Une transduction efficace des cellules souches hematopoïetiques est un préalable pour la thérapie génique des maladies génétiques comme la β‐thalassemie, l’Adrenoleucodystrophie et le Déficit Immunitaire Combiné Sévère. La petite molécule UM171 à été décrite comme étant une molécule capable de stimuler l’expansion in vitro des cellules souches hématopoïétiques humaines, permettant ainsi une plus large application des thérapies basées sur les cellules souches. Nous avons aussi conduit des études supplémetaires pour confirmer la capacité de UM171 à expandre les souches hématopoïétiques. Durant ce travail, nous avons découvert que UM171 pouvait aussi augmenter de maniére significative, l’efficience de la transduction lentivirale des cellules hématopoïetiques primitives dérivées de sang de cordon. En plus, nous avons montré que UM171 augmentait la transduction des cellules hématopoïeques ayant les phénotypes les plus immatures. Des études plus approfondies ont aussi révélé que UM171 pouvait aussi augmenter la transduction des cellules souches hématopoïétiques avec des lentivirus ayant diffèrent pseudotypes. Au total ces découvertes ont pour conséquence, une nette amélioration des protocoles d’expansion et de transduction des cellules souches hématopoïétiques à travers un meilleur rendement en cellules souches et des taux élevés de transfert de gène en utilisant des quantités réduites de particules virales / Efficient lentiviral gene transfer to hematopoietic stem cells is a prerequisite for theultimate goal of gene therapy for a range of major genetic diseases such as β‐thalassemia, Adrenoleucodystrophy and severe combined immnodeficiency. The small molecule UM171 was recently described as having potent ability to stimulate ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells, another key to safer and wider application of stem cell mediated therapies. Here we have conducted additional studies to confirm the stem cell expansion properties of UM171 and in the course of this work discovered that it also has the ability to significantly enhance the efficiency of the lentiviral transduction of primitive hematopietic cells in human cord blood. Subsequent work confirmed that this enhancing effect extends importantly to the most primitive hematopoietic subset as assessed phenotypically and by functional readout in immunodeficient mouse xenografts. Further detailed characterization ofthis phenomenom revealed that UM171’s effects are manifest rapidly and extend to a range of lentiviral pseudotypes. Together these findingsprovide an avenue for improved protocols for hematopoietic stem cell transduction that achieve higher gene efficiency and stem cell recovery coupled with the potential for reduced viral titer requirements.

Ce travail s'inscrit dans le domaine du traitement automatique du langage naturel et traite plus spéci?quement de l'application de ce dernier à la segmentation thématique de texte. L'originalité de cette thèse consiste à intégrer dans une méthode non-supervisée de segmentation thématique de texte de l'information syntaxique, sémantique et stylistique. Ce travail propose une approche linéaire de la segmentation thématique s'appuyant sur une représentation vectorielle issue de l'analyse morpho-syntaxique et sémantique de la phrase. Cette représentation est ensuite utilisée pour calculer des distances entre segments thématiques potentiels en intégrant de l'information stylistique. Ce travail a donné lieu au développement d'une application qui permet de tester les di?érents paramètre de notre modèle, mais qui propose également d'autres approches testées dans ce travail. Notre modèle a été évaluer de deux manières di?érentes, une évaluation automatique sur la base de textes annotés et une évaluation manuelle. Notre évaluation manuelle a donné lieu à la dé?nition d'un protocole d'évaluation s'appuyant sur des critères précis. Dans les deux cas, les résultats de notre évaluation ont été au niveau, voir même au dessus, des performances des algorithmes les plus populaires de la littérature.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2002. / Bibliogr.: f. [73]-78. Publié aussi en version électronique.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Le polyéthylène glycol (PEG) est un polymère reconnu comme généralement sécuritaire (GRAS) et son utilisation est très répandue dans plusieurs domaines, dont celui de la pharmaceutique. Ce polymère peut être conjugué à des protéines ou des vecteurs pharmaceutiques transportant des médicaments afin de prolonger le temps de circulation dans l'organisme. Bien que le PEG ait été considéré comme non immunogène, des études récentes montrent qu'environ 20 à 70 % de la population possèdent des anticorps capables de reconnaitre le polymère. Par un effet neutralisant, ces anticorps anti-PEG pourraient réduire l'efficacité et le temps de circulation de certains médicaments PEGylées. Ces travaux s'intéressent à comprendre les mécanismes derrière la réponse immunitaire anti-PEG des vecteurs pharmaceutiques et plus particulièrement des nanoparticules de polymère composé de PLGA-PEG. Notre hypothèse est que ces nanoparticules de polymère causent la production d'anticorps anti-PEG initier à l'aide de la cascade du complément. Lors de ces travaux, des anticorps anti-PEG étaient mesurés après sept jours, peu importe la voie d'administration des nanoparticules. L'isotype des anticorps dirigés contre le PEG mesuré est majoritairement des IgM. Les anticorps anti-PEG en circulation réduisent le temps de circulation de différentes architectures PEGylées, dont les nanoparticules et les liposomes. La présence des anticorps IgM anti-PEG altère les protéines retrouvées à la surface des nanoparticules. Des souris splénectomisées ont été utilisées dans plusieurs expériences afin d'investiguer le rôle de la rate dans la production des anticorps anti-PEG après l'administration de nanoparticules. Chez les souris qui ne possédaient pas de rate, la production des anticorps anti-PEG était abrogée lorsque les nanoparticules étaient administrées par voie intraveineuse. Par voie d'injection sous-cutanée, une petite quantité d'anticorps anti-PEG était mesurée après sept jours dans le plasma des souris splénectomisées. Ensuite, deux modèles de souris avec une cascade du complément abrogé (CVF) ou absence (C3[exposant -/-]) ont été utilisés pour investiguer le rôle de la cascade du complément sur la production des anticorps anti-PEG. La cascade du complément semble impliquée dans la production des anticorps anti-PEG lorsque les nanoparticules sont administrées par voie intraveineuse. Lors d'une injection sous-cutanée des nanoparticules, la concentration IgM anti-PEG mesurée après 7 jours est similaire entre le groupe témoin et le groupe ne possédant pas de cascade du complément active. Finalement, des études en cytométrie en Flux avec des nanoparticules fluorescente administrée à des souris avec et sans complément nous ont permis d'identifier l'importance des protéines du complément sur l'interaction entre les cellules immunitaires et les nanoparticules. Les protéines du complément à la surface des nanoparticules semblent favoriser leur interaction avec les lymphocytes B splénique. Les protéines du complément ne semblent pas changer l'interaction des nanoparticules avec les cellules B des ganglions lymphatiques après une administration sous-cutanée. Ces résultats suggèrent que le différent mécanisme est impliqué lors de la production des anticorps anti-PEG, selon la route d'administration des nanoparticules. Des études supplémentaires sont requises pour comprendre les effets de ces anticorps anti-PEG en clinique. / Polyethylene glycol (PEG) is a polymer recognized as generally safe (GRAS) and its use is widespread in several fields. This polymer can be conjugated to proteins or pharmaceutical carriers carrying drugs to prolong circulation time in the body. Although PEG has been considered as non-immunogenic, recent studies show that approximately 20-70% of the population have antibodies that can recognize the polymer. Through a neutralizing effect, these anti-PEG antibodies could reduce the effectiveness and circulation time of certain PEGylated drugs. This work focuses on understanding the mechanisms behind the anti-PEG immune response of pharmaceutical vectors and more particularly of polymer nanoparticles composed of PLGA-PEG. Our hypothesis is that these polymer nanoparticles cause the production of anti-PEG antibodies to initiate with the help of the complement cascade. During this work, anti-PEG antibodies were measured after 7 days, regardless of the route of administration of the nanoparticles. The isotype of the antibodies directed against the PEG was IgM. Anti-PEG antibodies in circulation reduce the circulation time of different PEGylated architectures including nanoparticles and liposomes. The presence of anti-PEG IgM antibodies alters the proteins found on the surface of the nanoparticles. In addition, anti-PEG antibodies promote the activation of the complement cascade which helps eliminate subsequent doses of nanoparticles. Splenectomized mice have been used in several experiments to investigate the role of the spleen in the production of anti-PEG antibodies after the administration of nanoparticles. In mice without a spleen, the production of anti-PEG antibodies was abrogated when the nanoparticles were administered intravenously. By subcutaneous injection, a small quantity of anti-PEG antibodies were measured after seven days in the plasma of splenectomized mice. Two mouse models with an abrogated complement cascade (CVF) or absence (C3[superscript -/-]) were used to investigate the role of the complement cascade on the production of anti-PEG antibodies. The complement cascade seems to be involved in the production of anti-PEG antibodies when the nanoparticles are administered intravenously. During a subcutaneous injection of the nanoparticles, the anti-PEG IgM concentration measured after 7 days is similar between the control group and the group without an active complement cascade. Finally, Flow cytometry studies with fluorescent nanoparticles administered to mice with and without complement allowed us to identify the importance of complement proteins on the interaction between immune cells and nanoparticles. Complement proteins on the surface of the nanoparticles appear to promote their interaction with splenic B lymphocytes. The complement deposited on the nanoparticles does not appear to direct their interaction with the B cells of the lymph nodes after subcutaneous administration. These results suggest that different mechanisms are involved in the production of anti-PEG antibodies, depending on the route of administration of the nanoparticles. Further studies are required to understand the effects of these anti-PEG antibodies in the clinic.

Les glioblastomes sont des tumeurs du système nerveux central hautement létaux. Ils se caractérisent par leur grande infiltration dans les tissus avoisinants. Ils modifient les vaisseaux sanguins préexistants et ils migrent d’une façon perivasculaire. Cette cooption vasculaire est un processus entraînant l’expression d’Angiopoietine-2 (Angpt2) par des cellules endothéliales et sa liaison au récepteur Tie2. Le premier objectif de cette étude était d’examiner le potentiel thérapeutique de deux protéines qui pourraient interférer avec Angpt2, à savoir Angpt3 et la partie soluble extracellulaire du récepteur Tie2 (sTie2). Le deuxième objectif était de développer des vecteurs lentiviraux capables d’exprimer ces protéines, tout en offrant la possibilité d’identifier et détruire les cellules génétiquement modifiées. À cette fin, nous avons construit un vecteur contenant une cassette bicistronique qui exprime le marqueur amélioré de la protéine fluorescente verte (EGFP) fusionnée au gène suicide provenant du virus herpès simplex de type I-thymidine kinase (HSVtk). Les cellules du gliome GL261 transduites avec ce vecteur pourraient être suivies et tuées sur demande par l’administration de la prodrogue ganciclovir, soit in vitro, soit après l'implantation dans le cerveau des souris. Malgré l’expression des hauts niveaux d’Angpt3 et de sTie2 obtenus avec ce vecteur, nous avons observé qu’Angpt3 augmente la déstabilisation capillaire et la croissance de gliomes, alors que sTie2 n’exerce aucun effet. Globalement, cette étude a permis de comprendre l’importance de la voie de signalisation de Tie2 dans le développement des gliomes et le rôle d’Angpt3, mais suggère que ni cette molécule ni sTie2 soient des agents efficaces contre les gliomes malins. Cette étude fournit également le prototype d’un vecteur lentiviral pour la thérapie génique plus sécuritaire. / Glioblastomas are highly lethal tumors of the central nervous system characterized by large spread into the surrounding tissues. They modify and migrate along pre-existing blood vessels. This vascular cooption is a process involving the release of angiopoietin-2 (Angpt2) from endothelial cells and binding to the Tie2 receptor. The first goal of this study was to examine the therapeutic potential of two proteins that could interfere with Angpt2, namely Angpt3 and the soluble extracellular domain of Tie2 (sTie2). The second goal was to develop a lentiviral vector capable of delivering such proteins while offering the possibility to identify and destroy the genetically modified cells. To this end, we designed a bicistronic construct expressing the marker enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the suicide gene herpes simplex virus 1-thymidine kinase (HSVtk). GL261 glioma cells transduced with this vector could be tracked and killed on command by the administration of the prodrug ganciclovir, either in vitro or after implantation into mouse brains. High levels of Angpt3 or sTie2 could be achieved with this vector; however, Angpt3 increased capillary destabilization and glioma growth, whereas sTie2 exerted no effect. Overall, this study helps to understand the importance of the Tie2 signaling pathway in glioma development and the role of Angpt3, but suggests that neither this molecule nor sTie2 are effective agents against malignant gliomas. This study also provides a lentiviral vector design for safer gene therapy.

L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive est une maladie génétique rare causée par des mutations dans COL7A1 codant pour le collagène de type VII. Cette protéine est produite par les kératinocytes de l’épiderme et les fibroblastes du derme et permet la formation des fibrilles d’ancrages dont le rôle est l’adhésion de l’épiderme au derme sous-jacent. Les patients atteints de l'EBDR souffrent de décollements de la peau et des muqueuses et aucun traitement ne permet de guérir cette maladie. Le but de ce projet est de construire un vecteur viral sécuritaire contenant l'ADNc de COL7A1 et de générer un clone de cellules productrices de virus à haut titre permettant de transduire assez de kératinocytes souches pour produire des peaux reconstruites et traiter les patients atteints de l'EBDR. Divers vecteurs rétroviraux "self-inactivated" exprimant l'ADNc de gfp ou de COL7A1 ont été générés. Les vecteurs GFP ont permis de déterminer que le remplacement de la région U3 du LTR 5' par l'enhancer et le promoteur du CMV, l'ajout de la séquence WPRE en 3' UTR du transgène, l'insertion de la séquence de polyadénylation du SV40 dans la région R du LTR 3' et l'ajout de la séquence de polyadénylation de bGH en aval du LTR 3', génèrent les titres viraux les plus élevés. L'ADNc de COL7A1 a été introduit dans un rétrovirus SIN optimisé puis transfecté dans une lignée d’encapsidation exprimant l’enveloppe Amphotropique 4070A. Un clone de cellules productrices produisant 9,8 x 105 particules virales par mL a été isolé. Le virus produit par ce clone est capable de transduire les kératinocytes et fibroblastes de patients atteints de l'EBDR à un taux de transduction de 37 % et 24 % respectivement. En somme, un clone de cellules productrices d’un vecteur rétroviral sécuritaire portant COL7A1 a été généré et a le potentiel d’être utilisé pour la thérapie génique de l’EBDR. / Recessive dystrophic epidermolysis bullosa is a rare genetic disorder caused by mutations in COL7A1 encoding type VII collagen. This protein is produced by the epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts and allows the formation of anchor fibrils whose role is the adhesion of the epidermis to the underlying dermis. Patients with EBDR suffer from skin and mucosal detachments and no treatment can cure this disease. The goal of this project is to construct a safe viral vector containing COL7A1 cDNA and to generate a high-titer virus-producing cell clone in order to transduce enough keratinocytes stem cells to produce reconstructed skins to treat patients with EBDR. Various self-inactivated retroviral vectors expressing gfp or COL7A1 cDNA have been generated. The GFP vectors allowed us to determine that the replacement of the U3 region of the 5' LTR by the CMV enhancer and promoter, the addition of the WPRE sequence to the 3 'UTR of the transgene, the insertion of the SV40 polyadenylation sequence into the R region of 3' LTR and the addition of the polyadenylation sequence of the bGH downstream of the 3' LTR generate the highest viral titers. COL7A1 cDNA was introduced into an optimized SIN retrovirus and transfected into a packaging cell line expressing the Amphotropic envelope 4070A. A clone of packaging cells producing 9.8 x 105 viral particles per mL was isolated. The virus produced by this clone is capable of transducing the keratinocytes and fibroblasts of patients with EBDR at a transduction rate of 37 % and 20 % respectively. In sum, a clone of cells producing a safe COL7A1 retroviral vector has been generated and has the potential of being used for gene therapy of EBDR.

Le potentiel de la thérapie génique pour le traitement de maladies a engendré beaucoup d'espoirs et d'importants efforts ont été réalisés dans ce domaine de recherche. A l'heure actuelle, les vecteurs viraux sont les plus efficaces pour transférer des gènes thérapeutiques dans les cellules humaines. Alors que différents vecteurs viraux sont en développement, les vecteurs rétroviraux dérivés du virus de la leucémie murine de Moloney (MLV) sont actuellement parmi les vecteurs les plus utilisés dans les essais cliniques. Le premier objectif de ce projet était d'étudier l'efficacité d'un nouveau vecteur d'encapsidation dérivé d'un autre retrovirus, le virus RDI 14. Nous avons démontré pour la première fois que des titres élevés pouvaient être obtenus avec des particules rétrovirales RDI 14. Ces vecteurs ont été aussi efficaces que les vecteurs MLV pour transduire des lymphocytes primaires et des cellules souches humaines CD34+. Par conséquent, les vecteurs rétroviraux dérivés du virus RDI 14 sont efficaces pour le transfert de gènes et peuvent être une alternative aux vecteurs MLV. La production de vecteurs rétroviraux pour des applications cliniques est difficile, dispendieuse et peu sécuritaire, car les lignées cellulaires qui les produisent poussent de façon adhérentes et en présence de sérum bovin. Le second objectif était de générer des nouvelles lignées d'encapsidation capables de répondre à ces limitations. Dans cette étude, nous rapportons la construction des premières lignées d'encapsidation produisant des vecteurs rétroviraux en suspension et en milieu sans sérum (MSS). Des cellules 293HEK ont été dans un premier temps modifiées pour exprimer des niveaux élevés de protéines gag-pol. Les gènes codant pour les protéines d'enveloppes Ampho, GALV et RDI 14 ont été par la suite utilisés pour générer trois lignées d'encapsidations différentes (293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30). Les titres obtenus avec les clones 293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30 en suspension et en MSS étaient respectivement de 4 x IO7, IO6 et 5 x IO6 particules virales infectieuses par ml (PVI/mL). La caractérisation des ces lignées a été réalisée par l'étude des dynamiques de croissance cellulaire, de la stabilité de production, de la stabilité des particules virales et de la capacité de transduction. Les résultats ont montré que les lignées 293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30 ont un bon potentiel pour la production à grande échelle de vecteurs rétroviraux. Ces lignées d'encapsidations devraient améliorer l'efficacité des protocoles cliniques de thérapie génique de dernière phase qui font appel à un nombre élevé de patients.

La thérapie génique, appelée aussi génothérapie, est une stratégie thérapeutique utilisable en principe pour traiter de nombreuses maladies génétiques. Une variation récente de cette approche thérapeutique utilise le système bactérien CRISPR/Cas9 (The Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)) pour modifier les gènes défectueux des patients atteints d'une maladie héréditaire. Ce système a déjà démontré sa grande capacité à modifier l'ADN chromosomique in vitro ainsi que in vivo mais le problème majeur réside au niveau de la livraison des composantes du système CRISPR, soit la Cas9 et un ARN guide (ARNg). Malgré l'existence de plusieurs vecteurs de livraison viraux ou non viraux, les Adeno-associated virus (AAV) sont les virus les plus utilisés pour livrer des gènes thérapeutiques aux cellules in vitro et aux animaux et aux humains in vivo. Malheureusement, cet outil de livraison commence à démontrer ses limites à cause de sa capacité d'empaquetage très limitée (environ 4.8 kb) par rapport à d'autres outils de livraison et à cause de son immunogénicité. Ces limitations nous amènent à développer une nouvelle approche qui pourrait être plus puissante et beaucoup moins immunogène soit l'utilisation des vésicules extracellulaires produites par toutes les cellules de l'organisme et qui constituent un outil de communication cellulaire. Les travaux de ce mémoire démontrent qu'il est possible d'introduire la protéine Cas9 et plus spécifiquement la Cas9 du Streptococcus pyogène (SpCas9) dans les vésicules extracellulaires. L'utilisation de ces vésicules nous a permis de livrer la SpCas9 à des cellules in vitro et d'induire une édition génique. / Gene therapy, also called genotherapy, is a therapeutic strategy used to treat many genetic diseases. A recent variation of this technology uses the bacterial CRISPR/Cas9 system, The Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) to modify the defective genes of affected patients. This system has already demonstrated its great capacity to modify chromosomal DNA in vitro as well as in vivo, but the major problem lies in the delivery of the CRISPR components (i.e., the Cas9 gene or protein and its guide RNA (gRNA)). Despite the existence of several viral and non-viral delivery vectors, Adeno-associated viruses (AAV) are the most used vector to deliver therapeutic genes to cells in vitro and to animals and humans in vivo. Unfortunately, this delivery vector is starting to demonstrate its limitations due to its very limited packaging capacity (about 4.8 kb) compared to other delivery vectors and due also to its immunogenicity. These limitations lead us to develop a new approach that could be more powerful and much less immunogenic such as extracellular vesicles, which are produced by all cell types in the body, and which constitute an inter-cellular communication tool. Our work demonstrates that we are able to introduce the Cas9 protein, more specifically the Streptococcus pyogene Cas9 (SpCas9) into extracellular vesicles. These vesicles allowed us to deliver the SpCas9 to cells in vitro and to induce genetic editing.