Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-28. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:47Z : No. of bitstreams: 1 000858080_20160630.pdf: 190100 bytes, checksum: 47dd9e01e892e41f2f90965bdb032201 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-01T13:02:23Z: 000858080_20160630.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:03:19Z : No. of bitstreams: 1 000858080.pdf: 604042 bytes, checksum: 52a63eb5887518214744f20b5b57d70e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Trueperella pyogenes são bactérias oportunistas caracterizadas por infecções piogênicas em animais, em geral refratárias aos tratamentos com antimicrobianos convencionais. Recentemente, os genes que codificam a exotoxina piolisina (plo), e fatores relacionados à adesão de T. pyogenes às células do animal susceptível, como fímbrias (fimA, fimC, fimE, fimG), neuraminidases (nanH, nanP), e proteína ligada ao colágeno (cbpA) têm sido associados a virulência do patógeno. O presente estudo investigou a ocorrência de multirresistência dos isolados aos antimicrobianos e a presença dos genes plo, fimA, fimC, fimE, fimG, nanH, nanP e cbpA em 41 linhagens de T. pyogenes isoladas de diferentes afecções em bovinos, caprinos, ovinos, equino e cão. T. pyogenes foi identificado predominantemente em casos de mastite (46,3%), abscessos (19,5%), pneumonia (9,8%), metritie (9,8%), linfadenite (7,3%), seguidos em menor frequência por encefalite (4,9%) e orquite (2,4%). A maior sensibilidade dos isolados foi observada para florfenicol (97,6%), azitromicina (97,6%), tetraciclina (95,2%), ceftiofur (92,7%), penicilina (92,7%), ampicilina (92,7%), gentamicina (90,3%) e eritromicina (87,8%). Em contraste, alta frequência de resistência dos isolados foi observada para bacitracina (46,3%), neomicina (31,7%), lincomicina (31,7%) e sulfametoxazole/trimetoprim (24,3%). O índice de resistência múltipla aos antimicrobianos - IRMA (>0,3) foi encontrado em 13 (31.7%) isolados, particularmente nos casos de mastite bovina. Dentre os isolados multirresistentes a três ou mais grupos de antimicrobianos, 12 (92,3%) foram identificados na espécie bovina, notadamente em infecções mamárias. Os genes mais frequentes detectados nos isolados foram: plo (40/41=97,6%), fimA (36/41=87,9%), nanP (34/41=82,9%), fimE (32/41=78,0%), nanH (28/41=62,3%), fimC (23/41=56,0%) e cbpA (5/41=12,2%). As principais associações de genes nos isolados foram observadas entre... / Trueperella pyogenes are opportunistic bacterium characterized by suppurative infections in domestic animals, commonly refractory to conventional therapy. Recently, genes which encode exotoxin pyolysin (plo), and factors that promote adhesion of T. pyogenes to host cells, such as fimbriae (fimA, fimC, fimE, fimG), neuraminidases (nanH, nanP), and collagen-binding protein (cbpA) have been associated to virulence of pathogen. The aim of present study was investigate occurrence of multi-drug resistance of isolates, as well the presence of genes plo, fimA, fimC, fimE, fimG, nanH, nanP, and cbpA in 41 T. pyogenes strains obtaned from bovine, goats, sheep, horses, and dog isolated among different clinical manifestations. T. pyogenes was identified predominantly in mastitis (46.3%), abscesses (19.5%), pneumonia (9.8%), metritis (9.8%), lymphadenitis (7.3%), followed by encephalitis (4.9%) and orchitis (2.4%). The strains showed major in vitro sensitivity to florfenicol (97.6%), azithromicin (97.6%), tetracycline (95.2%), ceftiofur (92.7%), penicillin (92.7%), ampicillin (92.7%), gentamicin (90.3%), and erythromycin (87.8%). In contrast, highest frequency of resistance among isolates was observed to bacitracin (46.3%), neomycin (31.7%), lincomycin (31.7%), and trimethropim/sulfamethoxazole (24.3%). Antimicrobial multiple resistance index - AMRI (>0.3) was found in 13 (31.7%) isolates, particularly in bovine mastitis cases. Among multi-drug resistant isolates to 3 or more group of antimicrobials, 12 (92.3%) were identified in bovine, predominantly in mammary infections. The most common genes detected among isolates were: plo (40/41=97.6%), fimA (36/41=87.9%), nanP (34/41=82.9%), fimE (32/41=78.0%), nanH (28/41=62.3%), fimC (23/41=56.0%), and cbpA (5/41=12.2%). The major associations between genes of isolates were plo, fimA, fimE, nanH, and nanP (10/41=24.4%), and plo, fimA, fimE, fimC, nanH, and nanP (8/41=19.5%), mainly in bovine mastitis. To ...

Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Kathryn J. Boor / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T23:53:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kabuki_DirceYorika_D.pdf: 1158257 bytes, checksum: e37465f074c6973fa67baa13e368f2fa (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os queijos frescais estilo Hispânico são alimentos de alto risco à contaminação por L. monocytogenes e já foram associados à pelo menos dois surtos de listeriose nos Estados Unidos da América. O conhecimento maior das fontes de contaminação por L. monocytogenes no processamento de queijos frescos tipo Hispânico é crítico para permitir o desenvolvimento de estratégias mais eficazes para o controle deste perigo. Neste trabalho, foi realizado um diagnóstico da contaminação por L. monocytogenes em três indústrias processadoras de queijos frescais tipo Hispânico, nos Estados Unidos. Um total de 246 amostras ambientais foi coletado e analisado para L. monocytogenes utilizando-se o método preconizado pela ¿Food and Drug Administration¿ (FDA) e o método ¿Biosynth L. monocytogenes detection system¿ (LMDS). As amostras de queijo, produzidos nestas indústrias (n=111), foram analisadas utilizando-se o método da FDA, modificado pela inclusão dos meios de cultura ¿L. monocytogenes plating medium¿ (LMPM) e ¿Listeria monocytogenes confirmatory plating medium¿ (LMCM) utilizados no método LMDS. L. monocytogenes foi detectada em 6,3% dos queijos e 11,0% das amostras ambientais. Dentre as amostras ambientais, aquelas obtidas de caixa vazada de plástico, dreno e piso apresentaram alta ocorrência de L. monocytogenes, com taxas de 55,6%, 30,0% e 20,6%, respectivamente. Apenas uma indústria apresentou resultados positivos em amostras de queijos e de superfícies que contatavam o alimento. O método da FDA mostrou maior sensibilidade do que o método LMDS para detecção de L. monocytogenes em amostras ambientais, e a inclusão dos meios LMPM e LMCM não melhorou a performance do método do FDA para detecção do patógeno em queijos. A subtipagem molecular, através da análise alélica dos genes de virulência actA e hly e da ribotipagem automatizada, foi utilizada para traçar a contaminação por L. monocytogenes nas indústrias. O ribotipo DUP-1044A, que havia sido previamente associado a surtos de listeriose humana em vários estados nos Estados Unidos em 1998, foi o subtipo mais comumente identificado (20/36 isolados) e foi isolado em 2 estabelecimentos. Este ribotipo se mostrou persistente e amplamente disseminado em uma das indústrias, onde foi também responsável pela contaminação do produto final. Nossa hipótese é que cepas deste ribotipo tenham habilidade específica em permanecer no ambiente de processamento. Apesar dos surtos de listeriose terem sido associados a queijos Hispânicos produzidos com leite não pasteurizado, os resultados obtidos neste trabalho revelam que a permanente contaminação ambiental pode representar outra fonte importante de contaminação do produto final / Abstract: Latin-style fresh cheeses, which have been linked to at least two human listeriosis outbreaks in the US, are considered to be high risk foods for Listeria monocytogenes contamination. We evaluated L. monocytogenes contamination patterns in three Latin-style fresh cheese processing plants to gain a better understanding of L. monocytogenes contamination sources in the manufacture of these cheeses. Over a 6-month period, 246 environmental samples were collected and analyzed for L. monocytogenes using both the Food and Drug Administration (FDA) method and the Biosynth L. monocytogenes detection system (LMDS). Finished cheese samples from the same plants (n=111) were also analyzed by the FDA method, which was modified to include L. monocytogenes plating medium (LMPM) and the L. monocytogenes confirmatory plating medium (LMCM) used in the LMDS method. L. monocytogenes was detected in 6.3% of cheese and 11.0% of environmental samples. Crates, drains and floor samples showed the highest contamination rates with 55.6%, 30.0% and 20.6% L. monocytogenes positive samples, respectively. Finished products and food contact surfaces were positive in only one plant. The FDA method showed a higher sensitivity than the LMDS method for detection of L. monocytogenes from environmental samples. The addition of LMPM and LMCM media did not further enhance the performance of the FDA method for L. monocytogenes detection from finished products. Molecular subtyping (PCR-based allelic analysis of the virulence genes actA and hly and automated ribotyping) was used to track contamination patterns. Ribotype DUP-1044A, which had previously been linked to a 1998 multistate human listeriosis outbreak in the US, was the most commonly identified subtype (20/36 isolates) and was isolated from two plants. This ribotype was persistent and widespread in one factory, where it was also responsible for the contamination of finished products. We hypothesize that this ribotype may represent a clonal group with a specific ability to persist in food processing environments. While previous listeriosis outbreaks were linked to Latin-style fresh cheeses made from unpasteurized milk, the presence of this organism in pasteurized cheese products illustrates that persistent environmental contamination also represents an important source of finished product contamination / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:59:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_Claudiade_M.pdf: 1002308 bytes, checksum: 1915c0cc8df2cd65fe9c6f087aaddd19 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Infecções por Escherichia coli são uma das maiores causas de diarréia em animais, entre eles os bezerros, sendo assim responsáveis por importantes danos econômicos na pecuária. Em nosso trabalho 58 E. coli originárias de bezerros com diarréia e 43 E. coli isoladas de bezerros sem diarréia, foram analisadas por ensaios de PCR (reação da polimerase em cadeia) quanto à presença dos genes para fatores de virulência eae, EAF, K99, F41, CS31A, F17, STa, LT-II, VT1, VT2, Hly, Ehly, CDT, CNF1, CNF2 e EAST1. Foram também realizados ensaios de citotoxicidade em células Vero para a expressão da Verotoxina (VT) e testes sorológicos para determinação dos sorogrupos. Os fatores de colonização (FC) foram detectados em 31 amostras, sendo 28 originárias de bezerros com diarréia e três amostras de bezerros sadios, onde 26 foram CS31A e onze F17, com seis delas apresentando CS31A/F17 associados. O gene eae esteve presente em 43 E. coli, sendo 35 isolados de animais com diarréia. Os FC K99, F41 e EAF não foram detectados. Quanto às toxinas pesquisadas, a mais freqüente foi a toxina VT1 presente em 43 E. coli, sendo 24 de origem de animais diarréico e 19 de bezerros sadios. Quarenta amostras foram EAST1, com 17 amostras foram isoladas de bezerros com diarréia, dez amostras foram VT2+ com seis delas isoladas de bezerros saudáveis. Oito amostras foram Ehly, seis CDT, quatro CNF2 e apenas duas LT-II. Nenhuma amostra foi positiva para Hly, STa e CNF1. A expressão fenotípica de VT e Ehly foram confirmadas em ensaios in vitro. Onze amostras foram negativas para todos os fatores de virulência pesquisados. Vinte amostras mostraram associação eae/VT1 e 13 foram CS31A/VT1. Foram detectados 35 sorogrupos entre as E. coli estudadas. A associação entre CS31A e VT1 não tinha sido descrita na literatura até o presente momento e a grande associação entre o gene eae e a toxina VT1 mostram que bezerros podem ser considerados como reservatórios de VTEC / Abstract: Infections caused by Escherichia coli are the most cause of diarrhea in animals, bovines and cattle, being thus responsible for important economic losses in farms. In this work, 58 strains isolated from calves with diarrhea and 43 strains isolated from healthy calves were studied for PCR analysis about the virulence factors eae, EAF, K99, F41, CS31A, F17, STa, LT-II, VT1, VT2, Hly, Ehly, CDT, CNF1, CNF2 and EAST1. We utilized techniques in vitro for the VT and Ehly production and serological assays for detecting serogroups. Of the studied strains, 31 of them were positive for colonization factors, being 28 isolated from diarrheic calves and five isolated from healthy calves, where 26 were CS31A+, eleven F17 and an association between CS31A/F17 was found in six strains from diarrheic calves. The eae gene was present in 43 strains, where 35 were isolated from calves with diarrhea and no E. coli were positive for the FC K99, F41 and EAF. About the toxin genes, the most frequent was VT1 in 43 strains, being 24 of diarrheic origin and 19 from healthy calves. Forty strains were EAST1, with of them 17 isolated from diarrheic calves, ten strains were VT2, being six isolated from healthy calves. Eight strains were Ehly, six CDT, four CNF2 and only two strains LT-II. Twenty E. coli showed association of eae/VT1 and 13 are CS31A/VT1 positive. No strains were positive for STa, Hly and CNF1. The production of VT and Ehly were positive in in vitro assays. Eleven strains were negative for all the genes probes. We detected 35 serogroups between E. coli studied. To our knowledge, this is the first description of an association between CS31A and VT1. The association between eae gene and VT1 toxin show that calves should be considered VTEC reservoir in Brazil for human infection / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Microbiologia

Orientador: Marcelo Palma Sircili / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T04:50:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franzin_FernandaMaria_D.pdf: 6490379 bytes, checksum: facd90d2115a20d8eccb498865503103 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) faz parte de um grupo de patógenos capazes de formar um tipo de lesão em células epiteliais denominada Attaching and Effacing (A/E). Os genes requeridos para a formação da lesão A/E estão localizados em uma ilha de patogenicidade denominada Locus of Enterocyte Effacement (LEE). A regulação da expressão dos genes de LEE é um processo complexo e envolve inúmeros fatores e vias regulatórias, incluindo o sistema de quorum sensing AI- 3/Epinefrina/Norepinefrina. O sensor histidina-quinase QseC é responsável por detectar AI-3 produzido por outras bactérias e epinefrina/norepinefrina produzidas pelo hospedeiro e iniciar uma cascata regulatória que induz a expressão de genes de virulência. Para avaliar o papel desse sistema na regulação de fatores de virulência de aEPEC, um mutante para o gene qseC foi gerado e analisado a nível transcricional e fenotípico quanto a sua motilidade, capacidade de secretar proteínas e induzir lesão A/E, na presença e/ou ausência do sinal epinefrina. Ensaios de qRT-PCR demonstraram níveis transcricionais diminuídos para LEE e para os genes flhD, fliC e nleA no mutante, sugerindo que QseC regula a expressão desses fatores de virulência. Ensaios de motilidade, proteínas secretadas e FAS evidenciaram que a motilidade, a secreção de proteínas e a formação da lesão A/E estavam diminuídas no mutante, comprovando a participação de QseC na regulação desses fenótipos em aEPEC. Os mesmos ensaios realizados na presença de epinefrina demonstraram que esse sinal tem papel importante na regulação dos genes de LEE de aEPEC e que essa regulação não ocorre exclusivamente via QseC, mas envolve outro receptor para esse hormônio. Epinefrina regula a expressão dos genes de LEE, porém, parece não ser um sinal importante na regulação da expressão de NleA e flagelo/motilidade. A análise do transcriptoma da linhagem mutante demonstrou que, além de ter uma importância central na regulação da virulência de aEPEC, QseC age também como um importante regulador global da expressão gênica nessa linhagem, regulando, direta ou indiretamente, a expressão de, aproximadamente, 1505 genes, entre eles genes relacionados ao metabolismo, transporte, quimiotaxia, captação de íons, resistência à stress, formação de biofilme, regulação transcricional, etc. Um modelo geral simplificado da regulação gênica da virulência de aEPEC através do sistema AI-3/Epi/NE e seu sensor QseC foi proposto. Esse trabalho descreve pela primeira vez a regulação do tipo quorum sensing na modulação da expressão da virulência em uma EPEC atípica / Abstract: Atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) is part of a group of pathogens capable of forming a characteristic lesion in epithelial cells called Attaching and Effacing (A/E). Genes required for A/E lesion formation are located on a pathogenicity island called Locus of Enterocyte Effacement (LEE). The regulation of LEE gene expression is a complex process and involves several factors and regulatory pathways, including the quorum sensing system AI-3/Epinephrine/Norepinephrine. The histidine kinase sensor QseC is responsible for detecting AI-3 produced by other bacteria and epinephrine/norepinephrine produced by the host, starting a regulatory cascade that induces the expression of virulence genes. In order to evaluate the influence of this system in the regulation of virulence factors of aEPEC, a qseC mutant has been generated, and transcriptional and phenotypical analyses were performed. Motility, ability to secrete proteins and induce A/E lesion, in the presence and/or absence of the epinephrine signal were analysed. qRT-PCR assays demonstrated reduced transcriptional levels of the LEE operons, and flhD, fliC and nleA genes in the mutant strain, suggesting that QseC regulates the expression of these virulence factors. Motility assays, secreted proteins and FAS have shown that motility, protein secretion and A/E lesion formation were decreased in the mutant, confirming the participation of QseC regulating these phenotypes in aEPEC. The same tests were performed in the presence of epinephrine, and demonstrated that this signal plays an important role in LEE gene regulation of aEPEC and this regulation does not occur exclusively via QseC, but involves other receptor for this hormone. Epinephrine regulates the expression of LEE genes, however, does not seem to be an important signal in the regulation of NleA and flagella/motility gene expression. Transcriptome analysis of the mutant strain has shown that, besides having a central role in the regulation of aEPEC virulence, QseC also acts as an important global regulator of gene expression in this strain, regulating, directly or indirectly, the expression of approximately 1505 genes, including genes related to metabolism, transport, chemotaxis, ion uptake, resistance to stress, biofilm formation, transcriptional regulation, and other. We proposed a simplified general model of virulence gene regulation of aEPEC through the AI-3/Epi/NE system and its sensor QseC. This is the first work describing the quorum sensing gene regulation modulating the virulence expression in atypical EPEC / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular