Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-22Bitstream added on 2014-06-13T20:56:17Z : No. of bitstreams: 1 gomes_de_me_sjrp.pdf: 504080 bytes, checksum: 982f1ee0e75971f787bbecbde367a266 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No últimos anos, a avicultura brasileira posicionou o país como o terceiro maior produtor mundial de perus, entretanto o setor permanece em acentuado crescimento e tem uma grande importância econômica, movimentando cerca de 10 milhões de dólares por ano. A indústria avícola brasileira obteve novos mercados, mostrando novas perspectivas no comércio internacional. O Coronavirus dos Perus (Turkey Coronavirus, ¨TCoV) é um vírus envelopado, com RNA de fita simples, não segmentado, com sentido positivo e pertence a ordem Nidovirales, família Coronavirus e gênero Coronavirus (grupo III). Trata-se de um agente causador de enterites altamente transmissíveis, gerando grandes perdas econômicas no Brasil e no mundo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o processo de apoptose celular e a variabilidade molecular em tecidos de embriões de perus experimentalmente infectados com TCoV (primeiro isolado brasileiro, 2007). A infecção experimental foi desenvolvida por meio da inoculação viral na cavidade amniótica de embriões de perus com 23-25 dias de incubação por nove vezes consecutivas. Foi empregada a técnica de imunoistoquímica no intuito de detectar os marcadores apoptóticos Anexina V, Caspase 2, Caspase 3, p53 e ainda a detecção de apoptose com o emprego do kit TUNEL. Foi realizado o sequenciamento do vírus original e suas passagens em ovos embrionados a fim de detectar mutações decorrentes das passagens virais. O TCoV propagou em ovos embrionados de perus (Melleagridis gallopavo) apresentando vacuolização dos enterócitos e congestão como lesões histopatológicas. A análise das lesões macroscópicas mostrou congestão moderada, acúmulo de líquidos e processo inflamatório. A apoptose foi identificada pelo uso do kit comercial TUNEL e mostrou a presença viral no intestino bem como a ocorrência de apoptose celular nos enterócitos. Os resultados... / The Brazilian poultry industry represents third world producer of turkeys, in last years, whereas the sector is in growth and has a large economic importance moving around 10 million of dollars per year. Brazilian’s industry obtained new markets, showing new perspectives into the international trade. Turkey Coronavirus (TCoV) is an agent that causes high transmissible enteritis, causing great economic lost, in Brazil and worldwide. It is an enveloped virus, with single strand RNA, non segmented, positive sense, belongs to Nidovirales order, Coronaviridae family and Coronavirus group III. The present work evaluated the apoptosis process and the molecular variety in turkey embryo tissues experimentally infected by turkey Coronavirus (first isolated in Brazil, 2007). The experimental infection was performed trough viral inoculation into amniotic cavity in embryonated turkey eggs with 23-25 days of incubation for nine times consecutivelly. Immunohistochemistry was performed to detect the apoptotic factors Annexin V, Caspase 2, Caspase 3, p53 and apoptosis detection by TUNEL kit. The sequencing of original virus and the respective passages developed to detect mutations acquired through passages. TCoV propagated in turkey eggs (Melleagridis gallopavo) presenting enterocytes vacuolization and congestion as histopathologic lesions. Analysis of macroscopic lesions showed mild congestion, liquid accumulation and inflammation process. The apoptosis identification performed applying the commercial kit TUNEL shown the viral presence in intestinal tissue, as well, the cellular apoptosis occurrence. The results demonstrated positive signals to annexin V, caspase 2, caspase 3 and p53, exactly how described in others authors to others Coronavirus. Regarding to the sequences, it was detected the occurrence of three mutations never described before and 19 mutation of common occurrence... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Maria da Glória Buzinaro / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: No últimos anos, a avicultura brasileira posicionou o país como o terceiro maior produtor mundial de perus, entretanto o setor permanece em acentuado crescimento e tem uma grande importância econômica, movimentando cerca de 10 milhões de dólares por ano. A indústria avícola brasileira obteve novos mercados, mostrando novas perspectivas no comércio internacional. O Coronavirus dos Perus (Turkey Coronavirus, ¨TCoV) é um vírus envelopado, com RNA de fita simples, não segmentado, com sentido positivo e pertence a ordem Nidovirales, família Coronavirus e gênero Coronavirus (grupo III). Trata-se de um agente causador de enterites altamente transmissíveis, gerando grandes perdas econômicas no Brasil e no mundo. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o processo de apoptose celular e a variabilidade molecular em tecidos de embriões de perus experimentalmente infectados com TCoV (primeiro isolado brasileiro, 2007). A infecção experimental foi desenvolvida por meio da inoculação viral na cavidade amniótica de embriões de perus com 23-25 dias de incubação por nove vezes consecutivas. Foi empregada a técnica de imunoistoquímica no intuito de detectar os marcadores apoptóticos Anexina V, Caspase 2, Caspase 3, p53 e ainda a detecção de apoptose com o emprego do kit TUNEL. Foi realizado o sequenciamento do vírus original e suas passagens em ovos embrionados a fim de detectar mutações decorrentes das passagens virais. O TCoV propagou em ovos embrionados de perus (Melleagridis gallopavo) apresentando vacuolização dos enterócitos e congestão como lesões histopatológicas. A análise das lesões macroscópicas mostrou congestão moderada, acúmulo de líquidos e processo inflamatório. A apoptose foi identificada pelo uso do kit comercial TUNEL e mostrou a presença viral no intestino bem como a ocorrência de apoptose celular nos enterócitos. Os resultados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Brazilian poultry industry represents third world producer of turkeys, in last years, whereas the sector is in growth and has a large economic importance moving around 10 million of dollars per year. Brazilian's industry obtained new markets, showing new perspectives into the international trade. Turkey Coronavirus (TCoV) is an agent that causes high transmissible enteritis, causing great economic lost, in Brazil and worldwide. It is an enveloped virus, with single strand RNA, non segmented, positive sense, belongs to Nidovirales order, Coronaviridae family and Coronavirus group III. The present work evaluated the apoptosis process and the molecular variety in turkey embryo tissues experimentally infected by turkey Coronavirus (first isolated in Brazil, 2007). The experimental infection was performed trough viral inoculation into amniotic cavity in embryonated turkey eggs with 23-25 days of incubation for nine times consecutivelly. Immunohistochemistry was performed to detect the apoptotic factors Annexin V, Caspase 2, Caspase 3, p53 and apoptosis detection by TUNEL kit. The sequencing of original virus and the respective passages developed to detect mutations acquired through passages. TCoV propagated in turkey eggs (Melleagridis gallopavo) presenting enterocytes vacuolization and congestion as histopathologic lesions. Analysis of macroscopic lesions showed mild congestion, liquid accumulation and inflammation process. The apoptosis identification performed applying the commercial kit TUNEL shown the viral presence in intestinal tissue, as well, the cellular apoptosis occurrence. The results demonstrated positive signals to annexin V, caspase 2, caspase 3 and p53, exactly how described in others authors to others Coronavirus. Regarding to the sequences, it was detected the occurrence of three mutations never described before and 19 mutation of common occurrence... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientadores: Clarice Weis Arns, Paulo Michel Roehe / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-27T02:28:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 D'Arce_ReginaCeliaFreitas_M.pdf: 3168538 bytes, checksum: e41e78694d9c979d5127fba297b57e4b (MD5) Previous issue date: 2000 / Mestrado

Orientador: Maria Silvia Viccari Gatti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:44:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_DanielRobertoCoradide_M.pdf: 4897696 bytes, checksum: c62f6290c99ca727055e29d7da7e94fd (MD5) Previous issue date: 2003 / Mestrado

A parvovirose suína está mundialmente distribuída tornando-se responsável por expressivas perdas econômicas devido aos problemas reprodutivos. O presente trabalho teve como objetivo realizar a padronização da PCR em tempo real (qPCR) utilizando sonda TaqMan para detecção e quantificação de parvovirus suíno 1 (PPV1) em amostras de soro, baseado na região do gene NS1. A especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade e quantificação da qPCR foram avaliadas e a casuística foi comparada com a nested PCR (nPCR). A curva padrão da qPCR apresentou linearidade de 6 x 106 cópias genômicas/mL (gce/mL) a 2 x 103 gce/mL, com um coeficiente de correlação (R2) de 0,98. No teste de especificidade, a qPCR não apresentou valores de Cycle threshold (Ct) nos patógenos do grupo de exclusão (circovirus suíno tipo 2, parvovirus canino, vírus da panleucopenia felina, , Erisipela e Leptospirose). Todas as cepas de PPV1 testadas apresentaram fluorescência, demonstrando uma especificidade de 100%. Comparando as duas técnicas, 11 amostras foram positivas em ambos os testes e a nPCR detectou quatro amostras a mais do que a qPCR. A concordância, sensibilidade e especificidade entre as técnicas foi de 98%, 73% e 100%, respectivamente. Portanto, a nPCR apresentou maior sensibilidade, no entanto, a qPCR poderá ser utilizada no diagnóstico e quantificação de PPV1, podendo auxiliar em estudos de viremia, epidemiologia e monitoramento do vírus nas granjas. No segundo estudo, foi realizada a detecção por PCR de circovírus suíno tipo 2 (PCV2), PPV1, parvovírus suíno tipo 2, torque teno vírus suíno 1 e 2 (TTV1 e TTV2) e hokovirus suíno (PHoV) em pools de órgãos (linfonodos, pulmões, fígado, baço e rim) de leitões apresentando a Sídrome Multissistêmica do Definhamento Suíno (PMWS). Todas as amostras foram PCR positivas para PCV2 e os outros vírus foram detectados em todos os rebanhos, com exceção do TTV1. As amostras também foram positivas na PCR para PPV1 (81,6%), PPV2 (73,7%), TTV1 (5,3%), TTV2 (86,8%) e PHoV (55,3%). Os resultados indicam que leitões com PMWS e infectados com PCV2 apresentaram co-infecções com outras espécies de parvovirus e anelovirus, que podem estar envolvidos na apresentação da PMWS. Devido às poucas informações sobre a variabilidade genética do PHoV, oito fragmentos sobrepostos da região VP1/VP2 de quatro amostras foram amplificados e sequenciados. Na análise filogenética, as amostras brasileiras de PHoV apresentaram-se mais estreitamente relacionadas às amostras européias. O presente trabalho relata a primeira detecção de PPV2 e PHoV em co-infecções com PCV2 e a primeira caracterização genética de amostras de PHoV no Brasil. / Porcine parvovirus 1 (PPV1) has worldwide distribution and causes an important reproductive losses. The present dissertation was performed to develop a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) using a TaqMan probe based on NS1 gene to detect and quantify PPV1 in serum samples. The specificity, sensitivity, reproducibility and quantitative range of the real time PCR were evaluated and compared with conventional nested PCR (nPCR). The standard curve of real-time PCR was linear ranging from 6 x 106 genome copies equivalent/mL (gce/mL) to 2 x 103 gce/mL with a square of the correlation coefficient (R2 value) of 0.98. No cross-reactivity was detected with closely related parvovirus or with viruses that causes similar symptoms and all PPV1 strains showed fluorescence in the assay. Comparing these techniques, 11 samples were positive in both tests and nPCR detected four additional samples. The concordance, sensitivity and specificity between the techniques were 98%, 73% and 100%, respectively. In conclusion, nPCR showed more sensitivity, however, real-time PCR could be a useful tool for diagnosis and quantification of PPV1 in serum samples and can be used for viremia studies, epidemiology and monitoring PPV1 infection in swine herds. The second study was performed in order to detect porcine circovirus 2 (PCV2), PPV1, porcine parvovirus 2, torque teno virus 1 and 2 (TTV1 and TTV2) and porcine hokovirus (PHoV) in different pooled tissues (lymph nodes, lungs, liver, spleen and kidneys) of piglets displaying Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by PCR. All the samples were PCR positive for PCV2 and the other viruses were detected in all herds, with the exception of TTV1. The samples were positive for TTV2 (86.8%), PPV1 (81.6%), PPV2 (73.7%), PHoV (55.3%) and TTV1 (5.3%). These results showed that piglets displaying PMWS and infected with PCV2 presented co-infections with other virus, which could be involved in the syndrome. Since there are few data about genetic variability of PHoV, eight overlapping fragments of VP1/VP2 region of PHoV were amplified and. In phylogenetic analysis, Brazilian PHoV sequences were more closely related to European sequences. The results indicate that piglets displaying PMWS are PCV2 infected and can be co-infected with different parvovirus and circovirus species.

A presente dissertação versou sobre o parvovírus suíno (PPV) onde, em um primeiro trabalho foi realizado o diagnóstico do PPV em leitões (saudáveis e refugos) e em fêmeas (de distintas ordens de parto) através de nested-PCR do soro. Os títulos de anticorpos das fêmeas foram determinados por Inibição da Hemaglutinação (HI) e comparados com os resultados da nested-PCR. A nested-PCR obteve resultados positivos em amostras de todas as categorias analisadas: leitões saudáveis (15,7% de animais positivos), leitões refugos (18,2%) e fêmeas (17,8%). Os índices de reprodutoras positivas para as distintas ordens de parto foram de 20,8%, 8,7%, 12,5%, 27,3%, 20,8% e 15,0% para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6, respectivamente. Através da HI, 84,7% dos soros possuiam anticorpos para PPV. Os títulos nas distintas ordens de parto foram de 2142,7 (8,7), 2403,1 (9,8), 2250,0 (9,9), 2952,2 (10,6), 2600,3 (9,8) e 2154,7 (9,7) para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6 respectivamente (log2X entre parênteses). Não houve correlação estatisticamente significativa entre os resultados da nested-PCR e os títulos de HI. Ao contrário do que era esperado, fêmeas com altos títulos de anticorpos possuiam DNA do vírus na circulação. No segundo trabalho, foram estudas seqüências da porção VP1/VP2 de PPV retiradas do GenBank, juntamente com cinco amostras seqüenciadas no presente estudo. A análise foi realizada quanto à presença de determinados aminoácidos e através de filogenia. Como resultados, o seqüenciamento revelou que duas das novas amostras (S30 e S31) apresentavam modificações em regiões consideradas importantes para a virulência do PPV. Entre estas, destaca-se a modificação no sitio 586, com a presença do aminoácido Thr. A análise filogenética demonstrou que as seqüências de PPV se dividem em dois grupamentos, porém com apenas um grupamento bem definido. Por último, o relógio molecular revelou que a separação dos dois grupos ocorreu há 2890 anos e a divisão dos sub-grupamentos mais recentes ocorreu nos últimos três séculos. / The present dissertation studied porcine parvovirus (PPV) and the first part describes the diagnosis of PPV in piglets sera (healthy and attrition) and females (with distinct parity orders. through nested-PCR. The antibody titers from females were analized by Hemoaglutination Inhibition and compared with the results from the nested-PCR. The nested-PCR results displayed positive animals in all sampled categories: healthy piglets (15.7% of positive animals), attrition piglets (18.2%) and females (17.8%). The results for the distinct parities orders were 20.8%, 8.7%, 12.5%, 27.3%, 20.8% and 15.0% for the pariy orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6, respectively. The HI test detected 84.7% of the females positive to PPV. The titers in the distinct orders were 2142.7 (8.7), 2403.1 (9.8), 2250.0 (9.9), 2952.2 (10.6), 2600.3 (9.8) and 2154.7 (9.7) to the parity orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6 respectively (log2X in parenthesis). No statically correlation was evidenced between the nested-PCR and the HI titers. Curiously, females with high antibody titers displayed the viral DNA in their circulation. In the second part, sequences of the PPV region VP1/VP2 were retrieved from GenBank, together with five samples sequenced in the present study. The analysis was performed by identifying the presence of specific aminoacids and by phylogeny. The sequenced samples displayed the presence of important aminoacids substitutions, including Thr in the 586 site in two samples (S30 and S31). The phylogenetic analysis revealed two clusters among the PPV sequences. However, only one cluster displayed a high definition. The molecular clock displayed that the separation between the two main clusters occurred 2890 years ago, and the separation between the most recent sub-clusters happened in the last 300 years.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-02-15T18:15:25Z No. of bitstreams: 1 tulio_m_fumian_ioc_bcm_0064_2011.pdf: 8754950 bytes, checksum: a088189284585292976a95bd6ca62aec (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-15T18:15:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tulio_m_fumian_ioc_bcm_0064_2011.pdf: 8754950 bytes, checksum: a088189284585292976a95bd6ca62aec (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Entre a grande diversidade de vírus que infectam o homem, muitos são excretados em grandes concentrações nas fezes ou urina de indivíduos sintomáticos ou assintomáticos, estando presentes em águas residuárias provenientes de esgotos domésticos. Metodologias moleculares de amplificação genômica vêm sendo utilizadas para detecção e quantificação de vírus nestas águas, de modo que os estudos de virologia ambiental representam uma ferramenta a mais na determinação dos vírus circulantes em uma dada área geográfica. Este estudo teve como objetivo avaliar a disseminação dos principais vírus responsáveis pela gastrenterite aguda infantil [rotavírus A (RVA), norovírus (NoV) e astrovírus humanos (HAstV)] , em águas residuárias da cidade do Rio de Janeiro, assim como avaliar os adenovírus humanos (HAdV) e poliomavírus JC (JCPyV) como marcadores virais de contaminação ambiental. Com este propósito,metodologias de concentração, detecção, quantificação e caracterização molecular de vírus foram estabelecidas e aplicadas em águas residuárias de duas Estações de Tratamento de Esgoto (ETE) da cidade. Inicialmente, realizou-se o monitoramento de RVA, NoV, HAstV e JCPyV na ETE Fiocruz (2004 -2005) com a utilização do método de concentração viral baseado na ultrafiltração com membrana carregada negativamente. Nestes estudos demonstrou-se a disseminação destes vírus em amostrar de esgoto bruto e em menor escala em esgoto tratado, assim como se avaliou as taxas de recuperação de NoV e HAstV pelo método de concentração utilizado e metodologias de detecção e quantificação viral. A caracterização dos agentes virais detectados demonstrou a circulação dos genótipos mais prevalentes (RVA G1 e P[8]; NoV GII; HAstV-1 e JCPyV tipo 3). As baixas taxas de recuperação viral obtidas com o método de filtração, assim como a ausência de controle interno nos estudos anteriores, apontaram a necessidade de se estabelecer diferentes métodos para investigações. Deste modo, estabeleceu-se o método de concentração de vírus por ultracentrifugação, assim como um protocolo de quantificação do bacteriófago PP7, utilizado como controle interno, e outro para quantificação de RVA. Estes métodos foram aplicados em um novo monitoramento(2009 -2010) realizado em ETE de grande porte (ETE Alegria) visando obter dados mais consistentes dos vírus circulantes na população do Rio de Janeiro. Os resultados provenientes deste monitoramento demonstraram que os RVA, HAdV e os JCPyV foram os mais prevalentes nas amostras de águas residuárias seguidos pelos NoV e HAstV. A caracterização molecular demonstrou a diversidade de genótipos de vírus circulantes em concordância com oso obtidos anteriormente, exceto para os RVA, RVA G2 e P[4] foram caracterizados em 100% das amostras de esgoto bruto revelando uma alteração do perfil dos genótipos circulantes após a introdução da Rotarix® no país em 2006. Neste estudo não foram detectadas cepas vacinais de RVA. Os resultados obtidos na ETE Alegria demonstraram uma redução de 2 logs na carga viral após o tratamento. Os dados quantitativos confirmaram o potencial do HAdV como marcador viral de contaminação, assim como revelaram a importância de se avaliar a descarga local de vírus no ambiente, de modo a se identificar os vírus presentes em altas concentrações que devem ser considerados em estudos de avaliação de risco. / Among the wide variety of viruses that infect humans, many are excreted in high concentrations in the feces or urine of symptomatic or asymptomatic, present in wastewater from domestic sewage. Molecular genomic amplification methodologies have been used for detecting and quantifying viruses in these waters so that their studies of virology environmental represent an additional tool in the determination of circulating virus in a given geographical area. This study aimed to evaluate the spread of the main viruses responsible for infantile acute gastroenteritis [A rotavirus (RVA), norovirus (NoV) and human astrovirus (HAstV)] in wastewater of the city of Rio de Janeiro, as well as evaluating the adenovirus human (HAdV) and JC polyomavirus (JCPyV) as markers of viral contamination. For this purpose, methods of concentration, detection, quantification and molecular characterization of virus were established and applied in two wastewater treatment plants Wastewater (TEE) in the city. Initially, there was monitoring of RVA, NoV, HAstV and JCPyV in ETE Fiocruz (2004 -2005) with the use of viral concentration method based on ultrafiltration membrane with negatively charged. In these studies demonstrated the spread of these viruses sampled in raw sewage and treated sewage on a smaller scale, as well as assessed the recovery rates of NoV and HAstV by concentration method used and methodologies for detecting and quantifying viral. Characterization of viral agents detected the movement of genotypes showed more prevalent (RVA G1 and P [8]; NoV GII; JCPyV HAstV-1 and type 3). The low recovery rates obtained with the virus filtration method, and the absence of internal controls in previous studies, indicate a need to establish different methods for investigation. Thus, it was established method of virus concentration by ultracentrifugation as well as a protocol of quantification of bacteriophage PP7, used as internal control, and another for quantification RVA. These methods were applied to a new monitoring (2009 -2010) held in ETE large (ETE Joy) to obtain more consistent data of virus circulating in the population of Rio de Janeiro. The results from this monitoring showed that RVA, HAdV JCPyV and were most prevalent in samples of wastewater followed by NoV and HAstV. The molecular characterization demonstrated the diversity of genotypes circulating viruses in concordance with previously obtained oso except for RVA, RVA G2 and P [4] were characterized in 100% of samples of raw sewage revealing a change in the profile of circulating genotypes after introduction of Rotarix ® in the country in 2006. This study were not detected RVA vaccine strains. The results obtained in ETE Joy showed a 2 log reduction in viral load after treatment. Quantitative data confirm the potential of HAdV as a marker of viral contamination, and revealed the importance of evaluating the local discharge of virus in the environment in order to identify viruses present in high concentrations that should be considered in evaluation studies risk.

A presente dissertação versou sobre o parvovírus suíno (PPV) onde, em um primeiro trabalho foi realizado o diagnóstico do PPV em leitões (saudáveis e refugos) e em fêmeas (de distintas ordens de parto) através de nested-PCR do soro. Os títulos de anticorpos das fêmeas foram determinados por Inibição da Hemaglutinação (HI) e comparados com os resultados da nested-PCR. A nested-PCR obteve resultados positivos em amostras de todas as categorias analisadas: leitões saudáveis (15,7% de animais positivos), leitões refugos (18,2%) e fêmeas (17,8%). Os índices de reprodutoras positivas para as distintas ordens de parto foram de 20,8%, 8,7%, 12,5%, 27,3%, 20,8% e 15,0% para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6, respectivamente. Através da HI, 84,7% dos soros possuiam anticorpos para PPV. Os títulos nas distintas ordens de parto foram de 2142,7 (8,7), 2403,1 (9,8), 2250,0 (9,9), 2952,2 (10,6), 2600,3 (9,8) e 2154,7 (9,7) para as ordens de parto 1, 2, 3, 4, 5 e>= 6 respectivamente (log2X entre parênteses). Não houve correlação estatisticamente significativa entre os resultados da nested-PCR e os títulos de HI. Ao contrário do que era esperado, fêmeas com altos títulos de anticorpos possuiam DNA do vírus na circulação. No segundo trabalho, foram estudas seqüências da porção VP1/VP2 de PPV retiradas do GenBank, juntamente com cinco amostras seqüenciadas no presente estudo. A análise foi realizada quanto à presença de determinados aminoácidos e através de filogenia. Como resultados, o seqüenciamento revelou que duas das novas amostras (S30 e S31) apresentavam modificações em regiões consideradas importantes para a virulência do PPV. Entre estas, destaca-se a modificação no sitio 586, com a presença do aminoácido Thr. A análise filogenética demonstrou que as seqüências de PPV se dividem em dois grupamentos, porém com apenas um grupamento bem definido. Por último, o relógio molecular revelou que a separação dos dois grupos ocorreu há 2890 anos e a divisão dos sub-grupamentos mais recentes ocorreu nos últimos três séculos. / The present dissertation studied porcine parvovirus (PPV) and the first part describes the diagnosis of PPV in piglets sera (healthy and attrition) and females (with distinct parity orders. through nested-PCR. The antibody titers from females were analized by Hemoaglutination Inhibition and compared with the results from the nested-PCR. The nested-PCR results displayed positive animals in all sampled categories: healthy piglets (15.7% of positive animals), attrition piglets (18.2%) and females (17.8%). The results for the distinct parities orders were 20.8%, 8.7%, 12.5%, 27.3%, 20.8% and 15.0% for the pariy orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6, respectively. The HI test detected 84.7% of the females positive to PPV. The titers in the distinct orders were 2142.7 (8.7), 2403.1 (9.8), 2250.0 (9.9), 2952.2 (10.6), 2600.3 (9.8) and 2154.7 (9.7) to the parity orders 1, 2, 3, 4, 5 and>= 6 respectively (log2X in parenthesis). No statically correlation was evidenced between the nested-PCR and the HI titers. Curiously, females with high antibody titers displayed the viral DNA in their circulation. In the second part, sequences of the PPV region VP1/VP2 were retrieved from GenBank, together with five samples sequenced in the present study. The analysis was performed by identifying the presence of specific aminoacids and by phylogeny. The sequenced samples displayed the presence of important aminoacids substitutions, including Thr in the 586 site in two samples (S30 and S31). The phylogenetic analysis revealed two clusters among the PPV sequences. However, only one cluster displayed a high definition. The molecular clock displayed that the separation between the two main clusters occurred 2890 years ago, and the separation between the most recent sub-clusters happened in the last 300 years.

A parvovirose suína está mundialmente distribuída tornando-se responsável por expressivas perdas econômicas devido aos problemas reprodutivos. O presente trabalho teve como objetivo realizar a padronização da PCR em tempo real (qPCR) utilizando sonda TaqMan para detecção e quantificação de parvovirus suíno 1 (PPV1) em amostras de soro, baseado na região do gene NS1. A especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade e quantificação da qPCR foram avaliadas e a casuística foi comparada com a nested PCR (nPCR). A curva padrão da qPCR apresentou linearidade de 6 x 106 cópias genômicas/mL (gce/mL) a 2 x 103 gce/mL, com um coeficiente de correlação (R2) de 0,98. No teste de especificidade, a qPCR não apresentou valores de Cycle threshold (Ct) nos patógenos do grupo de exclusão (circovirus suíno tipo 2, parvovirus canino, vírus da panleucopenia felina, , Erisipela e Leptospirose). Todas as cepas de PPV1 testadas apresentaram fluorescência, demonstrando uma especificidade de 100%. Comparando as duas técnicas, 11 amostras foram positivas em ambos os testes e a nPCR detectou quatro amostras a mais do que a qPCR. A concordância, sensibilidade e especificidade entre as técnicas foi de 98%, 73% e 100%, respectivamente. Portanto, a nPCR apresentou maior sensibilidade, no entanto, a qPCR poderá ser utilizada no diagnóstico e quantificação de PPV1, podendo auxiliar em estudos de viremia, epidemiologia e monitoramento do vírus nas granjas. No segundo estudo, foi realizada a detecção por PCR de circovírus suíno tipo 2 (PCV2), PPV1, parvovírus suíno tipo 2, torque teno vírus suíno 1 e 2 (TTV1 e TTV2) e hokovirus suíno (PHoV) em pools de órgãos (linfonodos, pulmões, fígado, baço e rim) de leitões apresentando a Sídrome Multissistêmica do Definhamento Suíno (PMWS). Todas as amostras foram PCR positivas para PCV2 e os outros vírus foram detectados em todos os rebanhos, com exceção do TTV1. As amostras também foram positivas na PCR para PPV1 (81,6%), PPV2 (73,7%), TTV1 (5,3%), TTV2 (86,8%) e PHoV (55,3%). Os resultados indicam que leitões com PMWS e infectados com PCV2 apresentaram co-infecções com outras espécies de parvovirus e anelovirus, que podem estar envolvidos na apresentação da PMWS. Devido às poucas informações sobre a variabilidade genética do PHoV, oito fragmentos sobrepostos da região VP1/VP2 de quatro amostras foram amplificados e sequenciados. Na análise filogenética, as amostras brasileiras de PHoV apresentaram-se mais estreitamente relacionadas às amostras européias. O presente trabalho relata a primeira detecção de PPV2 e PHoV em co-infecções com PCV2 e a primeira caracterização genética de amostras de PHoV no Brasil. / Porcine parvovirus 1 (PPV1) has worldwide distribution and causes an important reproductive losses. The present dissertation was performed to develop a real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) using a TaqMan probe based on NS1 gene to detect and quantify PPV1 in serum samples. The specificity, sensitivity, reproducibility and quantitative range of the real time PCR were evaluated and compared with conventional nested PCR (nPCR). The standard curve of real-time PCR was linear ranging from 6 x 106 genome copies equivalent/mL (gce/mL) to 2 x 103 gce/mL with a square of the correlation coefficient (R2 value) of 0.98. No cross-reactivity was detected with closely related parvovirus or with viruses that causes similar symptoms and all PPV1 strains showed fluorescence in the assay. Comparing these techniques, 11 samples were positive in both tests and nPCR detected four additional samples. The concordance, sensitivity and specificity between the techniques were 98%, 73% and 100%, respectively. In conclusion, nPCR showed more sensitivity, however, real-time PCR could be a useful tool for diagnosis and quantification of PPV1 in serum samples and can be used for viremia studies, epidemiology and monitoring PPV1 infection in swine herds. The second study was performed in order to detect porcine circovirus 2 (PCV2), PPV1, porcine parvovirus 2, torque teno virus 1 and 2 (TTV1 and TTV2) and porcine hokovirus (PHoV) in different pooled tissues (lymph nodes, lungs, liver, spleen and kidneys) of piglets displaying Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by PCR. All the samples were PCR positive for PCV2 and the other viruses were detected in all herds, with the exception of TTV1. The samples were positive for TTV2 (86.8%), PPV1 (81.6%), PPV2 (73.7%), PHoV (55.3%) and TTV1 (5.3%). These results showed that piglets displaying PMWS and infected with PCV2 presented co-infections with other virus, which could be involved in the syndrome. Since there are few data about genetic variability of PHoV, eight overlapping fragments of VP1/VP2 region of PHoV were amplified and. In phylogenetic analysis, Brazilian PHoV sequences were more closely related to European sequences. The results indicate that piglets displaying PMWS are PCV2 infected and can be co-infected with different parvovirus and circovirus species.

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