La protéine core du virus de l’hépatite C (VHC) serait responsable des principaux effets pathogènes du VHC, dont le développement de fibrose, stéatose, cirrhose et carcinome hépatocellulaire. Un cadre de lecture alternatif existe dans le gène de core, permettant la synthèse d’une autre protéine appelée ARFP (pour alternatate reading frame protein) ou protéine F (pour frameshift), dont le rôle reste encore mal compris. La présence de la protéine F lors de l’étude des fonctions biologiques de core ne pouvant être exclue, il est possible que certains rôles attribués à core reflètent en réalité l’activité de la protéine F. Afin de déterminer les fonctions biologiques de la protéine F dans les hépatocytes et son influence dans la pathogenèse associée au VHC, nous avons généré des lignées transgéniques de poissons zébrés (Danio rerio) dans lesquelles l’expression de deux versions de la protéine F (AF11opti et AUG26opti) a été ciblée au foie par l’utilisation du promoteur de la liver fatty acid binding protein (L-FABP). Le phénotype des poissons transgéniques de génération F2 a été analysé au niveau morphologique, histologique et microscopique afin de rechercher des signes de pathologie hépatique. Nos résultats ont démontré l’implication de la protéine F dans le développement de stéatose hépatique chez les deux lignées transgéniques, mais aucun signe de fibrose ou d’oncogenèse n’a été détecté. L’identification des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’accumulation lipidique induite par la protéine F pourrait permettre de mieux comprendre son rôle dans la pathogenèse du VHC, et mener au développement de nouvelles stratégies antivirales. / Hepatitis C virus (HCV) core protein is thought to be responsible for the major pathogenic effects of HCV, including the development of fibrosis, steatosis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. An alternate translational open reading frame exists in the core gene that allows the synthesis of another protein called ARFP (alternate reading frame protein) or F protein (frameshift), the role of which remains poorly understood. Since we cannot exclude the presence of F protein in most studies of core biological functions, it is possible that the roles attributed to core reflect the activity of ARFP. To determine the biological functions of F protein in hepatocytes and their influence on HCV-associated pathogenesis, we generated transgenic lines of zebrafish (Danio rerio) in which the liver fatty acid binding protein (L-FABP) promoter was used to direct liver-specific expression of two forms of ARFP (AF11opti and AUG26opti). The phenotype of F2 transgenic zebrafish was analyzed for morphological, histological and microscopic signs of liver-associated pathology. Our results demonstrated the implication of the HCV F protein in the development of hepatic steatosis in transgenic zebrafish liver but not fibrosis or oncogenesis. Identification of the cellular and molecular mechanisms underlying F protein-induced lipid accumulation will lead to a better understanding of the role of ARFP in HCV-associated pathology, which could lead to the development of novel antiviral strategies.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) évolue généralement vers le développement d’une hépatite C chronique, fréquemment associée à des perturbations métaboliques, (insulinorésistance et stéatose), et de la structure hépatique (fibrose et cirrhose), favorisant le développement d’un hépatocarcinome. Le stress oxydant semble étroitement lié à la progression de ces pathologies, notamment l’insulino-résistance. Or, les mécanismes moléculaires par lesquels le VHC module le stress oxydant restent confus, ainsi que l’effet réciproque du stress oxydant sur la réplication virale. Jusqu’à récemment, la modulation de ce stress a été étudiée in vitro dans des modèles non réplicatifs du VHC ou dans des modèles d’expression ectopiques des protéines virales. Peu d’études ont encore tenté de caractériser l’effet d’une infection complète et productive dans les cellules cibles naturelles du VHC, les hépatocytes. Mes travaux de recherche ont donc consisté à étudier la modulation de la balance redox cellulaire dans un modèle d’infection complet de type HCVcc, et dans les cellules hépatocytaires Huh7.5. Cette étude a permis de caractériser le stress oxydant dans ce modèle, mais surtout d’identifier un antioxydant à activité pro-virale, la glutathion peroxydase 4 (GPx4). En effet, nous avons observé une stimulation viro-induite de l’expression et de l’activité de GPx4, seule enzyme capable de détoxifier les lipides membranaires oxydés. L’expression de cette enzyme semble nécessaire à la réplication ainsi qu’à l’infectivité virale. Son importance pour le VHC résiderait dans son activité catalytique permettant de maintenir l’intégrité des lipides cellulaires nécessaire au cycle viral / Chronic infection with Hepatitis C virus (HCV) is frequently associated with metabolic disturbances (insulin-resistance and steatosis) as well as with changes to hepatic structure (fibrosis and cirrhosis) that favor hepatocellular carcinogenesis. Insulin resistance is in particular linked to oxidative stress, which is thought to play a key role in driving disease progression. However, molecular mechanisms by which HCV regulates oxidative stress are still unclear and reciprocally, the effect of oxidative stress on viral life cycle is not well understood. Until recently, induction of oxidative stress by HCV has mainly been investigated in non replicative in vitro models or in cell systems expressing viral proteins alone. Few studies have yet investigated oxidative stress in the context of productive HCV infection. My work consisted of studying the modulation of the cellular redox system using the HCVcc infection model, based on a replicative HCV isolate and the hepatoma cell line Huh7.5. This work provided a broad characterization of how HCV induces and prevents oxidative stress and identified glutathion peroxidase 4 (GPx4) as a pro-viral antioxydant enzyme. Indeed, we observed an HCVinduced upregulation of expression and activity of GPx4. We also demonstrated that GPx4 expression is required for viral replication and infectivity. As GPx4 possesses a particular catalytic activity, which is the detoxification of oxidized membrane lipids, we investigated the impact of the accumulation of oxidized lipids on HCV replication. These studies showed that GPx4 is an important host factor for HCV life cycle by maintaining membrane lipid integrity in an oxidative cellular environment

L’Organització Mundial de la Salut (OMS) estima que fins a un 3% de la població mundial ha estat infectada pel virus de l’hepatitis C i és la causa més important d’hepatitis crònica, cirrosi i de malaltia hepàtica terminal, que finalment acaba conduint a un transplantament de fetge. La relació entre la variabilitat en la seqüència del virus de l’hepatitis C i el desenvolupament de la malaltia hepàtica és de tipus multifactorial. La infecció crònica causa fibrosi hepàtica, fet que es veu accelerat per mecanismes desconeguts en el cas de pacients coinfectats amb VIH. La progressió de la malaltia produïda pel VHC en pacients coinfectats, està influenciada no només per factors demogràfics, epidemiològics o pels antecedents clínics dels pacients, si no també per diferències genètiques entre els diferents virus i els hostes.

Le virus de l'hépatite C est un problème de santé publique majeur, puisque 180 millions de personnes sont chroniquement infectées dans le monde, et sont susceptibles de présenter une cirrhose ou un cancer du foie. Un seul traitement a été approuvé, à base de Ribavirine et d'interféron alpha, mais il permet de traiter moins de 50 % des personnes infectées, et présente de nombreux effets secondaires. Devant ce constat, il parait urgent d'aboutir à une polythérapie plus adaptée. En dépit du succès des nucléosides en chimie antivirale, visant plusieurs enzymes clefs intervenant dans la réplication virale, peu d'entre eux ont été conçus pour viser l'ARN polymérase ARN dépendante nécessaire au VHC. Dans cette optique, de nouveaux dérivés carbocycliques de la Ribavirine, et des dérivés nucléosidiques du type 5-haloéthynyl- ou 5-(1,2-dihalo)vinyluracile, ont été synthétisés en utilisant deux méthodes : la réaction de Sonogashira et la cyclisation 1,3-dipolaire. Ce sont des outils puissants de la chimie organique qui permettent l'accès à de nouvelles structures nucléosidiques et la réalisation de modifications chimiques ultérieures. Les nouveaux composés ainsi préparés ont été testés pour leur activité antivirale.

L'infection par le virus de l'hépatite C (VHC) demeure une cause majeure de cirrhose et de carcinome hépatocellulaire. Compte tenu d'une efficacité encore insuffisante des thérapies actuelles (55% de succès en moyenne), le développement de nouvelles stratégies antivirales reste une priorité. Dans ce contexte, nos travaux ont porté sur l'évaluation de nouveaux variants de l'interféron alpha dans un modèle de réplicon VHC. Nous avons pu identifier un variant, GEA007.1 qui présente une activité anti-VHC supérieure à celle de l'IFN alpha-2b utilisé en clinique associé à une plus grande efficacité de transduction du signal. Nous avons également évalué une approche antisens avec des molécules de type Peptide Nucleic Acids (PNA) et montré qu'elle permettait d'inhiber la traduction in vitro du VHC par blocage de la région interne d'entrée du ribosome (IRES), de manière plus efficace et spécifique qu'une approche antisens avec des molécules de premières générations. Une telle stratégie se justifie par la conservation de la cible qui pourrait se révéler utile avec l'utilisation prochaine des anti-protéases et anti-polymérases du VHC et le risque inhérent d'apparition de résistances au traitement. L'ensemble de ces résultats montre que l'amélioration de la bithérapie actuelle est possible et que de nouvelles approches thérapeutiques fonctionnent.

No description available.

Le virus de l’hépatite C (VHC) est une des principales causes d’hépatite chronique. La protéine F du VHC est codée par un cadre de lecture alternatif du gène de la capside, Core. La protéine F a été découverte après que l’on ait associé Core à plusieurs des fonctions pathogènes du VHC. Nous proposons donc que certaines fonctions biologiques et pathogènes attribuées à la protéine Core résultent de l’activité de la protéine F. Nous avons choisi de développer trois lignées de poissons zébrés (Danio rerio) qui expriment différentes versions de la protéine F afin d’étudier les effets de la protéine F et leur incidence dans la pathogenèse du VHC. Deux versions de la séquence codant pour la protéine F (AF11 et AUG26) et une version mutante du gène core (CoremutI) ont été introduites sur les vecteurs d’un système d’expression répressible spécifique au foie. Ces vecteurs ont été co-injectés dans des embryons unicellulaires de poissons zébrés pour générer les poissons fondateurs des lignées transgéniques. 19, 21 et 36 poissons ont été choisis comme fondateurs pour les lignées AF11, AUG26 et CoremutI respectivement. De ce nombre, 9, 11 et 11 poissons ont atteint la maturité, dans l’ordre pour les mêmes lignées, et seront croisés pour donner naissance à des lignées transgéniques stables. Les résultats de ces expériences nous permettront de mieux cerner les propriétés biologiques de la protéine F et de définir son rôle dans la pathogenèse du VHC. / Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of liver steatosis, fibrosis and hepatocellular carcinoma. HCV F protein is expressed from an alternative reading frame within the Core sequence. F protein was discovered after many of the pathogenic determinants of HCV had been associated with the effects of Core. Hence, we propose that a part of the functions attributed to Core result from the activity of the F protein. We produced and selected 19, 21 and 36 transgenic zebrafish (Danio rerio) to give rise to 3 independent lines expressing different versions of the F protein. Of these founders, 9, 11 and 11 were raised to maturity and will be bred to generate stable transgenic lines. Characterizing the phenotype of these transgenic fish will help determine the precise role of the F protein in the pathogenesis of hepatitis C.

L'hépatite chronique virale C est associée à une défaillance du système immunitaire. Nous nous sommes intéressés aux cellules NK et aux lymphocytes Treg, partenaires de la réponse immunitaire innée. Le nombre des NK, particulièrement les CD56dim, est significativement diminué chez les patients infectés, dans le foie plus que dans le sang, et s'accentue avec la fibrogenèse. Le nombre de CD3-CD56+brightNKG2A+ circulantes est corrélé à la sévérité de l'inflammation et de la fibrose et celui des CD3-CD56+dimNKG2A+ inversement corrélé à la charge virale. Les NK sont fonctionnelles, en capacité de produire de l'IFN-γ et d'engager un processus de cytolyse. L'expression de CD158 est significativement diminuée à la surface des NK hépatiques mais conservée dans les NK circulantes. L'expression de NKG2A,C,D dans les NK circulantes et hépatiques est identique à celles de patients non infectés. Les Treg intrahépatiques FoxP3+ sont quasi-exclusivement de phénotype CD4+. En analyse multivariée, le nombre de FoxP3+ est indépendamment associé à celui de CD8+, surtout dans les lésions nécrotico-inflammatoires et une corrélation forte est observée entre les transcrits CD8, FoxP3, IL-10 et TGF-β, suggérant que les Treg bloquent l'expansion et la cytotoxicité des TCD8 par contact cellulaire ou par le biais de cytokines immunosuppressives. L'équilibre entre FoxP3 et CD8 est rompu dans les grades et stades Métavir A>2 et F>3, avec un effondrement du rapport FoxP3/CD8. L'inflammation hépatique chronique s'accompagne de fibrose, aboutissant à la cirrhose, principale cause de CHC. Dans les cirrhoses virales C avec ou sans CHC, les lymphocytes CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD56+, TCRγδ +, FoxP3+ sont plus nombreux dans la fibrose que dans le parenchyme. Le nombre de CD20+, CD3+, CD4+, CD8+ et l'expression d'IFN-γ et RANTES sont plus élevés dans les cirrhoses qui développent un CHC. En analyse multivariée, CD8 est le seul facteur indépendament associé à la récidive tumorale et à une diminution de la survie sans récidive à 5 ans. Les CD20+, CD3+, CD4+, CD8+, CD56+, TCRγδ+, FoxP3+ sont significativement moins nombreux dans le CHC que dans la cirrhose. Mais les FoxP3+ sont significativement plus nombreux et les CD56+ moins nombreux dans le CHC que dans le nodule parenchymateux, sans modification des LT, conduisant à une augmentation du rapport FoxP3/CD8 dans la tumeur. Les CD56+ diminuent de la cirrhose au CHC. Aucune corrélation n'est observée entre la densité intra-tumorale des lymphocytes étudiés et la récidive carcinomateuse. Conclusion. Un infiltrat inflammatoire dense au sein de la cirrhose C, particulièrement riche en CD8, favorise le développement et/ou la récidive du CHC.