As operárias de abelhas sem ferrão são peculiares com relação à divisão do trabalho reprodutivo para a manutenção da colônia, visto que podem produzir ovos reprodutivos que originam os machos, além dos ovos tróficos destinados a alimentar a rainha. Desta forma, os estudos de expressão de genes e de proteínas envolvidos na biossíntese de vitelo vitelogênese - e incorporação deste material aos ovócitos contribuem para evidenciar diferenças intra e inter-específicas entre as fêmeas, em relação à fertilidade e comportamento reprodutivo. Os perfis de expressão do gene codificador da vitelogenina e da própria proteína, precursora da principal constituinte do vitelo, foram determinados para várias etapas do desenvolvimento de três espécies de abelhas sem ferrão. Para este estudo foram selecionadas as espécies Frieseomelitta varia, cujas operárias nunca põem ovos, mesmo em condições de orfandade, Scaptotrigona postica e Melipona scutellaris, cujas operárias desenvolvem os ovários e participam ativamente da produção de machos. O RNA total de corpo gorduroso sítio de biossíntese de vitelogenina de operárias destas espécies foi extraído e o cDNA obtido por transcrição reversa semiquantitativa foi amplificado, clonado e seqüenciado utilizando-se primers específicos para a vitelogenina de Apis mellifera. Os resultados revelaram que os cDNA parciais obtidos são bastante conservados entre F. varia, S. postica e M. scutellaris e mostram alta identidade (93-100%) em relação à região 3-terminal do cDNA da vitelogenina de A. mellifera. Entretanto, o perfil de abundância do transcrito difere entre as espécies de meliponíneos e entre estas e as abelhas melíferas. Em F. varia e S. postica a expressão do transcrito mostrou-se constitutiva ao longo dos períodos pupal e adulto, mas M. scutellaris mostrou diminuição da abundância de transcritos nas fases pupais mais avançadas e nas operárias recém-emergidas. Estas espécies diferem de A. mellifera cujas pupas não expressam o gene da vitelogenina. A expressão constitutiva deste gene em F. varia e S. postica mostra que a atividade do gene em questão não é modificada pela variação dos títulos de ecdisteróides e hormônio juvenil descrita para A. mellifera e outros insetos, indicando, portanto, ausência de controle da transcrição de vitelogenina por hormônios nas espécies de meliponíneos estudadas. No entanto, os resultados indicam a existência de controle nutricional da atividade do gene da vitelogenina, dado o aumento de expressão verificado em operárias F. varia alimentadas com dieta rica em proteínas (contendo pólen - a fonte de proteínas para as abelhas - e açúcar) em comparação com aquelas que receberam dieta exclusiva de carboidrato (açúcar). A presença da proteína vitelogenina na hemolinfa de F. varia ocorre concomitantemente com a expressão constitutiva do transcrito. Neste aspecto, difere de S. postica e M. scutellaris que também expressam o transcrito da vitelogenina ao longo do estágio pupal e adulto, mas a proteína correspondente somente é detectada nas operárias destas espécies que estão exercendo a função de nutridoras de crias. Pode-se concluir que o gene da vitelogenina é conservado entre as espécies de abelhas até aqui estudadas, porém sua expressão e possivelmente sua regulação diferem entre meliponíneos e abelhas melíferas, refletindo as diferentes estratégias utilizadas na divisão do trabalho reprodutivo. / The stingless bee workers are peculiar with relation to reproductive division of labor to colony maintenance, since they are able to produce reproductive eggs that will develop in males, beyond trophic eggs to feed the queen. In this way, studies about gene and protein expression involved on the yolk biosynthesis vitellogenesis and the incorporation of this material to the oocytes contributes to evidence intra and inter-specific differences between females, in relation to fertility and reproductive behavior. The vitellogenin, the main yolk constituent precursor, gene expression and the protein itself profile were determined to several developmental stages of three stinglessbee species. To this work were selected the species Frieseomelitta varia, whose workers never lay eggs, even in a queenless condition, Scaptotrigona postica and Melipona scutellaris, whose workers develop their ovaries and participate actively to male production. The whole RNA of the fat body the vitellogenin biosynthesis site - of these worker species was extracted and the cDNA obtained by semiquantitative reverse transcription amplified, cloned and sequenced through Apis mellifera vitellogenin specific primers. The results reveal that the obtained partial cDNAs are very conserved among F. varia, S. postica and M. scutellaris and show high identity (93-100%), in relation to 3-end A. mellifera vitellogenin gene. However, transcript abundance profile is different among stinglessbee species and with honeybees. In F. varia and S. postica the transcript expression is constitutive during pupal and adult periods, but M. scutellaris showed transcript reduction in the advanced pupal phases and newly emerged workers. These species are different from A. mellifera pupae that do not express vitellogenin gene. This constitutive gene expression in F. varia and S. postica shows that the gene activity is not modified by the ecdysteroid and juvenile hormone titers as descript to A. mellifera and other insects, indicating absence of vitellogenin transcriptional control by hormones in the studied stingless bee species. However, the results indicate the existence of vitellogenin gene activity nutritional control, given the verified expression increase in F. varia workers and drones fed with a rich protein diet (with pólen the protein bee source and sugar) in comparison with which ones received exclusive sugar diet. The presence of vitellogenin protein on the F. varia hemolimph occurs concomitantly with the constitutive transcript expression. In this aspect, is different of S. postica and M. scutellaris which also express the vitellogenin transcript during pupal and adult stages, but the correspondent protein is only detected on the workers of these species that are exerting nurse tasks. Is possible conclude that vitellogenin gene is conserved among the studied bee species, but its expression and possibly regulation are different among stingless bees and honey bees, reflecting different strategies used on reproductive division of labor.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-25T09:13:05Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 445950 bytes, checksum: 73de5cea3a11246ede4bfa07c39888ee (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-25T09:13:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 445950 bytes, checksum: 73de5cea3a11246ede4bfa07c39888ee (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A vitelogenina é uma lipoglicoproteína sintetizada no corpo gorduroso, liberada na hemolinfa e captada pelos ovócitos durante a vitelogênese. O receptor de vitelogenina (VgR) é responsável pela absorção da vitelogenina durante a formação dos ovos nos insetos. O ovócito em desenvolvimento é circundado pelo epitélio folicular e quando este começa a acumular vitelogenina são formados espaços intercelulares entre as células foliculares, fenômeno denominado como patência. Em algumas espécies de Hymenoptera, os folículos vitelogênicos possuem vitelogenina no citoplasma das células foliculares, indicando uma rota transcelular para o transporte de vitelogenina. Desta forma, este estudo verificou se há presença de VgR nas células foliculares dos ovários da abelha Apis mellifera e da vespa Polistes simillimus para testar se a vitelogenina é transportada pela rota transcelular nestes insetos. Um anticorpo anti-VgR específico foi produzido a partir de uma sequência altamente conservada desse receptor, esta foi expressa em E. coli transformadas (pET BL21), representada por um fragmento recombinante correspondente a segunda região repetitiva YWTD. As análises de Western Blotting confirma que o anticorpo produzido foi específico para VgR e que esta proteína esteve presente nos extratos de proteínas de membrana dos ovários de ambas espécies. As análises de imunofluorescência associadas á imunocitoquímica, evidenciaram a presença de VgR na membrana plasmática apical e basal das células foliculares em regiões vitelogênicas dos ovaríolos de A. mellifera e P. simillimus, indicando que a proteína VgR pode ter sido transportada de um domínio basal para o apical da célula com consequente liberação no espaço perivitelínico, evidenciado pela presença de figuras mielínicas contendo VgR nesta região. Estes dados suportaram a hipótese de que a vitelogenina foi transportada via receptor pela rota transcelular nas células foliculares de abelhas e vespas. / The vitellogenin is a lipoglycoprotein synthesized in the fat body, released to the hemolymph and absorbed by oocytes during vitellogenesis. The vitellogenin receptor (VgR) is responsible for the absorption of vitellogenin during egg formation in insects. The developing oocyte is surrounded by a follicular epithelium and during vitellogenin uptake are formed intercellular spaces between the follicular cells, a phenomenon termed as patency. In some Hymenoptera, vitellogenic follicles show vitellogenin in the cytoplasm of follicular cells suggesting a transcellular route of vitellogenin until oocyte surface. Thus, this study examined the possible presence of VgR in the follicular cells of honey bee Apis mellifera and wasp Polistes simillimus ovaries to verify whether vitellogenin is transported by the transcellular route in these insects. A specific anti-VgR antibody was produced from a highly conserved sequence of this receptor (fragment of the second repeat region YWTD), expressed in transformed E. coli (pET BL21). The Western blotting analysis confirmed that the antibody was specific for VgR and that this protein was present in membrane protein extracts from ovaries of both species. Immunofluorescence analyzes associated with immunocytochemistry showed VgR in the apical and basal plasma membrane of follicular cells of vitellogenic follicles of A. mellifera and P. simillimus. This study suggest that the protein may have been transported from basal to apical cell membrane domain with subsequent release in the perivitelline space, evidenced by the presence of myelin figures with VgR in this region. These data support the hypothesis that the vitellogenin was transported via receptor by the transcellular route in the follicular cells of bees and wasps.

As operárias de abelhas sem ferrão são peculiares com relação à divisão do trabalho reprodutivo para a manutenção da colônia, visto que podem produzir ovos reprodutivos que originam os machos, além dos ovos tróficos destinados a alimentar a rainha. Desta forma, os estudos de expressão de genes e de proteínas envolvidos na biossíntese de vitelo vitelogênese - e incorporação deste material aos ovócitos contribuem para evidenciar diferenças intra e inter-específicas entre as fêmeas, em relação à fertilidade e comportamento reprodutivo. Os perfis de expressão do gene codificador da vitelogenina e da própria proteína, precursora da principal constituinte do vitelo, foram determinados para várias etapas do desenvolvimento de três espécies de abelhas sem ferrão. Para este estudo foram selecionadas as espécies Frieseomelitta varia, cujas operárias nunca põem ovos, mesmo em condições de orfandade, Scaptotrigona postica e Melipona scutellaris, cujas operárias desenvolvem os ovários e participam ativamente da produção de machos. O RNA total de corpo gorduroso sítio de biossíntese de vitelogenina de operárias destas espécies foi extraído e o cDNA obtido por transcrição reversa semiquantitativa foi amplificado, clonado e seqüenciado utilizando-se primers específicos para a vitelogenina de Apis mellifera. Os resultados revelaram que os cDNA parciais obtidos são bastante conservados entre F. varia, S. postica e M. scutellaris e mostram alta identidade (93-100%) em relação à região 3-terminal do cDNA da vitelogenina de A. mellifera. Entretanto, o perfil de abundância do transcrito difere entre as espécies de meliponíneos e entre estas e as abelhas melíferas. Em F. varia e S. postica a expressão do transcrito mostrou-se constitutiva ao longo dos períodos pupal e adulto, mas M. scutellaris mostrou diminuição da abundância de transcritos nas fases pupais mais avançadas e nas operárias recém-emergidas. Estas espécies diferem de A. mellifera cujas pupas não expressam o gene da vitelogenina. A expressão constitutiva deste gene em F. varia e S. postica mostra que a atividade do gene em questão não é modificada pela variação dos títulos de ecdisteróides e hormônio juvenil descrita para A. mellifera e outros insetos, indicando, portanto, ausência de controle da transcrição de vitelogenina por hormônios nas espécies de meliponíneos estudadas. No entanto, os resultados indicam a existência de controle nutricional da atividade do gene da vitelogenina, dado o aumento de expressão verificado em operárias F. varia alimentadas com dieta rica em proteínas (contendo pólen - a fonte de proteínas para as abelhas - e açúcar) em comparação com aquelas que receberam dieta exclusiva de carboidrato (açúcar). A presença da proteína vitelogenina na hemolinfa de F. varia ocorre concomitantemente com a expressão constitutiva do transcrito. Neste aspecto, difere de S. postica e M. scutellaris que também expressam o transcrito da vitelogenina ao longo do estágio pupal e adulto, mas a proteína correspondente somente é detectada nas operárias destas espécies que estão exercendo a função de nutridoras de crias. Pode-se concluir que o gene da vitelogenina é conservado entre as espécies de abelhas até aqui estudadas, porém sua expressão e possivelmente sua regulação diferem entre meliponíneos e abelhas melíferas, refletindo as diferentes estratégias utilizadas na divisão do trabalho reprodutivo. / The stingless bee workers are peculiar with relation to reproductive division of labor to colony maintenance, since they are able to produce reproductive eggs that will develop in males, beyond trophic eggs to feed the queen. In this way, studies about gene and protein expression involved on the yolk biosynthesis vitellogenesis and the incorporation of this material to the oocytes contributes to evidence intra and inter-specific differences between females, in relation to fertility and reproductive behavior. The vitellogenin, the main yolk constituent precursor, gene expression and the protein itself profile were determined to several developmental stages of three stinglessbee species. To this work were selected the species Frieseomelitta varia, whose workers never lay eggs, even in a queenless condition, Scaptotrigona postica and Melipona scutellaris, whose workers develop their ovaries and participate actively to male production. The whole RNA of the fat body the vitellogenin biosynthesis site - of these worker species was extracted and the cDNA obtained by semiquantitative reverse transcription amplified, cloned and sequenced through Apis mellifera vitellogenin specific primers. The results reveal that the obtained partial cDNAs are very conserved among F. varia, S. postica and M. scutellaris and show high identity (93-100%), in relation to 3-end A. mellifera vitellogenin gene. However, transcript abundance profile is different among stinglessbee species and with honeybees. In F. varia and S. postica the transcript expression is constitutive during pupal and adult periods, but M. scutellaris showed transcript reduction in the advanced pupal phases and newly emerged workers. These species are different from A. mellifera pupae that do not express vitellogenin gene. This constitutive gene expression in F. varia and S. postica shows that the gene activity is not modified by the ecdysteroid and juvenile hormone titers as descript to A. mellifera and other insects, indicating absence of vitellogenin transcriptional control by hormones in the studied stingless bee species. However, the results indicate the existence of vitellogenin gene activity nutritional control, given the verified expression increase in F. varia workers and drones fed with a rich protein diet (with pólen the protein bee source and sugar) in comparison with which ones received exclusive sugar diet. The presence of vitellogenin protein on the F. varia hemolimph occurs concomitantly with the constitutive transcript expression. In this aspect, is different of S. postica and M. scutellaris which also express the vitellogenin transcript during pupal and adult stages, but the correspondent protein is only detected on the workers of these species that are exerting nurse tasks. Is possible conclude that vitellogenin gene is conserved among the studied bee species, but its expression and possibly regulation are different among stingless bees and honey bees, reflecting different strategies used on reproductive division of labor.

A desregulação endócrina induzida por contaminação ambiental está entre os principais problemas criados pela sociedade moderna de consumo, responsável pela inserção no ambiente de uma série de substâncias interferentes nos sistemas hormonais dos mais diversos organismos, incluindo o próprio homem. A ação destes compostos acarreta, entre outros efeitos, disfunções reprodutivas e estudos apontam que também podem ser indutores de cânceres. A legislação brasileira através do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) determina os padrões de qualidade das águas, porém muitas substâncias com potencial de desregulação endócrina não tem suas concentrações e emissões especificadas. O objetivo deste trabalho foi executar um levantamento da presença e possíveis conseqüências dos hormônios estrogênicos, uma das classes mais potentes de desreguladores endócrinos (ED), nos compartimentos água e sedimento do rio do Monjolinho. Este rio cruza parte da malha urbana da cidade de São Carlos - SP e recebe lançamentos localizados e difusos de esgotos domésticos e industriais. Portanto, amostras de água e sedimentos foram analisadas através de cromatografia líquida, e exemplares de peixes capturados no rio investigados quanto à presença da proteína vitelogenina (VTG) um biomarcador de exposição. Também ensaios ecotoxicológicos foram desenvolvidos em laboratório com diferentes abordagens para verificação de efeitos diversos. Em uma tentativa de abordar os dados gerados através de uma perspectiva ampla, foi delineada uma avaliação de risco ambiental discutindo as possíveis ameaças a biota e a população humana, já que concentrações de hormônios, principalmente o sintético etinilestradiol (concentração máxima de 30,1 ± 3,41 ng/L), a indução da VTG e efeitos em ensaios ecotoxicológicos foram confirmados. / The environmental endocrine disruption is among the main problems arrived with the modern society way of life. The hormonal systems of several organisms are injured by a number of chemicals disposal on hydric bodies in erroneous way. These compounds causes reproductive disturbs, and studies pointed it be cancer inductors. The Brazilian National Environmental Council (CONAMA) do not regulated standards for discharges and concentrations of these substances. This work aims to investigate the probable presence and effects of sexual estrogens hormones, one of the most powerful groups of endocrine disruptors (EDCs), at the Monjolinho river. This small urban river is placed in São Carlos; a town located in the São Paulo state, southwest Brazil, and receives concentrated and diffuse sewage effluents as industrials as domestics. Samples of water and sediments were analyzed by liquid chromatography, and male fishes captured were investigated to survey the vitellogenin protein (Vtg), a biomarker of exposition. To complement the study, ecotoxicological tests with different approaches were considered. Moreover an environmental risk analyze delineation was made because hormones concentrations, mainly the synthetic ethynilestradiol (EE2), VTG induction, and positive effects in ecotoxicity tests were found.

Neste trabalho caracterizamos o nematoide Panagrolaimus sp. linhagem CEW2, originalmente isolado em Monte Negro (RO), Brasil e mantido em nosso laboratório em culturas monoxênicas contendo Escherichia coli. CEW2 se mostrou um nematoide extremófilo capaz de sobreviver ao dessecamento em 10% de umidade relativa por pelo menos 48h. Essa resistência é mais evidente em larvas de primeiro estádio (L1) do que em adultos ou larvas dauer. Quando pré-incubados por 48h em 98% de umidade relativa a sua resistência ao dessecamento aumenta e pode chegar a uma sobrevivência de 86,25% dos indivíduos no caso de L1. Os animais dessecados se tornam também resistentes ao congelamento. Os indivíduos pré-incubados em 98% de umidade relativa tornam-se resistentes ao congelamento. O retorno à atividade após secagem ou congelamento ocorre de maneira diferente dependendo da concentração de NaCl no meio, sugerindo que eles sejam, além de anidrobiontes e criobiontes, sejam também osmobiontes. Um outro aspecto da fisiologia de CEW2 que também começamos a caracterizar é a composição de polipeptídeos das vitelinas de seus ovos. SDS-PAGE das proteínas presente em ovos de CEW2 apresentam 6 bandas principais coradas por Coomassie Blue (com Mr que variam de 85 a 125 kDa), 3 a mais do que aquelas detectadas nos outros dois nematoides cujas vitelinas foram caracterizadas, Caenorhabditis elegans e Oscheius tipulae. Quando comparamos as vitelinas destas três espécies notamos que CEW2 não possui a vitelina de 180 kDa (YP170A e B de C. elegans e VT1 de O. tipulae). Essa análise comparativa das vitelinas de nematoides nos permitiu propor um esquema para a origem das três bandas extras detectadas em CEW2. Não foi possível purificar as vitelinas de CEW2 usando o mesmo protocolo que desenvolvemos para as vitelinas de O. tipulae e C. elegans. Isso se deve a uma atividade proteolítica presente nos homogeneizados de vermes que co-purifica com as vitelinas e leva a sua degradação durante a armazenagem. As atividades proteolíticas presentes nesses homogeneizados foram caracterizados por zimografia e foi possível purificar uma das bandas que cremos ser uma protease digestiva de CEW2 e a responsável pela degradação das vitelinas purificadas. / In this work we characterize some survival and reproductive strategies of the nematode Panagrolaimus sp., strain CEW2. CEW2 was originally isolated in Monte Negro (RO), Brazil. CEW2 is currently maintained in monoxenic cultures with E. coli in our laboratory and has proved to be an extremophile that survives desiccation at 10% relative humidity for at least 48 hours. First instar larvae (L1) are more resistant to desiccation than adults or dauer larvae. When pre-incubated for 48 h at 98% relative humidity their resistance to desiccation increases and can reach a survival rate of 86,25 % with L1individuals. The dried animals also become resistant to freezing. Worms that were pre-incubated at 98% relative humidity become resistant to freezing in water at -20 °C. The return to activity upon drying or freezing occurs differently depending on the NaCl concentration in the medium, suggesting that CEW2 is an osmobiont in addition to its anidrobiotic and criobiotic behavior. We also began to characterize another aspect of CEW2 physiology; the polypeptide composition of the vitellins in their eggs. SDS-PAGE of the proteins present in CEW2 eggs show 6 major Coomassie Blue stained bands (Mr ranging from 85-125 kDa), three more than those detected in the vitellins of Caenorhabditis elegans and Oscheius tipulae. When we compare the vitellins of these three species we notice that CEW2 lacks the yolk proteins of 180 kDa (YP170A and B present in C. elegans and VT1 in O. tipulae). The comparative analysis of nematode vitellins allowed us to propose a model for the origin of the three extra bands detected in CEW2. We propose that in CEW2 the polypeptides that are ortologous to the 180 kDa polypeptides of C. elegans and O. tipulae, suffer a proteolytic cleavage similar to that occurring with the precursor of YP115 and 88 in C. elegans. It was not possible to purify the vitellins of CEW2 using the same protocol developed for the vitellins of O. tipulae and C. elegans. This is due to a proteolytic activity present in homogenized worms which co-purifies with the vitellins and leads to their degradation during the procedure. Proteolytic activities present in these homogenates were characterized by zymography and it was possible to purify one of the bands that we believe to be a digestive protease from CEW2 responsible for the degradation of purified vitellins.

Abelhas adultas produzem vitelogenina, a principal proteína da hemolinfa. Ela está envolvida na reprodução, comportamento, imunidade, longevidade e regulação da organização social. A interferência por RNA interference é a mais promissora ferramenta para estudos de função gênica, baseada na introdução de duplex de RNA (dsRNA) que induz a degradação de transcritos alvo-específicos. Injeção de dsRNA altera a transcrição de vitelogenina, mas evidências apontam que a ativação do sistema imune em abelhas seja um efeito colateral destaa manipulação. Desenvolvemos um método para o silenciamento do gene codificador de vitelogenina no desenvolvimento pós-embrionário, que minimiza os efeitos da manipulação, onde 0,5 ?g de dsRNA de vitelogenina (dsVg) ou de GFP (controle exógeno, dsGFP) foi oferecido na dieta natural de larvas de segundo estágio, as quais foram mantidas na colônia. Nosso enfoque principal foi a compreensão dos efeitos do silenciamento pós-transcricional de rainhas e operárias de A. mellifera, em especial na fase larval. Operárias adultas reconhecem larvas tratadas e as remove. Mantemos certa distância entre as células de cria que recebiam o tratamento e a remoção de larvas tratadas diminuiu consideravelmente. A expressão de transcritos de vitelogenina em indivíduos sem tratamento e tratados foi analisada no quinto estágio larval de ambas as castas, bem como em operárias adultas de 7 dias e rainhas recémnascidas, utilizando-se PCR em tempo real e a expressão do gene codificador de actina como controle endógeno. Em adultos, controles sem tratamento e dsGFP expressaram quantidades similares de transcritos de vitelogenina. Os grupos alimentados com dsVg tiveram expressão reduzida de vitelogenina, a saber: quinto estágio larval de operárias (91%) e de rainhas (71%), operárias de 7 dias (88%) e rainhas recém-nascidas (70%). O silenciamento da vitelogenina não afetou a morfologia dos adultos, mas sim a fisiologia de larvas de ambas as castas, como nos títulos de hormônio juvenil e concentração de proteínas circulantes na hemolinfa. Concluímos que a ingestão de dsRNA é um método não-invasivo que induz silenciamento gênico e, assim, uma ferramenta eficiente para estudos funcionais pós-genoma. Os mecanismos regulatórios do gene codificador de vitelogenina e seu papel na diferenciação de castas estão em discussão. / Adult bees produce vitellogenin (Vg), the main protein in hemolymph; it is involved in honey bee (Apis mellifera) reproduction, behavior, immunity, longevity and regulation of social organization. Genetic interference mediated by injection of double-stranded RNA (dsRNA) is a powerful tool for the analysis of gene function in Apis mellifera. Injection of dsRNA effectively alters vitellogenin transcription; however, evidence has been found of immune system activation in treated bees, which could be a collateral effect of treatment. Consequently, we developed a non-invasive protocol for disruption of the A. mellifera genes exemplified by vitellogenin mRNA silencing, to understand it, mainly, in the female larval context. Second instar larvae were treated as follows: the treatment group received 0,5 ?g of double-stranded vitellogenin RNA (dsVg) mixed with larval food deposited in the worker brood cells; control group 1 was left to develop without treatment, while control group 2 received dsGFP (Green Fluorescent Protein), as an exogenous control. Treated and control larvae were maintained in the colony until adult emergence. Workers recognized dsRNAtreated larvae and frequently removed them. To circumvent this problem we increased the distance between the treatment groups. Vg gene expression were determined for fifth instar larvae of both castes and for 7 day-old workers and newly-emerged queens, evaluated by quantitative real time PCR, using actin as an endogenous control. For adults, we found that controls, dsGFP- and non-treated bees expressed similar amounts of Vg transcripts. The dsVg-fed groups had significantly reduced Vg gene expression in fifth instar larvae of workers (91%) and queens (71%) and, also, in 7 day-old workers (88%) and newly-emerged queens (70%). Disruption of the Vg gene did not affect adults morphology but physiological larval traits of both castes, as juvenile hormone titre and protein concentration. We conclude that dsRNA ingestion is an effective non-invasive method for inducing knockdown and an efficient approach for post-genome functional studies. The regulatory mechanisms of vitellogenin gene and its rules during caste differentiation are discussed.

Neste trabalho caracterizamos o nematoide Panagrolaimus sp. linhagem CEW2, originalmente isolado em Monte Negro (RO), Brasil e mantido em nosso laboratório em culturas monoxênicas contendo Escherichia coli. CEW2 se mostrou um nematoide extremófilo capaz de sobreviver ao dessecamento em 10% de umidade relativa por pelo menos 48h. Essa resistência é mais evidente em larvas de primeiro estádio (L1) do que em adultos ou larvas dauer. Quando pré-incubados por 48h em 98% de umidade relativa a sua resistência ao dessecamento aumenta e pode chegar a uma sobrevivência de 86,25% dos indivíduos no caso de L1. Os animais dessecados se tornam também resistentes ao congelamento. Os indivíduos pré-incubados em 98% de umidade relativa tornam-se resistentes ao congelamento. O retorno à atividade após secagem ou congelamento ocorre de maneira diferente dependendo da concentração de NaCl no meio, sugerindo que eles sejam, além de anidrobiontes e criobiontes, sejam também osmobiontes. Um outro aspecto da fisiologia de CEW2 que também começamos a caracterizar é a composição de polipeptídeos das vitelinas de seus ovos. SDS-PAGE das proteínas presente em ovos de CEW2 apresentam 6 bandas principais coradas por Coomassie Blue (com Mr que variam de 85 a 125 kDa), 3 a mais do que aquelas detectadas nos outros dois nematoides cujas vitelinas foram caracterizadas, Caenorhabditis elegans e Oscheius tipulae. Quando comparamos as vitelinas destas três espécies notamos que CEW2 não possui a vitelina de 180 kDa (YP170A e B de C. elegans e VT1 de O. tipulae). Essa análise comparativa das vitelinas de nematoides nos permitiu propor um esquema para a origem das três bandas extras detectadas em CEW2. Não foi possível purificar as vitelinas de CEW2 usando o mesmo protocolo que desenvolvemos para as vitelinas de O. tipulae e C. elegans. Isso se deve a uma atividade proteolítica presente nos homogeneizados de vermes que co-purifica com as vitelinas e leva a sua degradação durante a armazenagem. As atividades proteolíticas presentes nesses homogeneizados foram caracterizados por zimografia e foi possível purificar uma das bandas que cremos ser uma protease digestiva de CEW2 e a responsável pela degradação das vitelinas purificadas. / In this work we characterize some survival and reproductive strategies of the nematode Panagrolaimus sp., strain CEW2. CEW2 was originally isolated in Monte Negro (RO), Brazil. CEW2 is currently maintained in monoxenic cultures with E. coli in our laboratory and has proved to be an extremophile that survives desiccation at 10% relative humidity for at least 48 hours. First instar larvae (L1) are more resistant to desiccation than adults or dauer larvae. When pre-incubated for 48 h at 98% relative humidity their resistance to desiccation increases and can reach a survival rate of 86,25 % with L1individuals. The dried animals also become resistant to freezing. Worms that were pre-incubated at 98% relative humidity become resistant to freezing in water at -20 °C. The return to activity upon drying or freezing occurs differently depending on the NaCl concentration in the medium, suggesting that CEW2 is an osmobiont in addition to its anidrobiotic and criobiotic behavior. We also began to characterize another aspect of CEW2 physiology; the polypeptide composition of the vitellins in their eggs. SDS-PAGE of the proteins present in CEW2 eggs show 6 major Coomassie Blue stained bands (Mr ranging from 85-125 kDa), three more than those detected in the vitellins of Caenorhabditis elegans and Oscheius tipulae. When we compare the vitellins of these three species we notice that CEW2 lacks the yolk proteins of 180 kDa (YP170A and B present in C. elegans and VT1 in O. tipulae). The comparative analysis of nematode vitellins allowed us to propose a model for the origin of the three extra bands detected in CEW2. We propose that in CEW2 the polypeptides that are ortologous to the 180 kDa polypeptides of C. elegans and O. tipulae, suffer a proteolytic cleavage similar to that occurring with the precursor of YP115 and 88 in C. elegans. It was not possible to purify the vitellins of CEW2 using the same protocol developed for the vitellins of O. tipulae and C. elegans. This is due to a proteolytic activity present in homogenized worms which co-purifies with the vitellins and leads to their degradation during the procedure. Proteolytic activities present in these homogenates were characterized by zymography and it was possible to purify one of the bands that we believe to be a digestive protease from CEW2 responsible for the degradation of purified vitellins.

Abelhas adultas produzem vitelogenina, a principal proteína da hemolinfa. Ela está envolvida na reprodução, comportamento, imunidade, longevidade e regulação da organização social. A interferência por RNA interference é a mais promissora ferramenta para estudos de função gênica, baseada na introdução de duplex de RNA (dsRNA) que induz a degradação de transcritos alvo-específicos. Injeção de dsRNA altera a transcrição de vitelogenina, mas evidências apontam que a ativação do sistema imune em abelhas seja um efeito colateral destaa manipulação. Desenvolvemos um método para o silenciamento do gene codificador de vitelogenina no desenvolvimento pós-embrionário, que minimiza os efeitos da manipulação, onde 0,5 ?g de dsRNA de vitelogenina (dsVg) ou de GFP (controle exógeno, dsGFP) foi oferecido na dieta natural de larvas de segundo estágio, as quais foram mantidas na colônia. Nosso enfoque principal foi a compreensão dos efeitos do silenciamento pós-transcricional de rainhas e operárias de A. mellifera, em especial na fase larval. Operárias adultas reconhecem larvas tratadas e as remove. Mantemos certa distância entre as células de cria que recebiam o tratamento e a remoção de larvas tratadas diminuiu consideravelmente. A expressão de transcritos de vitelogenina em indivíduos sem tratamento e tratados foi analisada no quinto estágio larval de ambas as castas, bem como em operárias adultas de 7 dias e rainhas recémnascidas, utilizando-se PCR em tempo real e a expressão do gene codificador de actina como controle endógeno. Em adultos, controles sem tratamento e dsGFP expressaram quantidades similares de transcritos de vitelogenina. Os grupos alimentados com dsVg tiveram expressão reduzida de vitelogenina, a saber: quinto estágio larval de operárias (91%) e de rainhas (71%), operárias de 7 dias (88%) e rainhas recém-nascidas (70%). O silenciamento da vitelogenina não afetou a morfologia dos adultos, mas sim a fisiologia de larvas de ambas as castas, como nos títulos de hormônio juvenil e concentração de proteínas circulantes na hemolinfa. Concluímos que a ingestão de dsRNA é um método não-invasivo que induz silenciamento gênico e, assim, uma ferramenta eficiente para estudos funcionais pós-genoma. Os mecanismos regulatórios do gene codificador de vitelogenina e seu papel na diferenciação de castas estão em discussão. / Adult bees produce vitellogenin (Vg), the main protein in hemolymph; it is involved in honey bee (Apis mellifera) reproduction, behavior, immunity, longevity and regulation of social organization. Genetic interference mediated by injection of double-stranded RNA (dsRNA) is a powerful tool for the analysis of gene function in Apis mellifera. Injection of dsRNA effectively alters vitellogenin transcription; however, evidence has been found of immune system activation in treated bees, which could be a collateral effect of treatment. Consequently, we developed a non-invasive protocol for disruption of the A. mellifera genes exemplified by vitellogenin mRNA silencing, to understand it, mainly, in the female larval context. Second instar larvae were treated as follows: the treatment group received 0,5 ?g of double-stranded vitellogenin RNA (dsVg) mixed with larval food deposited in the worker brood cells; control group 1 was left to develop without treatment, while control group 2 received dsGFP (Green Fluorescent Protein), as an exogenous control. Treated and control larvae were maintained in the colony until adult emergence. Workers recognized dsRNAtreated larvae and frequently removed them. To circumvent this problem we increased the distance between the treatment groups. Vg gene expression were determined for fifth instar larvae of both castes and for 7 day-old workers and newly-emerged queens, evaluated by quantitative real time PCR, using actin as an endogenous control. For adults, we found that controls, dsGFP- and non-treated bees expressed similar amounts of Vg transcripts. The dsVg-fed groups had significantly reduced Vg gene expression in fifth instar larvae of workers (91%) and queens (71%) and, also, in 7 day-old workers (88%) and newly-emerged queens (70%). Disruption of the Vg gene did not affect adults morphology but physiological larval traits of both castes, as juvenile hormone titre and protein concentration. We conclude that dsRNA ingestion is an effective non-invasive method for inducing knockdown and an efficient approach for post-genome functional studies. The regulatory mechanisms of vitellogenin gene and its rules during caste differentiation are discussed.

A desregulação endócrina induzida por contaminação ambiental está entre os principais problemas criados pela sociedade moderna de consumo, responsável pela inserção no ambiente de uma série de substâncias interferentes nos sistemas hormonais dos mais diversos organismos, incluindo o próprio homem. A ação destes compostos acarreta, entre outros efeitos, disfunções reprodutivas e estudos apontam que também podem ser indutores de cânceres. A legislação brasileira através do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) determina os padrões de qualidade das águas, porém muitas substâncias com potencial de desregulação endócrina não tem suas concentrações e emissões especificadas. O objetivo deste trabalho foi executar um levantamento da presença e possíveis conseqüências dos hormônios estrogênicos, uma das classes mais potentes de desreguladores endócrinos (ED), nos compartimentos água e sedimento do rio do Monjolinho. Este rio cruza parte da malha urbana da cidade de São Carlos - SP e recebe lançamentos localizados e difusos de esgotos domésticos e industriais. Portanto, amostras de água e sedimentos foram analisadas através de cromatografia líquida, e exemplares de peixes capturados no rio investigados quanto à presença da proteína vitelogenina (VTG) um biomarcador de exposição. Também ensaios ecotoxicológicos foram desenvolvidos em laboratório com diferentes abordagens para verificação de efeitos diversos. Em uma tentativa de abordar os dados gerados através de uma perspectiva ampla, foi delineada uma avaliação de risco ambiental discutindo as possíveis ameaças a biota e a população humana, já que concentrações de hormônios, principalmente o sintético etinilestradiol (concentração máxima de 30,1 ± 3,41 ng/L), a indução da VTG e efeitos em ensaios ecotoxicológicos foram confirmados. / The environmental endocrine disruption is among the main problems arrived with the modern society way of life. The hormonal systems of several organisms are injured by a number of chemicals disposal on hydric bodies in erroneous way. These compounds causes reproductive disturbs, and studies pointed it be cancer inductors. The Brazilian National Environmental Council (CONAMA) do not regulated standards for discharges and concentrations of these substances. This work aims to investigate the probable presence and effects of sexual estrogens hormones, one of the most powerful groups of endocrine disruptors (EDCs), at the Monjolinho river. This small urban river is placed in São Carlos; a town located in the São Paulo state, southwest Brazil, and receives concentrated and diffuse sewage effluents as industrials as domestics. Samples of water and sediments were analyzed by liquid chromatography, and male fishes captured were investigated to survey the vitellogenin protein (Vtg), a biomarker of exposition. To complement the study, ecotoxicological tests with different approaches were considered. Moreover an environmental risk analyze delineation was made because hormones concentrations, mainly the synthetic ethynilestradiol (EE2), VTG induction, and positive effects in ecotoxicity tests were found.

Como em outros mosquitos, os trofócitos do corpo gorduroso de Cx. quinquefasciatus sintetizam vitelogenina (Vg), principal proteína armazenada pelo ovócito, formada por duas subunidades de 200 e 86 kDa. A ultraestrutura dos trofócitos revela o rápido desenvolvimento da maquinaria biossintética após a alimentação com sangue (aa) e a consecutiva degradação após as 48 h aa. Antes do repasto (AR), um conjunto de células indiferenciadas, limitado pelo epitélio folicular, conforma os folículos ovarianos. Após AR, o ovócito se destaca pelo acúmulo de lipídeos e Vg. O receptor de vitelogenina é encontrado somente nos ovários e análise por PCR em tempos mostrou aumento dos transcritos nos primeiros cinco dias após emersão e nas primeiras 48 h aa, durante a vitelogênese. O perfil transcricional de Vg mostrou um pico no terceiro dia de vida adulta e ao final do processo ovogênico / As in other mosquitoes, fat body trophocytes of Cx. quinquefasciatus synthesize vitellogenin (Vg), the major yolk protein stored by the oocyte, formed by two subunits of 200 and 86 kDa. The trophocytes ultrastructure reveals the rapid development of the biosynthetic machinery and the consecutive degradation around 48 h post blood meal (PBM). Before blood meal, a set of undifferentiated cells limited by follicular epithelium, conform the ovarian follicles. After blood meal, the oocyte is remarkable by accumulation of lipid inclusions and yolk granules. Vitellogenin receptors (rVitCx), are localized exclusively in the ovaries and real time PCR showed transcripts increase at the first five days after emergence (AE), and at the first 48 h PBM, during oogenesis. Vg transcripts profile showed a peak on the third day AE and at the end of the vitellogenic process