have shown trypanocidal activity of ursolic acid, however its use is limited by the high hydrophobicity. The use of liposomal nanocarriers is recognized as a promising strategy to address this limitation and they are highly versatile and biocompatible systems. In this study, ursolic acid loaded phosphatidylcholine and cholesterol liposomes were developed using the solvent evaporation and lipid film hydration technique followed by sonication, allowing unilamellar vesicles formation with low polydispersity. From the preliminary assessment of the dispersion stability, the addition of cholesterol allowed the encapsulation efficiency maintenance when the formulation was stored at room temperature and better drug retention at 4°C (90%). After lyophilization employing sucrose 1:10 lipid:sugar molar ratio, the formulation manteined the size and size distribution and vesicle aggregation was prevented. The formulation obtained was characterized by transmission electron microscopy, with diameter between 100 and 120 nm, also observed by dynamic light scattering. The analysis by infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry showed a strong hydrogen interaction between ursolic acid and the phospholipid membrane, as well as a lower mobility of the lipid chains and glassy matrix formation which was responsible for the effective cryoprotection. In vitro drug release profile from liposomes by dialysis technique resulted in high retention of the encapsulated content and a sustained release. From in vitro biological assay using trypan blue, the ursolic acid loaded lyophilized liposomes proved to be safe up to a concentration that would be required to carry 32 ?M of the drug, considering the LLC-MK2 mammalians cell line. Regarding the trypanocidal activity of epimastigotes CL strain by MTT technique, the ursolic acid loaded liposomes showed greater efficacy than blank liposome able to causing 100% of parasite cell death, considering a possible synergism effect of ursolic acid and cholesterol, whose selectivity to the parasite membrane has been recently demonstrated. However, only the formulation containing ursolic acid showed acceptable selectivity index, which is related to the ursolic acid cytoprotective effect.

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes referentes ao número de pessoas contaminadas e daquelas que ainda permanecem expostas ao risco de infecção. As doenças tropicais desafiam as pesquisas científicas, pois os medicamentos existentes apresentam sérios efeitos colaterais. As tripanossomíases são doenças de grande importância no Brasil, como é o caso da doença de Chagas. Estudos realizados em diversos países têm relatado que muitas espécies vegetais possuem atividade contra o agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi. Ácido ursólico e seu isômero, ácido oleanólico, pertencem à classe de compostos triterpenóides e são amplamente distribuídos no reino vegetal e têm sido frequentemente isolados como mistura isomérica. Nesse sentido, a proposta para o presente estudo foi avaliar a atividade tripanocida, sobre a cepa Y e Bolívia de T. cruzi, dos triterpenos ácido ursólico e ácido oleanólico, sintetizar e avaliar a atividade tripanocida do sal derivado de ácido ursólico. As substâncias foram administradas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg por via intraperitoneal e oral, após a avaliação da dose letal média (DL50). As três substâncias empregadas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg, administradas por via intraperitoneal não foram capazes de reduzir a parasitemia dos animais experimentalmente infectados com as cepas Y e Bolívia de T. cruzi. Entretanto, as três substâncias exibiram atividade tripanocida significativa, na concentração de 50 mg/kg, administradas por via oral, em animais infectados com a cepa Y de T. cruzi. Para a cepa Bolívia de T. cruzi, as substâncias administradas por via oral exibiram atividade biológica na concentração de 20 mg/kg, sendo significativa apenas para o triterpeno ácido ursólico. A análise histológica realizada não demonstrou uma correlação significativa entre os níveis parasitêmicos e o parasitismo tecidual, para todos os grupos avaliados. A avaliação do perfil hepatobiliar e renal das substâncias foi realizada a fim de se verificar possíveis efeitos tóxicos das mesmas. Entretanto, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados e o grupo controle, indicando que o aumento dos níveis parasitêmicos não está associado ao efeito das substâncias no tecido. Através da avaliação do efeito dos triterpenos sobre a resposta imune, verificamos uma diminuição dos níveis plasmáticos de IFN- e um aumento das concentrações de IL-10. Dessa maneira, nós sugerimos que o tratamento com essas substâncias pode direcionar a resposta imune para o padrão Th2 e, em conseqüência desse efeito imunossupressor, uma maior quantidade de formas tripomastigotas poderia ser observada na circulação do hospedeiro. / Chagas disease is a public health problem with worrisome data on the number of infected people, not to mention the population that still remains at risk of infection. Tropical diseases defy scientific research since the existing drugs have serious side effects. Trypanosomiases, such as Chagas disease, are of great importance in Brazil. Studies in several countries have reported that many plant species display activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Ursolic acid and its isomer, oleanolic acid, belong to a class of triterpenoid compounds that is widely distributed in the plant kingdom and has frequently been isolated as an isomeric mixture. In the present study, the trypanocidal activity of the triterpenoids ursolic acid and oleanolic acid was evaluated against the Y and Bolivia strains of T. cruzi. In addition, the potassium salt derivative of ursolic acid was synthesized and also tested. The triterpenoids were administered intraperitoneally and orally at concentrations of 20 and 50 mg / kg, after evaluation of the median lethal dose (LD50). At the concentrations of 20 and 50 mg / kg, the intraperitoneal administration of each of the substances was not able to reduce parasitemia of the animals infected with the Y and Bolivia strains of T. cruzi. However, ursolic and oleanolic acid, as well as the potassium salt derivative of ursolic acid exhibited significant trypanocidal activity at a concentration of 50 mg / kg when they were orally administered to animals infected with the Y strain of T. cruzi. On the other hand, oral administration of the tested compounds at a concentration of 20 mg / kg evidenced biological activity, which was significant for ursolic acid only. For the most of studied groups, histological analysis did not demonstrate a significant correlation between the levels of parasitemia and tissue parasitism. Determination and evaluation of biochemical parameters in the serum of experimental animals was performed, to assess the hepatic, biliary, and renal toxic effects of the substances. There were no statistically significant differences between the treated groups and the control group, indicating that the increase in parasitemia is not associated with the effects of the substances in the tissue. We suggest the hypothesis of an immunosuppressive effect, since there was a decreased plasma levels of IFN- after treatment with the triterpenes. Moreover, the treated groups also exhibited increased levels of IL-10. Therefore, we suggest that treatment with the substances could be directing the immune response toward the Th2 type and, as a consequence of this immunosuppressive effect, a greater amount of trypomastigotes could be observed in the circulation of the host.

Orientador: Marcos Antonio Corrêa / Resumo: O aumento da preocupação com a estética e saúde corporal vem elevando a demanda por produtos cosméticos contendo ativos que previnam o envelhecimento e outras alterações cutâneas. O ácido ursólico (AU), ativo natural extraído de plantas como o alecrim e o manjericão, tem se demonstrado interessante para incorporação em cosméticos por possuir potencial antioxidante, despigmentante, propriedade antimicrobiana, entre outras. Este trabalho teve como objetivo avaliar a possibilidade da utilização do AU como um ativo cosmético multifuncional através da avaliação da eficácia e citotoxicidade in vitro do AU, bem como o preparo e avaliação de uma emulsão contendo o ativo. O potencial antioxidante do AU foi avaliado por meio de métodos de inibição de radicais como o 1,1-difenil-2-picrilhidrazila (DPPH•) e o 2,2 -azino bis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid (ABTS•+), tendo demonstrado atividade antioxidante, com IC50 de 235,61 µg/mL para técnica com DPPH• e 107,17 µg/mL para técnica com ABTS•+. A atividade despigmentante foi verificada através da inibição da enzima tirosinase, utilizando 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) como substrato, e apresentando como resultado um IC50 de 338,00 µg/mL. Para a avaliação da atividade antimicrobiana diversas cepas foram testadas a partir da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de diluição em microplacas, e da concentração bactericida mínima (CBM) pela replicação em placa de Petri, seguindo suplemento M100-S16 do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Erika Crispim Resende - 2013.pdf: 9225841 bytes, checksum: 704ac58eda3cb376fd2c234dcc302a24 (MD5) Previous issue date: 2013-06-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / O ácido ursólico (AU) é um composto triterpenoide pentacíclico que ocorre em grande variedade de plantas do Cerrado. Apresenta atividades anti-inflamatória, antioxidante, antitumoral e ação inibidora de enzimas responsáveis pelo envelhecimento cutâneo. Devido à sua reduzida hidrossolubilidade, a incorporação do AU em produtos de uso tópico representa um desafio farmacotécnico. Neste sentido, a produção de nanossistemas pode ser considerada uma alternativa promissora. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados contendo AU, investigar a atividade citotóxica, antioxidante, antidegradação da matriz celular, toxicidade, avaliar o efeito de permeação cutânea ex vivo e in vivo do AU e verificar a eficácia no tratamento de manchas cutâneas e prevenção de rugas. Inicialmente o AU foi submetido aos ensaios de citotoxicidade em células B16-F10 e Balb/c 3T3 por MTT e em Balb/c 3T3 pela captação do corante vermelho neutro. A morfologia das células B16-F10 tratadas com AU foi avaliada através de coloração de Giemsa. A atividade antioxidante celular (AAC) do AU foi realizada em células NIH-3T3 pelo método de diclorofluoresceína. A capacidade do AU em inibir enzimas (elastase, colagenase e tirosinase) foi avaliada por métodos espectrofotométricos. Os Lipossomas (LPs, obtidos pelo método de hidratação do filme lipídico), nanopartículas poliméricas (NPs, preparadas através da técnica de precipitação do polímero pré-formado) e as microemulsões (MEs, obtidas por emulsificação espontânea) foram caracterizados quanto à distribuição do tamanho, índice de polidispersão (PdI), pH, potencial zeta e teor do AU incorporado. Com a finalidade de veicular as MEs, uma emulsão (EM) foi formulada. O índice de refração (IR) foi determinado para os componentes das MEs e das EMs. A estabilidade física foi por observação visual e testes de centrifugação. Métodos cromatográficos com detector ultravioleta e de massas (CLAE-UV e CLAE-EM/EM) foram desenvolvidos e validados para quantificar o AU nas formulações e nos ensaios de permeação. Os testes pré-clínicos da EM com ME (AU 0,02%) e da ME (AU 0,2%) envolveram ensaios de contagem de micro-organismos totais, toxicidade oral aguda em ratos, irritação ocular e cutânea primária em coelhos, sensibilização cutânea em cobaias, toxicidade dermal aguda em ratos, mutagenicidade in vitro e micronúcleo em camundongos. Foram realizadas permeações cutâneas ex-vivo (utilizando células de Franz e pele de orelha de porco) e in vivo (pela técnica de tape stripping em antebraços de voluntários sadios). Nos estudos ex-vivo uma solução receptora de lauril sulfato de sódio a 2,5% (pH 7,4, 37°C a 300rpm) foi utilizada atendendo as condições sink. Após 24 horas, a solução receptora, o estrato córneo e a epiderme viável foram analisados quanto à presença do AU. A permeação in vivo teve a finalidade de obter informações sobre o tempo de exposição na pele de voluntários sadios à dose de AU presente nas formulações. O estudo clínico foi mono-cêntrico, aberto, prospectivo com dois tratamentos em um período utilizando-se quatro voluntários masculinos sadios (18–28 anos). Os parâmetros dermofarmacocinéticos da área sob a curva do perfil de penetração de AU ao longo das fitas (ASC0-t) e do tempo necessário para que o AU atingisse a metade do efeito máximo predito ET50 foram avaliados. A integridade cutânea dos voluntários foi monitorada pela perda de água transepidermal. As formulações (60mg) foram aplicadas em 5 sítios (2,0 cm2) em cada antebraço ficando em contato com a pele por 30 minutos, 1 h, 2 h, 4 h e 6 h (sítios 1 ao 5, respectivamente). Decorrido o tempo de cada sítio, a técnica de tape stripping foi realizada e o AU quantificado. 32 mulheres (35-63 anos) foram instruídas a utilizar a ME contendo AU por 30 dias em um estudo de eficácia clínica dermatológica de aceitabilidade cutânea e de apreciabilidade cosmética. Após o tratamento, as voluntárias fizeram avaliação clínica final para comparação do aspecto do rosto (D30) com o início do tratamento (D0). A eficácia clínica foi analisada quanto à uniformidade do tom da pele, manchas, linhas de expressão e rugas. Já a apreciabilidade cosmética foi feita por meio de um questionário. Os resultados dos ensaios da concentração inibitória CI50 de AU para B16-F10 foi de 15,70μM e de 22,09 μM para 3T3. A CI50 de AU em células de melanoma confirmou a capacidade antitumoral do AU. Ocorreram alterações na morfologia das células B16-F10 quando tratadas com AU próximo ao valor da CI50 sugerindo apoptose. O AU exibiu atividade antioxidante celular inibindo cerca de 65% a oxidação da quercetina, mas não foi possível observar esta atividade quando o AU foi submetido a ensaios in vitro com reações radicalares (DPPH•). Nos ensaios enzimáticos, o AU inibiu ±25% da colagenase, ±22% da tirosinase e ±11% da elastase. O método CLAE-EM/EM foi validado sendo linear com R>0,99. Apresentou precisão e exatidão com desvio padrão relativo (DPR%) abaixo de 10% e recuperação variando de 93,3 a 103,4%. Os LPs e as NPs apresentaram instabilidade com vazamento de AU e baixa encapsulação. As MEs apresentaram pH dentro da faixa aceitável para aplicação tópica e maior incorporação de AU do que os sistemas de LPs e NPs. A ME incorporada à emulsão apresentou estabilidade a temperatura ambiente. A ME e a emulsão contendo AU demonstraram perfis reológicos semelhantes evidenciando ausência de propriedade tixotrópica. Os IRs variaram de 1,3388 para emulsão sem ME a 1,4700 para os tensoativos. As MEs apresentaram valores intermediários de IR concluindo eram do tipo água em óleo (A/O). Não foi observada degradação do AU analisado por CLAE-EM/EM mesmo após um ano de preparação da ME e na emulsão contendo ME. Ensaios pré-clínicos de toxicidade demonstraram que a EM contendo 10% de ME (0,02% de AU) e a microemulsão (0,2% de AU) não apresentaram toxicidade oral, não foram irritantes para os olhos nem para a pele e não foram mutagênicas. Nos estudos de permeação ex-vivo, cerca de 1,5 vezes mais AU permeou a pele quando incorporado na ME, já na emulsão contendo AU disperso (não microencapsulado), o AU ficou mais retido no estrato córneo, cerca de 5,3 vezes mais que ao valor encontrado na epiderme. Na ME, a concentração do AU na epiderme viável foi aproximadamente 7 vezes maior quando comparado ao AU livre (emulsão). Na ME veiculada na emulsão cerca de 7% de AU foi quantificado no estrato córneo e cerca de 32% foi encontrado na epiderme viável. Nos estudos de permeação in vivo, não foi verificada nenhuma ocorrência de reação adversa. A metade do efeito máximo predito (ET50) para a formulação de emulsão contendo AU disperso foi alcançada em aproximadamente 49 minutos após a aplicação do produto na pele, já a formulação de emulsão contendo microemulsão demonstrou um perfil de duração da dose do AU independentemente do tempo de exposição sendo que o efeito máximo predito para a absorção permaneceu constante ao longo do tempo. A avaliação clínica após tratamento com a ME mostrou eficácia de 3% em relação à uniformidade do tom da pele, 16% de eficácia em relação às manchas, 66% em relação às linhas de expressão e 59% de eficácia contra as rugas. Já a avaliação da opinião das voluntárias, 44% perceberam melhora na sensação de pele mais jovem, 41% perceberam melhora na sensação de pele mais bela e 61% referiram gostar do produto. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a microemulsão contendo AU é uma forte candidata a agente terapêutico tópico podendo veicular o AU para camadas mais profundas da pele. Além disto, foi verificado que o AU é capaz de prevenir o aparecimento de rugas, inibir a ação de enzimas que degradam as proteínas estruturais da pele, agir contra células de melanoma e como antioxidante. / O ácido ursólico (AU) é um composto triterpenoide pentacíclico que ocorre em grande variedade de plantas do Cerrado. Apresenta atividades anti-inflamatória, antioxidante, antitumoral e ação inibidora de enzimas responsáveis pelo envelhecimento cutâneo. Devido à sua reduzida hidrossolubilidade, a incorporação do AU em produtos de uso tópico representa um desafio farmacotécnico. Neste sentido, a produção de nanossistemas pode ser considerada uma alternativa promissora. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados contendo AU, investigar a atividade citotóxica, antioxidante, antidegradação da matriz celular, toxicidade, avaliar o efeito de permeação cutânea ex vivo e in vivo do AU e verificar a eficácia no tratamento de manchas cutâneas e prevenção de rugas. Inicialmente o AU foi submetido aos ensaios de citotoxicidade em células B16-F10 e Balb/c 3T3 por MTT e em Balb/c 3T3 pela captação do corante vermelho neutro. A morfologia das células B16-F10 tratadas com AU foi avaliada através de coloração de Giemsa. A atividade antioxidante celular (AAC) do AU foi realizada em células NIH-3T3 pelo método de diclorofluoresceína. A capacidade do AU em inibir enzimas (elastase, colagenase e tirosinase) foi avaliada por métodos espectrofotométricos. Os Lipossomas (LPs, obtidos pelo método de hidratação do filme lipídico), nanopartículas poliméricas (NPs, preparadas através da técnica de precipitação do polímero pré-formado) e as microemulsões (MEs, obtidas por emulsificação espontânea) foram caracterizados quanto à distribuição do tamanho, índice de polidispersão (PdI), pH, potencial zeta e teor do AU incorporado. Com a finalidade de veicular as MEs, uma emulsão (EM) foi formulada. O índice de refração (IR) foi determinado para os componentes das MEs e das EMs. A estabilidade física foi por observação visual e testes de centrifugação. Métodos cromatográficos com detector ultravioleta e de massas (CLAE-UV e CLAE-EM/EM) foram desenvolvidos e validados para quantificar o AU nas formulações e nos ensaios de permeação. Os testes pré-clínicos da EM com ME (AU 0,02%) e da ME (AU 0,2%) envolveram ensaios de contagem de micro-organismos totais, toxicidade oral aguda em ratos, irritação ocular e cutânea primária em coelhos, sensibilização cutânea em cobaias, toxicidade dermal aguda em ratos, mutagenicidade in vitro e micronúcleo em camundongos. Foram realizadas permeações cutâneas ex-vivo (utilizando células de Franz e pele de orelha de porco) e in vivo (pela técnica de tape stripping em antebraços de voluntários sadios). Nos estudos ex-vivo uma solução receptora de lauril sulfato de sódio a 2,5% (pH 7,4, 37°C a 300rpm) foi utilizada atendendo as condições sink. Após 24 horas, a solução receptora, o estrato córneo e a epiderme viável foram analisados quanto à presença do AU. A permeação in vivo teve a finalidade de obter informações sobre o tempo de exposição na pele de voluntários sadios à dose de AU presente nas formulações. O estudo clínico foi mono-cêntrico, aberto, prospectivo com dois tratamentos em um período utilizando-se quatro voluntários masculinos sadios (18–28 anos). Os parâmetros dermofarmacocinéticos da área sob a curva do perfil de penetração de AU ao longo das fitas (ASC0-t) e do tempo necessário para que o AU atingisse a metade do efeito máximo predito ET50 foram avaliados. A integridade cutânea dos voluntários foi monitorada pela perda de água transepidermal. As formulações (60mg) foram aplicadas em 5 sítios (2,0 cm2) em cada antebraço ficando em contato com a pele por 30 minutos, 1 h, 2 h, 4 h e 6 h (sítios 1 ao 5, respectivamente). Decorrido o tempo de cada sítio, a técnica de tape stripping foi realizada e o AU quantificado. 32 mulheres (35-63 anos) foram instruídas a utilizar a ME contendo AU por 30 dias em um estudo de eficácia clínica dermatológica de aceitabilidade cutânea e de apreciabilidade cosmética. Após o tratamento, as voluntárias fizeram avaliação clínica final para comparação do aspecto do rosto (D30) com o início do tratamento (D0). A eficácia clínica foi analisada quanto à uniformidade do tom da pele, manchas, linhas de expressão e rugas. Já a apreciabilidade cosmética foi feita por meio de um questionário. Os resultados dos ensaios da concentração inibitória CI50 de AU para B16-F10 foi de 15,70μM e de 22,09 μM para 3T3. A CI50 de AU em células de melanoma confirmou a capacidade antitumoral do AU. Ocorreram alterações na morfologia das células B16-F10 quando tratadas com AU próximo ao valor da CI50 sugerindo apoptose. O AU exibiu atividade antioxidante celular inibindo cerca de 65% a oxidação da quercetina, mas não foi possível observar esta atividade quando o AU foi submetido a ensaios in vitro com reações radicalares (DPPH•). Nos ensaios enzimáticos, o AU inibiu ±25% da colagenase, ±22% da tirosinase e ±11% da elastase. O método CLAE-EM/EM foi validado sendo linear com R>0,99. Apresentou precisão e exatidão com desvio padrão relativo (DPR%) abaixo de 10% e recuperação variando de 93,3 a 103,4%. Os LPs e as NPs apresentaram instabilidade com vazamento de AU e baixa encapsulação. As MEs apresentaram pH dentro da faixa aceitável para aplicação tópica e maior incorporação de AU do que os sistemas de LPs e NPs. A ME incorporada à emulsão apresentou estabilidade a temperatura ambiente. A ME e a emulsão contendo AU demonstraram perfis reológicos semelhantes evidenciando ausência de propriedade tixotrópica. Os IRs variaram de 1,3388 para emulsão sem ME a 1,4700 para os tensoativos. As MEs apresentaram valores intermediários de IR concluindo eram do tipo água em óleo (A/O). Não foi observada degradação do AU analisado por CLAE-EM/EM mesmo após um ano de preparação da ME e na emulsão contendo ME. Ensaios pré-clínicos de toxicidade demonstraram que a EM contendo 10% de ME (0,02% de AU) e a microemulsão (0,2% de AU) não apresentaram toxicidade oral, não foram irritantes para os olhos nem para a pele e não foram mutagênicas. Nos estudos de permeação ex-vivo, cerca de 1,5 vezes mais AU permeou a pele quando incorporado na ME, já na emulsão contendo AU disperso (não microencapsulado), o AU ficou mais retido no estrato córneo, cerca de 5,3 vezes mais que ao valor encontrado na epiderme. Na ME, a concentração do AU na epiderme viável foi aproximadamente 7 vezes maior quando comparado ao AU livre (emulsão). Na ME veiculada na emulsão cerca de 7% de AU foi quantificado no estrato córneo e cerca de 32% foi encontrado na epiderme viável. Nos estudos de permeação in vivo, não foi verificada nenhuma ocorrência de reação adversa. A metade do efeito máximo predito (ET50) para a formulação de emulsão contendo AU disperso foi alcançada em aproximadamente 49 minutos após a aplicação do produto na pele, já a formulação de emulsão contendo microemulsão demonstrou um perfil de duração da dose do AU independentemente do tempo de exposição sendo que o efeito máximo predito para a absorção permaneceu constante ao longo do tempo. A avaliação clínica após tratamento com a ME mostrou eficácia de 3% em relação à uniformidade do tom da pele, 16% de eficácia em relação às manchas, 66% em relação às linhas de expressão e 59% de eficácia contra as rugas. Já a avaliação da opinião das voluntárias, 44% perceberam melhora na sensação de pele mais jovem, 41% perceberam melhora na sensação de pele mais bela e 61% referiram gostar do produto. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a microemulsão contendo AU é uma forte candidata a agente terapêutico tópico podendo veicular o AU para camadas mais profundas da pele. Além disto, foi verificado que o AU é capaz de prevenir o aparecimento de rugas, inibir a ação de enzimas que degradam as proteínas estruturais da pele, agir contra células de melanoma e como antioxidante.

A doença de Chagas representa um grave problema de saúde pública, afetando principalmente a população de baixa renda, o que a torna negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente, existe apenas um fármaco disponível para o tratamento, o benzonidazol, porém este apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. O ácido ursólico, um triterpeno de origem natural, possui atividade tripanocida, porém, sua solubilidade aquosa baixa limita sua biodisponibilidade. Para o aumento da biodisponibilidade tem destaque o uso das dispersões sólidas, onde fármacos lipofílicos são dispersos molecularmente ou no estado amorfo em carreadores hidrofílicos, acarretando um aumento do perfil de dissolução. Neste trabalho, dispersões sólidas e misturas físicas contendo ácido ursólico foram preparadas com os carreadores polietilenoglicol 6000, Gelucire 50/13 e dióxido de silício coloidal, Poloxamer 407 e caprato de sódio, empregando as técnicas de fusão e evaporação do solvente. Os sistemas foram caracterizados através das técnicas de microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia do infravermelho com transformada de Fourier, calorimetria exploratória diferencial, microscopia em hot stage e difratometria de raios-X. Em outra etapa, os produtos foram avaliados quanto à solubilidade aquosa, perfil de dissolução in vitro, citotoxicidade em linhagem celular LLC-MK2, e atividade tripanocida em modelo animal. Em conjunto, os resultados mostraram que o fármaco não teve suas propriedades afetadas pela manipulação em misturas físicas, mantendo sua estrutura cristalina. Por outro lado, os experimentos de difratometria de raios-X e as observações microscópicas em hot stage revelaram a alteração do ácido ursólico para o estado amorfo, principalmente para os sistemas preparados pelo método do solvente, enquanto que algumas formulações manipuladas pelo método da fusão exibiram alterações polimórficas. Além disso, evidenciaram-se interações intermoleculares do tipo ligações de hidrogênio para as dispersões sólidas preparadas pelo método do solvente. As alterações do fármaco observadas para as dispersões sólidas preparadas pelo método do solvente aumentaram sua solubilidade e melhoraram seu perfil de dissolução comparado às dispersões sólidas pelo método da fusão e misturas físicas, sendo este aumento maior para os sistemas compostos por Poloxamer 407 + caprato de sódio, seguido por Poloxamer 407, Gelucire 50/13 + dióxido de silício coloidal e PEG 6000, o que pode ser atribuído ao poder tensoativo dos três primeiros carreadores. As formulações mostram-se seguras até a concentração de 128 ?M do fármaco, através da avaliação da citotoxicidade. Por último, o ursólico teve um aumento significativo da atividade tripanocida para a formulação composta pelo tensoativo Poloxamer 407 junto com o promotor de absorção oral caprato de sódio, manipulada pelo método do solvente, sugerindo o aumento da biodisponibilidade do fármaco. / Chagas disease represents a severe problem in public health, affecting mainly the low-income population, making it neglected by the pharmaceutical industry. Currently, there is only one drug available for treatment, benznidazol, however, it presents limited efficacy and is associated with several side effects. Ursolic acid, a naturally occurring triterpene, presents trypanocidal activity, but its low water solubility limits the bioavailability. To increase the biovailability, solid dispersions, where lipophilic drugs are molecularly or in the amorphous state dispersed in hydrophilic carriers, can play an important role, resulting in enhanced dissolution profile of the drug. In this work, solid dispersions and physical mixtures containing ursolic acid were prepared with Polyethyleneglycol 6000, Gelucire 50/13 and silicon dioxide, Poloxamer 407 and sodium caprate as carriers, employing the fusion and solvent evaporation techniques. The products were characterized through scanning electron microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, differential scanning calorimetry, hot stage microscopy and X-ray diffractometry. In another step, the formulations were evaluated regarding the aqueous solubility, in vitro dissolution profile, citotoxicity using LLC-MK2 cell line, and trypanocidal activity in animal model. Together, results showed that the drug did not suffer any change in its properties when in physical mixture. On the other hand, X-ray diffractometry and hot stage microscopy revealed a transition from the crystalline to the amorphous state for ursolic acid, especially for the products prepared by the solvent method. In the fusion method, some formulations exhibited a polymorphic change. Moreover, we identified intermolecular interactions between drug and carrier by hydrogen bonding in the products prepared by the solvent method. These changes observed for solid dispersions prepared by the solvent method resulted in increased water solubility and dissolution profile and these effects were higher for the products prepared with Poloxamer 407 + sodium caprate, followed by Polomer 407 alone, Gelucire 50/13 + silicon dioxide and PEG 6000, which can be attributed to the surfactant property of the three first carriers. The formulations were safe up to 128 ?M of the drug, showed by the citotoxicity evaluation. Very importantly, we highlight that ursolic acid had a significant increase in the trypanocidal activity for the product prepared with the surfactant Poloxamer 407 and the penetration enhancer sodium caprate, prepared by the solvent method, suggesting that in this composition ursolic acid was more bioavailable.

A doença de Chagas causada pelo Trypanosoma cruzi representa um grave problema de saúde pública na América Latina e cada vez mais em todo o mundo, afetando principalmente regiões de baixo poder aquisitivo, e por isso negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente apenas um fármaco está disponível, o benzonidazol, o qual apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. Estudos recentes demonstraram atividade tripanocida do ácido ursólico, entretanto sua utilização é limitada pela alta hidrofobicidade, sendo o uso dos nanocarreadores lipossomais reconhecido como uma estratégia promissora para solucionar tal limitação, além de serem sistemas altamente versáteis e biocompatíveis. Neste trabalho, foram desenvolvidos lipossomas de fosfatidilcolina e colesterol contendo ácido ursólico pela técnica da evaporação do solvente e hidratação do filme lipídico seguida de sonicação, permitindo a obtenção de vesículas unilamelares e com baixa polidispersividade. A partir da avaliação preliminar da estabilidade das dispersões, a adição do colesterol na razão molar 10:1 fosfatidilcolina:colesterol foi essencial para a manutenção do conteúdo encapsulado quando a formulação foi estocada em temperatura ambiente e melhor retenção do conteúdo a 4°C (90%). Após a liofilização o emprego de sucrose na razão molar 1:10 lipídeo:açúcar, a formulação manteve o tamanho e distribuição de tamanho e impediu a agregação das vesículas. A formulação obtida foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão, apresentando diâmetro entre 100 e 120 nm, também observado pelo espalhamento dinâmico da luz. As análises por espectroscopia no infravermelho e calorimetria exploratória diferencial demonstraram uma forte interação do fármaco com a membrana fosfolipídica por interações de hidrogênio, assim como uma menor mobilidade das cadeias lipídicas e formação de uma matriz vítrea a qual foi responsável pela efetiva crioproteção das vesículas. Estudo in vitro do perfil de liberação do fármaco a partir dos lipossomas pela técnica da diálise resultou em alta retenção do conteúdo encapsulado e uma liberação sustentada deste. A partir de ensaio biológico in vitro empregando azul de trypan, a formulação liofilizada contendo ácido ursólico se mostrou segura até a concentração em que seria necessária para carrear 32 ?M do fármaco, considerando a linhagem de mamíferos LLC-MK2. Em relação à atividade tripanocida em linhagem da cepa CL da forma epimastigota empregando MTT, o lipossoma contendo o fármaco foi capaz de causar morte celular do parasita em 100%, considerando-se um possível efeito sinérgico do ácido ursólico e o colesterol, cuja seletividade à membrana do parasita tem sido recentemente demonstrada. Contudo apenas a formulação contendo o ácido ursólico apresentou índice de seletividade aceitável, o que está relacionado com o efeito citoprotetor do ácido ursólico. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi is a serious public health problem in Latin America and is an increasing disease around the world, mainly affecting regions with low purchasing power, and therefore Chagas disease is considered neglected by the pharmaceutical industry. Today, only one product is available, benznidazole, which has limited efficacy and is associated with several side effects. Recent studies have shown trypanocidal activity of ursolic acid, however its use is limited by the high hydrophobicity. The use of liposomal nanocarriers is recognized as a promising strategy to address this limitation and they are highly versatile and biocompatible systems. In this study, ursolic acid loaded phosphatidylcholine and cholesterol liposomes were developed using the solvent evaporation and lipid film hydration technique followed by sonication, allowing unilamellar vesicles formation with low polydispersity. From the preliminary assessment of the dispersion stability, the addition of cholesterol allowed the encapsulation efficiency maintenance when the formulation was stored at room temperature and better drug retention at 4°C (90%). After lyophilization employing sucrose 1:10 lipid:sugar molar ratio, the formulation manteined the size and size distribution and vesicle aggregation was prevented. The formulation obtained was characterized by transmission electron microscopy, with diameter between 100 and 120 nm, also observed by dynamic light scattering. The analysis by infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry showed a strong hydrogen interaction between ursolic acid and the phospholipid membrane, as well as a lower mobility of the lipid chains and glassy matrix formation which was responsible for the effective cryoprotection. In vitro drug release profile from liposomes by dialysis technique resulted in high retention of the encapsulated content and a sustained release. From in vitro biological assay using trypan blue, the ursolic acid loaded lyophilized liposomes proved to be safe up to a concentration that would be required to carry 32 ?M of the drug, considering the LLC-MK2 mammalians cell line. Regarding the trypanocidal activity of epimastigotes CL strain by MTT technique, the ursolic acid loaded liposomes showed greater efficacy than blank liposome able to causing 100% of parasite cell death, considering a possible synergism effect of ursolic acid and cholesterol, whose selectivity to the parasite membrane has been recently demonstrated. However, only the formulation containing ursolic acid showed acceptable selectivity index, which is related to the ursolic acid cytoprotective effect.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present work describes the synthesis of twenty-two new derivatives (4-25) from stigmasterol (1) and seven new derivatives (26-32) from ursolic acid (2) via esterification and coupling reactions with different amino acids. All the structures of the compounds were confirmed by 1H and 13C NMR. The derivatives were tested for their antimicrobial activity, antitumor activity against cancer cells HT -29 (colorectal) and inhibition of POP, AChE and BChE enzymes. In antimicrobial activity among the compounds tested, ursolic acid (1) showed the greatest potential for inhibition. The results obtained from enzyme inhibition tests were satisfactory, generally the activities of the starting compounds 1 and 2 were increased after the introduction of the amino acids. Among the derivatives evaluated, ursolic-proline-proline-OH acid (32) showed the highest inhibitory capacity of AChE and BChE enzymes and may be considered a dual cholinesterase inhibitor, which can provide greater efficacy in the treatment of Alzheimer's disease. In the evaluation of the antitumor effect, after the first 24 h, most of ursolic acid derivatives showed inhibition effect in cell viability between 33.7 and 70%. After 72 h, the derivative 32 showed the best performance because it did not increase the number of viable cells at any concentration tested, indicating that this compound may be a candidate for antitumor drug. / O presente trabalho descreve a síntese de vinte e dois novos derivados (4 - 25) do estigmasterol (1) e sete novos derivados (26 - 32) do ácido ursólico (2) através de reações de esterificação e de acoplamento com diferentes aminoácidos. Todas as estruturas dos compostos foram confirmadas por RMN 1H e RMN 13C. Os derivados foram testados quanto à sua atividade antimicrobiana, atividade antitumoral frente à célula cancerígena HT-29 (colorretal) e de inibição das enzimas POP, AChE e BChE. Na atividade antimicrobiana, dentre os compostos testados, o ácido ursólico (1) demonstrou o maior potencial de inibição. Os resultados obtidos nos ensaios de inibição enzimática foram satisfatórios, geralmente ocorrendo um aumento da atividade dos compostos de partida 1 e 2 após a introdução dos aminoácidos. Dentre os derivados avaliados, o ácido ursólico-prolina-prolina-OH (32) apresentou a maior capacidade inibitória das enzimas AChE e BChE, podendo ser considerado um inibidor colinesterásico dual, o que pode proporcionar maior eficácia no tratamento da doença de Alzheimer. Na avaliação do efeito antitumoral, após as primeiras 24 h, a maioria dos derivados do ácido ursólico demonstrou efeito de inibição da viabilidade celular entre 33,7 e 70 %. Após 72 h, o derivado 32 foi o que apresentou melhor desempenho, pois não aumentou o número de células viáveis em nenhuma concentração testada, o que indica que este composto pode ser um candidato a fármaco antitumoral.

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes referentes ao número de pessoas contaminadas e daquelas que ainda permanecem expostas ao risco de infecção. As doenças tropicais desafiam as pesquisas científicas, pois os medicamentos existentes apresentam sérios efeitos colaterais. As tripanossomíases são doenças de grande importância no Brasil, como é o caso da doença de Chagas. Estudos realizados em diversos países têm relatado que muitas espécies vegetais possuem atividade contra o agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi. Ácido ursólico e seu isômero, ácido oleanólico, pertencem à classe de compostos triterpenóides e são amplamente distribuídos no reino vegetal e têm sido frequentemente isolados como mistura isomérica. Nesse sentido, a proposta para o presente estudo foi avaliar a atividade tripanocida, sobre a cepa Y e Bolívia de T. cruzi, dos triterpenos ácido ursólico e ácido oleanólico, sintetizar e avaliar a atividade tripanocida do sal derivado de ácido ursólico. As substâncias foram administradas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg por via intraperitoneal e oral, após a avaliação da dose letal média (DL50). As três substâncias empregadas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg, administradas por via intraperitoneal não foram capazes de reduzir a parasitemia dos animais experimentalmente infectados com as cepas Y e Bolívia de T. cruzi. Entretanto, as três substâncias exibiram atividade tripanocida significativa, na concentração de 50 mg/kg, administradas por via oral, em animais infectados com a cepa Y de T. cruzi. Para a cepa Bolívia de T. cruzi, as substâncias administradas por via oral exibiram atividade biológica na concentração de 20 mg/kg, sendo significativa apenas para o triterpeno ácido ursólico. A análise histológica realizada não demonstrou uma correlação significativa entre os níveis parasitêmicos e o parasitismo tecidual, para todos os grupos avaliados. A avaliação do perfil hepatobiliar e renal das substâncias foi realizada a fim de se verificar possíveis efeitos tóxicos das mesmas. Entretanto, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados e o grupo controle, indicando que o aumento dos níveis parasitêmicos não está associado ao efeito das substâncias no tecido. Através da avaliação do efeito dos triterpenos sobre a resposta imune, verificamos uma diminuição dos níveis plasmáticos de IFN- e um aumento das concentrações de IL-10. Dessa maneira, nós sugerimos que o tratamento com essas substâncias pode direcionar a resposta imune para o padrão Th2 e, em conseqüência desse efeito imunossupressor, uma maior quantidade de formas tripomastigotas poderia ser observada na circulação do hospedeiro. / Chagas disease is a public health problem with worrisome data on the number of infected people, not to mention the population that still remains at risk of infection. Tropical diseases defy scientific research since the existing drugs have serious side effects. Trypanosomiases, such as Chagas disease, are of great importance in Brazil. Studies in several countries have reported that many plant species display activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Ursolic acid and its isomer, oleanolic acid, belong to a class of triterpenoid compounds that is widely distributed in the plant kingdom and has frequently been isolated as an isomeric mixture. In the present study, the trypanocidal activity of the triterpenoids ursolic acid and oleanolic acid was evaluated against the Y and Bolivia strains of T. cruzi. In addition, the potassium salt derivative of ursolic acid was synthesized and also tested. The triterpenoids were administered intraperitoneally and orally at concentrations of 20 and 50 mg / kg, after evaluation of the median lethal dose (LD50). At the concentrations of 20 and 50 mg / kg, the intraperitoneal administration of each of the substances was not able to reduce parasitemia of the animals infected with the Y and Bolivia strains of T. cruzi. However, ursolic and oleanolic acid, as well as the potassium salt derivative of ursolic acid exhibited significant trypanocidal activity at a concentration of 50 mg / kg when they were orally administered to animals infected with the Y strain of T. cruzi. On the other hand, oral administration of the tested compounds at a concentration of 20 mg / kg evidenced biological activity, which was significant for ursolic acid only. For the most of studied groups, histological analysis did not demonstrate a significant correlation between the levels of parasitemia and tissue parasitism. Determination and evaluation of biochemical parameters in the serum of experimental animals was performed, to assess the hepatic, biliary, and renal toxic effects of the substances. There were no statistically significant differences between the treated groups and the control group, indicating that the increase in parasitemia is not associated with the effects of the substances in the tissue. We suggest the hypothesis of an immunosuppressive effect, since there was a decreased plasma levels of IFN- after treatment with the triterpenes. Moreover, the treated groups also exhibited increased levels of IL-10. Therefore, we suggest that treatment with the substances could be directing the immune response toward the Th2 type and, as a consequence of this immunosuppressive effect, a greater amount of trypomastigotes could be observed in the circulation of the host.

Esta tese alia dois enfoques principais dentro da Química Farmacêutica. Por um lado, busca explorar uma nova fonte de insumos naturais, cascas de Malus  domestica, com vistas a obtenção dos triterpenos ácidos ursólico (AU) e betulínico (AB); e por outro lado, estuda a relação dos derivados triterpênicos semissintéticos obtidos com a proteína-alvo (PfATP6) destacada atualmente na literatura da terapia da malária com vistas ao planejamento de novos antimaláricos. O primeiro Capítulo inclui o desenvolvimento de um método eficiente, fácil e extremamente rápido onde são combinadas as técnicas de extração por ultrassom (UAE) e análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a Detector de Espectroscopia de Massas (LC-MS), para identificação e doseamento dos ácidos ursólico (AU) e betulínico (BA) em extratos de cascas frescas de maçã de cinco clones das cultivares Gala e Fuji (“Baigent”, “Fuji Mishima”, “Fuji Suprema”, “Fuji Select” and “Maxi Gala”) oriundas da Região Sul do Brasil. Os parâmetros cromatográficos do método analítico incluem: ionização por eletro spray em modo positivo (ESI+), fluxo de 1,0 mL/min, em modo de eluição isocrático, consistindo de 80% acetonitrila e 20% acetato de amônio 10 mM em pH 6,0 e temperatura ambiente. O método desenvolvido foi validado e mostrou ser seletivo, sensível (LOD e LOQ de 0,087 e 0,266 μg/mL para BA, e 0,398 e 2,117 μg/ mL para UA), coeficiente de regressão linear (r >0.99), preciso, exato e robusto para os analitos de interesse. A otimização do método combinado de UAE com LC-MS permitiu concluir os procedimentos de extração e análise em tempo inferior a 4 h, uma vez que o método não requer a secagem da amostra, etapa que demanda longos tempos de processamento. Este método foi aplicado e forneceu a primeira caracterização fitoquímica dos cinco clones de maçã estudados. Os resultados demonstraram que o método combinado de UAE-LC-MS é adequado às práticas do controle de qualidade. O segundo Capítulo apresenta o estudo da interação dos ligantes semissintéticos derivados dos AU e AB, sintetizados pelo nosso grupo de pesquisa, com a proteína Ca2+-ATPase do Plasmodium falciparum (PfATP6), através do emprego da técnica de Docking Molecular. A PfATP6 é descrita como um importante alvo para novos antimaláricos como Artemisinina (ART), cujo mecanismo de ação inclui, dentre outros, a modulação da homeostasia do cálcio intracelular. Investigações conduziram à hipótese do extravasamento do cálcio, do interior do retículo sarco-endoplasmático como mecanismo plausível para ação dos derivados triterpênicos do AU e AB. Os escores de energia determinados no Docking, de cada um dos nove ligantes (derivados triterpênicos) e quatro compostos de controle (ácidos ursólico e betulínico, artemisinina (ART) e tapsigargina (TPG) foram determinados (análises realizadas em triplicata) e correlacionados com os valores de IC50, para a atividade antimalárica. Os resultados mostraram excelente correlação entre os escores de energia (com a PfATP6) e os valores de IC50, superior a 80% (r > 0,83360). O estudo fornece fortes evidências de que a PfATP6 pode constituir um alvo para os derivados pentacíclicos do estudo, bem como permitiu identificar o perfil conformacional dos ligantes e os principais resíduos do sítio de ligação (SL) da PfATP6 envolvidos nas interações; bem como, contribuiu para a melhor compreensão das propriedades envolvidas na interação do ligante com o receptor e mecanismo de ação. O terceiro Capítulo faz uso de Métodos Clássicos e Quânticos para descrever as mudanças conformacionais da proteína PfATP6. As simulações de Dinâmica Molecular do receptor na forma isolada e complexada com os ligantes foram realizadas durante 10 ns. As conformações finais obtidas para os receptores foram avaliadas em termos RMSD, efeito da presença dos ligantes no sítio de ligação e tipos de interações estabelecidas entre o ligante e o receptor. Os resultados mostraram que as proteínas PfATP6 e SERCA tendem a manter sua conformação nativa e que o modelo utilizado é adequado aos propósitos do estudo. O monitoramento dos resíduos da região citoplasmática das proteínas permitiu evidenciar o efeito alostérico da presença dos ligantes AU e ART no SL, sobre os domínios A e N, da PfATP6. Esse efeito reproduz as conformações E1 e E2, bem estabelecidas para PfATP6, na presença e ausência de Ca2+. As análises de Dinâmica Molecular corroboram os achados do Capítulo II ao evidenciarem o estabelecimento de interações de hidrogênio com os resíduos importantes do SL da PfATP6. Esses resultados fundamentam os indícios de que as bombas de Ca2+-ATPase (SERCA), possam ser de fato, um alvo para os derivados triterpênicos dos AU e AB. / This thesis combines two main focuses within Pharmaceutical Chemistry. On the one hand, it seeks to explore a new source of natural inputs, bark of Malus domestica, in order to obtain ursolic (UA) and betulinic acid (BA) triterpenes. On the other hand, it studies the relation of the semi-synthetic triterpenic derivatives obtained with the target proteins (PfATP6), currently highlighted in the literature on malaria therapy with a view to planning new antimalarial drugs. The first chapter includes the development of an efficient, easy and extremely fast method where ultrasonic extraction techniques (UAE) and high-performance liquid chromatography coupled to mass spectroscopy (LC-MS) are combined for identification and assay of ursolic acid (UA) and betulinic acid (BA) in fresh apple peel extracts from five clones of the Gala and Fuji cultivars (Baigent, Fuji Mishima, Fuji Suprema, Fuji Select and Maxi Gala ") in the Southern Region of Brazil. Chromatographic parameters of the analytical method include: electrospray ionization (ESI +), flow rate of 1.0 mL/min in isocratic elution mode, consisting of 80% acetonitrile and 20% 10 mM ammonium acetate at pH 6.0 and room temperature. The method was validated and proved to be selective, sensitive (LOD and LOQ of 0.087 and 0.266 μg/mL for BA, and 0.398 and 2.117 μg/mL for UA), linear regression coefficient (r> 0.99), accurate, robust for analytes of interest. The optimization of the combined method of UAE with LC-MS allowed to complete the procedures of extraction and analysis in less than 4 h, since the method does not require drying the sample, a stage that demands long processing times. This method was applied and provided the first phytochemical characterization of the five apple clones studied. The results demonstrated that the combined UAE-LC-MS method is suitable for quality control practices. The second chapter presents the study of the interaction of the semi-synthetic ligands derived from the UA and BA, synthesized by our research group, with the Plasmodium falciparum Ca2+-ATPase protein (PfATP6), using the Molecular Docking technique. PfATP6 is described as an important target for new antimalarials such as Artemisinin (ART), whose action mechanism includes, among others, the modulation of intracellular calcium homeostasis. Investigations led to the hypothesis of extravasation of calcium from the interior of the sarco-endoplasmic reticulum as a plausible mechanism for the action of the triterpenic derivatives of UA and BA. The Docking energy scores (binding energy) of each of the nine ligands (triterpenic derivatives) and four control compounds (ursolic and betulinic acids, artemisinin (ART) and tapsigargine (TPG)) with PfATP6, were calculated (analyses performed in triplicate) and correlated with its antimalarial IC50 value. The results showed an excellent correlation between energy scores (with PfATP6) and IC50 values, higher than 80% (r > 0.83360). The study supplies strong evidence that PfATP6 may be a target for the pentacyclic derivatives of the study, and also allowed identifying the conformational profile of the ligands and the main residues of the PfATP6 binding site (BS) involved in the interactions. It further contributed to a better understanding of the properties involved in the interaction of the ligand with the receptor and its action mechanism. The third chapter uses Classical and Quantum Methods to describe the conformational changes of the PfATP6 protein. The Molecular Dynamics simulations of the receptor in the isolated and complexed form with the ligands were performed for 10 ns. The final conformations obtained for the receptors were evaluated in RMSD terms, effect of the presence of ligands at the binding site and types of interactions established between the ligand and the receptor. The results showed that the PfATP6 and SERCA proteins tend to maintain their native conformations and that the model used is adequate for the purposes of the study. The monitoring of the residues of the cytoplasmic region of the proteins allowed evidencing the allosteric effect of the presence of UA and ART ligands in BS, on the A- and N-domains of PfATP6. This effect reproduces the well-established E1 and E2 conformations for PfATP6, in the presence and absence of Ca2+, respectively. Molecular Dynamics analyses corroborate the findings of Chapter II, by showing the possibility of establishing hydrogen interactions with the important residues of PfATP6 BS. These results support the evidence that Ca2+-ATPase (SERCA) pumps may be a target for the triterpenic derivatives of UA and BA.