Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées, reposant sur l’action conjuguée d’un photosensibilisateur (PS), de la lumière et de l’oxygène. Dans le cadre d’un nouveau mode de PDT, la VTP (vascular targeted photodynamic therapy), notre stratégie a consisté à favoriser l’effet anti-vasculaire du traitement par ciblage de la néo-vascularisation tumorale. Pour cela, nous avons étudié in vitro et in vivo un PS de type chlorine (TPC) couplé, via le bras espaceur (Ahx), à un heptapeptide (ATWLPPR) spécifique d’un co-récepteur du VEGF, la neuropiline-1 (NRP-1). Une étude comparative de la TPC versus le PS conjugué (TPC-Ahx-ATWLPPR), a permis de mettre en évidence in vitro, grâce à une technique d’ARN interférence visant à éteindre l’expression de NRP-1, une incorporation cellulaire récepteur-dépendante du conjugué. In vivo, l’accumulation préférentielle de la TPC-Ahx-ATWLPPR au niveau de l’endothélium vasculaire de la tumeur ainsi que son effet anti-vasculaire après PDT ont été mises en évidence. Une étude de stabilité in vitro et in vivo du conjugué a été réalisée. In vivo, la séquence peptidique est dégradée 4 h après injection par voie intra-veineuse. Des études de pharmacocinétique et de biodistribution tissulaire de la TPC-Ahx-ATWLPPR et de son principal produit de dégradation, TPC-Ahx-A ont été réalisées chez la souris nude xénogreffée. La dégradation de la partie peptidique est majoritaire dans les organes du système réticulo-endothélial où l’accumulation du conjugué est la plus importante. Dans le but d’augmenter la stabilité in vivo du peptide adresseur, de nouveaux peptides ont été synthétisés, puis couplés à la TPC et testés. Le pseudopeptide A?[CH2NH]TWLPPR est prometteur car il reste affin vis-à-vis de NRP-1 et après couplage au PS, il ne subit aucune dégradation dans le 8plasma in vivo 4 h après injection par voie intra-veineuse. / Photodynamic therapy (PDT) is a treatment modality against small localized tumors, based on the combined action of a photosensitizer (PS), light and oxygen. A new method of PDT, the VTP (vascular targeted photodynamic therapy) was studied. The purpose of our strategy is to promote the anti-vascular effect of PDT by targeting the tumor vasculature. We studied the behaviour of the tetraphenylchlorine (TPC) conjugated, via the Ahx spacer, to a VEGF co-receptor (neuropilin-1) specific heptapeptide (ATWLPPR), in vitro and in vivo. A comparative study of TPC versus the conjugated PS, TPC-Ahx-ATWLPPR, allowed us to identify in vitro, using a technique of RNA interference-mediated silencing of NRP-1, a receptor-dependent uptake of the conjugate. In vivo, a preferential accumulation of TPC-Ahx-ATWLPPR in endothelial cells and its anti-vascular effect were demonstrated. A study of stability in vitro and in vivo of the conjugate was conducted. In vivo, the peptide sequence was degraded 4 h after intra-venous injection. Pharmacokinetics and tissue biodistribution studies of TPC-Ahx-ATWLPPR and its main degradation product, TPC-Ahx-A, was performed in bearing nude mice. The degradation process of the peptide is important in the organs of the reticulo-endothelial system, where the accumulation of the conjugate is majority. In order to improve in vivo stability of the targeting-peptide, new peptides were design and tested. The pseudopeptide A?[CH2NH] TWLPPR bound NRP-1, and after coupling with the PS, no degradation is observed in plasma in vivo 4 h after intra-venous injection.

Les évènements cardiovasculaires sont la première cause de mortalité chez les patients insuffisants rénaux chroniques. Ces complications font suite à des modifications structurelles et fonctionnelles de la paroi vasculaire regroupées sous le terme de vasculopathie urémique. Parallèlement à ces modifications vasculaires, l’urémie s’accompagne d’une accumulation de substances non épurées par le rein appelées toxines urémiques, telles que les produits de la glycation avancée (AGEs) ou les ligands de RAGE. Ces toxines peuvent interagir avec leur récepteur, RAGE, qui est pro- inflammatoire et impliqué dans le remodelage artériel. Cette thèse a consisté en l’étude, chez la souris, du rôle de l’accumulation des ligands de RAGE et de leur interaction avec celui-ci dans le développement de l’athérosclérose, des calcifications vasculaires et de la thrombose artérielle au cours de l’insuffisance rénale chronique (IRC). Dans un premier temps, nous avons montré que l’IRC conduisait à une accumulation des AGEs et des ligands de RAGE sériques et tissulaires, ainsi qu’une augmentation de l’expression de RAGE au sein de la paroi vasculaire participant à la formation des plaques d’athérome. Dans un second temps, nous avons démontré que RAGE participait aux calcifications vasculaires favorisant l’expression de co-transporteur de phosphate inorganique (Pit-1), induisant la différenciation des cellules musculaires lisses en cellules « osteoblast-like ». Enfin, nous avons montré que RAGE participait à la formation d’un thrombus artériel dû à une hyperactivité plaquettaire. En conclusion, cette thèse a permis de renforcer le concept que l’axe ligands de RAGE/RAGE est un acteur important dans la vasculopathie urémique. / Cardiovascular events are the primary cause of morbidity and mortality in chronic kidney disease patients. These complications are due to structural and functional changes in the vascular wall named uraemic vasculopathy. Alongside these vascular changes, uremia is accompanied by the retention of various solutes that are normally excreted by the kidneys called uremic toxins, such as the products of advanced glycation (AGEs) or the ligands of RAGE. These toxins may interact with their receptor, RAGE, which is pro-inflammatory and involved in arterial remodeling. The aim of this thesis was to study, in mice, the role of the accumulation of RAGE ligands and their interaction with it in the development of atherosclerosis, vascular calcification and arterial thrombosis in chronic renal failure (CKD). Initially, we showed that CKD leads to an accumulation of serum and tissue AGEs and RAGE ligands, as well as an increase in RAGE expression in the vascular wall involved in atheroma plaque formation. Secondly, we have demonstrated that RAGE is involved in vascular calcification promoting the expression of inorganic phosphate cotransporter (Pit-1), inducing the differentiation of smooth muscle cells "osteoblast-like". Finally, we showed that RAGE participated in the formation of arterial thrombus due to platelet hyperactivity. In conclusion this thesis consolidates that RAGE-RAGE ligands axis is an important actor in uremic vasculopathy.

Récemment, l'utilisation de la technique d'assemblage couche par couche de polyélectrolytes naturels a été suggérée comme une nouvelle procédure de modification de surface. Le but de notre travail était de développer des films à base de CHI et de HA fonctionnalisés et réticulés. La biocompatibilité a été évaluée par MEB et visualisation des filaments d'actine. La différenciation endothéliale des CSMs a été suivie par Western Blot. Ensuite, la fonctionnalité des cellules a été évaluée par immunofluorescence du vWF et marquage au Dil-Ac-LDL. Le MEB a montré une morphologie fibroblastique des cellules sur CHI/HA et CHI-SH/HA-Thio. L'analyse par WB des cellules différenciées a montré une augmentation de l'expression de CD31, VEGF-R2 et VE-cadhérine sur CHI-SH/HA-Thio et CHI/HA. Les films CHI-SH/HA-Thio étaient biocompatibles et promouvaient le potentiel de différenciation endothéliale / Recently, the use L-b-L assembly of natural polyelectrolytes has been suggested as a new technique of surface modification. The aim of our work was to develop multilayered films based on CHI and HA polymers bearing chemical. WJ-MSCs were seeded on these substrates. Biocompatibility was assessed by SEM and actin visualization. WJ-MSCs differentiation into endothelial phenotype was followed by western blot. First of all, SEM showed a fibroblastic morphology of adherent cells on CHI/HA and CHI-SH/HA-Thio as for control. WB analysis showed a rise of CD31, VEGF-R2 and VE-cadherin expression on CHI-SH/HA-Thio and CHI/HA. Films CHI-SH/HA-Thio were biocompatible and promoted endothelial differentiation potential

Le but de cette étude était d'évaluer les limitations fonctionnelles chez les adultes avec antécédent d’AVC et de décrire le devenir fonctionnel des patients admis en rééducation en France, suite à un AVC aigu, en fonction du type de structure (spécialisée ou non). Les données de l’enquête Handicap-Santé et les bases PMSI 2009 (Programme de Médicalisation du Système d'Information) ont été utilisé. La prévalence globale de l'AVC était de 1,6% de la population française adulte (dont 34,4% dépendants). Les difficultés pour l’autonomie augmentent avec l'âge, mais le risque relatif de dépendance diminuait avec l’âge (17 à 25 avant 60 ans ; 1,5 à 2,2 après 85 ans). 10,3% des participants ont déclaré raideur articulaire liée à l'AVC mais son impact fonctionnel n'était pas significatif lorsqu’était inclus dans le modèle le niveau de déficience motrice (OR = 1,18; IC = 0,60-2,29). Enfin suite à un AVC, parmi les 83 505 survivants, 28 201 ont été admis pour la réhabilitation (33,8%). Après ajustement, la rééducation en centre spécialisé était liée à une plus grande probabilité d'amélioration fonctionnelle (OR = 1,75, p <0,001) / The aim of this study was to evaluate functional limitations in adults with and without self-reported stroke and to describe the functional outcome of post-stroke patients admitted for rehabilitation in France as a function of the rehabilitation setting (specialized or not). Data from a survey named “the Disability Health survey” and from the French Hospital Discharge Diagnosis databases were used. The overall prevalence of stroke was 1.6%. The mRS was over 2 for 34.4% of participants with stroke. Difficulty with activity of daily living increased with age but the relative risk was higher below the age of 60 (17 to 25) than over 85 years (1.5 to 2.2). 10.3 % of the participants reported stroke-related stiffness. When included motor impairment, multivariate analysis of the functional impact of the joint stiffness was not significant (OR= 1.18; CI = 0.60-2.29). Among the 83 505 survivors of acute stroke in 2009, 28 201 were admitted for rehabilitation (33.8%). After adjustment, rehabilitation in specialized center lead to a greater probability of functional improvement (OR=1.75, p<0.001)

Identification de déterminants génétiques impliqués dans la composante vasculaire de la MA, par analyses transcriptomiques, génétiques et moléculaires<br />La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie dégénérative du cerveau qui provoque la démence, avec une perte graduelle de mémoire, du jugement, et des fonctions cognitives. Cette maladie apparaît généralement chez les personnes âgées de plus de 65 ans, mais certaines formes moins fréquentes peuvent apparaître plus précocement. Les bases génétiques et moléculaires de la MA sont encore mal connues. L'hérédité des formes à début précoce est liée à des mutations dans trois gènes différents: le gène du précurseur de la protéine amyloïde (APP) sur le chromosome 21, le gène de la préséniline 1 (PS1) sur le chromosome 14 et le gène de la préséniline 2 (PS2) sur le chromosome 1. Cependant, ces mutations expliquent moins de 1% des cas de MA. Dans la grande majorité des cas, la génétique apparaît beaucoup plus complexe car résultant de l'interaction entre des facteurs environnementaux et divers gènes de susceptibilité. Malgré le consensus sur l'importance de la composante génétique de la MA, seul l'allèle ε4 du gène de l'apolipoprotéine E (APOE) a été retrouvé comme un facteur constant de vulnérabilité. Toutefois, plus de 200 gènes ont déjà été proposés comme déterminants génétiques de la MA, mais aucun consensus n'a pu être obtenu pour l'un d'entre eux en raison du manque de robustesse des associations observées au sein de populations indépendantes. Tout d'abord, nous avons cherché à reproduire l'association entre la MA et des polymorphismes localisés dans 3 gènes candidats (VEGF, PON1 et GAB2). Deuxièmement, afin la sélection de nouveaux gènes candidats, nous avons combiné les informations issues de carte génétique avec le profil d'expression de gènes. Cette stratégie résulte de deux grandes observations: (i) l'expression de nombreux gènes est modifiée au cours de l'étiologie de la MA, (ii) les polymorphismes dans les promoteurs de l'APOE, PS1, PS2 et APP gènes ont été associés à l'apparition de la MA. Par conséquent, nous avons supposé que les gènes situés dans les régions chromosomiques définies par des études de liaisons génétiques et présentant une expression différentielle entre des patients et des témoins, pourraient constituer des gènes candidats implique dans la MA. Nous avons effectué l'analyse transcriptomique de 2741 gènes situés dans les régions chromosomiques d'intérêt définies dans le cadre de la MA. Les niveaux de l'expression génique ont été évalués à partir d'ARN totaux provenant de tissus cérébraux post-mortem de malades et de témoins. Cent six gènes ont été retrouvés différentiellement exprimés. Ensuite, nous avons évalué, au sein de ces gènes, l'impact de polymorphismes sur le risque de développer la MA. Le polymorphisme le plus intéressant, situé sur le gène IL33, a été associé à la MA dans 3 populations cas-témoins indépendantes. En outre, nous avons pu montrer une implication de ce gène dans un processus physiopathologie touchant le réseau vasculaire cérébral au cours de la MA. De façon intéressante, IL33 est préférentiellement exprimé dans les cellules vasculaires. En effet, un nombre croissant de données suggèrent un rôle central des facteurs de risque cardiovasculaire, de la modification des parois artérielles, amenant à une hypoperfusion chronique du cerveau et au développement de la physiopathologie de la maladie. Ces données sont basées sur des études épidémiologiques, physiopathologiques, de neuro-imagerie, de neuropathologiques et d'études pharmacologiques. Toutes ces observations indiquent qu' une altération du réseau vasculaire pourrait être un facteur important dans le processus conduisant à la neurodégénérescence chronique dans la MA.

The central role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in physiological and pathological angiogenesis makes it attractive both as a therapeutic target for anti-angiogenic drugs in cancer treatment and as a pro-angiogenic cytokine to treat ischemic disease. Currently, it is well established that the VEGF but also other growth factors exert their angiogenic effects partly through the activation of endothelial nitric oxide synthase (eNOS). A better understanding of the VEGF/NO signaling pathway could therefore lead to the identification of new therapeutic targets to impact on angiogenesis.This thesis is based on four different articles, the principal findings of which are summarized here below. First, we demonstrated that, chronologically, endothelial cell exposure to VEGF first led to eNOS dissociation from caveolin (a hallmark of the Ca2+/CaM-mediated activation of eNOS), and then to the interaction of eNOS with the heat shock protein hsp90. We also reported that eNOS-bound hsp90 could recruit VEGF-activated (phosphorylated) Akt to the complex, which in turn could phosphorylate eNOS on the serine 1177. Finally, we found that although the VEGF-induced phosphorylation of eNOS led to a sustained production of NO independently of a maintained increase in intracellular [Ca2+], this late stage of eNOS activation was strictly conditional on the initial VEGF-induced Ca2+-dependent stimulation of the enzyme. These data established the critical temporal sequence of events leading to the sustained activation of eNOS by VEGF and suggested new ways of regulating the production of NO in response to this cytokine through the structural protein caveolin and the ubiquitous chaperone protein, hsp90. A second study identified caveolin and Hsp90 as key players in the proangiogenic action of statins and therefore as potential pharmacological targets to modulate NO-dependent angiogenesis. We found that atorvastatin stabilized endothelial tube formation from both outgrowing and isolated macrovascular ECs cultured in Matrigel through a decrease in caveolin abundance and in its inhibitory interaction with eNOS. In a similar angiogenic assay, microvascular endothelial cells appeared also responsive to statins, not through a decrease in the caveolin pool (which is (too) large in these cells) but via the increased recruitment of hsp90 in the eNOS complex and the associated eNOS phosphorylation on the serine 1177. These data provided new mechanistic insights into the NO-mediated effects of statins and underscored the potential of these drugs and other modulators of hsp90 and caveolin abundance to promote neovascularization in disease states associated or not with atherosclerosis. In a third study, we have reported a net decrease in the ability of cultured ECs expressing recombinant caveolin to migrate and to form capillary like networks (e.g. the crucial steps occurring during the angiogenic process) in presence of VEGF. We then exploited the propensity of cationic lipids to target EC lining tumor blood vessels to transfect tumor-bearing mice in vivo. A dramatic tumor growth delay associated to a decrease in tumor microvessel density in the central core of the tumor was observed in mice transfected with caveolin versus sham-transfected animals. Interestingly, we also found that in the early time after lipofection (e.g. when macroscopic effects on tumor growth were not yet detectable), caveolin expression also impaired NO-dependent tumor blood flow. These findings indicated that besides (before) acting as an anti-angiogenic agent, recombinant caveolin can modulate the endothelium phenotype and impact on the tumor blood flow, both effects leading to a decrease in tumor growth. Finally, we showed that the activation of the VEGF/NO signaling pathway led to the down-regulation of adhesion molecules and to the anergy of endothelial cells. We found, indeed, that the adhesion of human CD8+ lymphocytes on microvascular endothelial cells exposed to TNF-a was dramatically reduced in the presence of VEGF. Interestingly, we also documented that the co-administration of the NOS inhibitor L-NAME or the Hsp90 inhibitor geldanamycin could restore this adhesion to the level originally obtained with TNF-a alone. Finally, we confirmed the key role of NO in the VEGF-mediated effects on the CD8+ adhesion by tipping the balance towards more or less angiogenesis through the transfection of caveolin siRNA or caveolin plasmid, respectively. In these experiments, lymphocyte adhesion appeared directly correlated to the extent of caveolin expression, confirming that the so-called anti-angiogenic strategy can directly impact on the phenotype of (tumor) endothelial cells and instead of (before) killing them, be exploited to potentiate cancer immunotherapy. In conclusion, by dissecting the post-translational regulation of eNOS, we have identified major therapeutic targets, namely caveolin and hsp90, that may be exploited either to block or promote angiogenesis. More particulary, cDNA encoding for these proteins or their mutant form, when combined with adequate mode of delivery, appeared to exert profound effects on the vascular compartment of tumors but also of ischemic tissues.

Lintérêt actuel suscité par la contribution des prostanoïdes en général et par le TXA2 en particulier à lhoméostasie cardio-vasculaire, nous a conduit à mener une série de procédures expérimentales chez le porc. Nous avons ainsi étudié son effet sur la vasomotricité systémique qui se résume en une élévation des résistances vasculaires systémiques (R2) et une diminution de la compliance vasculaire (C). Nous avons également démontré son action pro coagulante et pro inflammatoire dans un processus dischémie myocardique induit par application topique de FeCL3. Dans ce processus, le TXA2 nexerce aucun effet sur lévolution des paramètres hémodynamiques systémiques. Enfin, il joue un rôle mineur dans lischémie-reperfusion myocardique mais il est important de rappeler que dans notre procédure expérimentale, linduction de lischémie se faisait de façon abrupte par application dun clamp coronaire ce qui rend les mécanismes thrombotiques et dont la libération de TXA2 moins prépondérants.Lutilisation d'un modulateur du thromboxane A2, le BM-573, savère efficace dans la prévention des effets de lagoniste du TXA2, lU-46619, sur les résistances vasculaires périphériques. Le BM-573 exerce de plus un effet cardioprotecteur en cas dischémie myocardique, mais aucun effet bénéfique nest observé en cas dischémie-reperfusion myocardique.Le TXA2 joue donc un rôle important dans lhoméostasie cardiovasculaire et intervient avec dautres médiateurs dans la physiopathologie de lhypertension artérielle et de lischémie myocardique. Nous navons cependant pas démontré sa contribution exacte au processus dischémie-reperfusion myocardique / Prostanoids in general and thromboxane A2 in particular appear to play a crucial role in cardiovascular homeostasis. To address this issue, we have carried out a number of experimental procedures in the pigs. We were able to show that the effects of TXA2 on sytemic vascular hemodynamic, consist in an increase of vascular resistance and a decrease of vascular compliance. Additionnaly, TXA2 had a procoagulant and proinflammatory effects in a model of myocardial ischaemia induced by topical application of FECL3 on the left anterior descending coronary artery. No effects were noticed concerning the evolution of systemic hemdynamics parameters. Finally, TXA2 appeared to play a minor role in a myocardial ischaemia-reperfusion model. The use of a TXA2 modulator, BM-573, prevented the systemic vascular effects of TXA2. It also had a cardioprotective effect in the model of myocardial ischaemia, but failed to prevent reperfusion injury in acutely ischemic pigs. We conclude that TXA2 plays an important role in cardiovascular homeostasis and that it intervenes along with others mediators in the physiopathology of hypertension and myocardial ischaemia.

Le traitement des tumeurs cérébrales représente un défi d'envergure, puisqu'elles sont isolées du reste du corps par la barrière hémato-encéphalique. Il est donc impératif d'accroître nos connaissances sur les cellules composant ces tumeurs. L'une des hypothèses émergentes concerne la présence d'une sous-population spécifique de cellules au sein de la tumeur, les cellules souches cancéreuses (CSC), impliquées dans l'initiation et la récurrence des cancers. Les marqueurs de surfaces des CSC varient largement selon le tissu d'intérêt, mais il semble que CD133, une glycoprotéine membranaire, soit une signature commune à plusieurs CSC. S'il est courant de traiter le cancer en ciblant les cellules cancéreuses elles-mêmes, cibler le microenvironnement dans lequel évolue la tumeur est une avenue thérapeutique prometteuse. En effet, les cellules endothéliales (CE) au sein d'une tumeur sont connues pour avoir des propriétés différentes des CE normales. Ces cellules endothéliales tumorales (CET) peuvent donc constituer une cible supplémentaire pour inhiber sélectivement la croissance tumorale. À l'aide d'une lignée de médulloblastome (DAOY), nous avons identifié et évalué de nouvelles caractéristiques cellulaires et moléculaires impliquées dans la régulation du phénotype invasif associé à la formation de structures comparables aux neurosphères formées par les CSC CD133(+). De plus, nous avons apporté de nouvelles informations concernant les propriétés chimiopréventives du sulforaphane (SFN), un composé naturel retrouvé principalement dans le brocoli, en ciblant spécifiquement les CET cérébrales possiblement impliquées dans la cooption vasculaire. En utilisant la technologie de l'ARN interférant, nous avons montré que MMP-9 et MT1-MMP, deux métalloprotéinases matricielles importantes pour l'invasion cellulaire, les métastases et la résistance à la radiation, avaient un rôle crucial dans la formation par les DAOY de structures apparentées aux neurosphères CD133(+). De plus, nous avons mis en évidence une inhibition presque complète (> 90 %) de la migration des HBMEC (human brain microvascular endothelial cell) activées par un carcinogène, le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA). Ainsi, nos résultats suggèrent que les molécules présentes dans notre diète pourraient cibler les CET cérébrales composant la masse tumorale. En somme, nous proposons que MMP-9 constitue une cible de choix pour le traitement du cancer, que ce soit au niveau du compartiment tumoral ou vasculaire. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cellule souche cancéreuse (CSC), Cellule endothéliale tumorale (CET), Sulforaphane (SFN), Métalloprotéinase matricielle-9 (MMP-9), Tumeur cérébrale.