Bakterielle Infektionen aktivieren den Transkriptionsfaktor NF-κB. Dies trägt sowohl zur Immunantwort, als auch zum Überleben der Wirtszellen bei. In Infektionen mit dem Bakterium Helicobacter pylori stellt diese doppelte Funktion einen mechanistischen Link zwischen der chronischen Entzündung und der Krebsentstehung dar. Für das intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila ist das Überleben der Wirtszelle notwendig für die Vermehrung. Bisher sind jedoch bei beiden Infektionen die Signalwege, die zur NF-κB-Aktivierung führen, nicht ausreichend untersucht. Um NF-κB analysieren zu können, wurden hier monoklonale Zelllinien hergestellt, die ein Fusionsprotein der NF-κB-Untereinheit p65 mit GFP stabil exprimieren. Die Kerntranslokation von p65-GFP kann mit Fluoreszenz-Mikroskopie visualisiert und mit automatischer Bildanalyse quantifiziert werden. Mit dieser Methode konnte zum ersten Mal eine durch ein Bakterium induzierte Oszillation von p65-GFP gezeigt werden. In einem RNAi-basierten Hochdurchsatzscreen wurde diese Methode eingesetzt um neue Faktoren im NF-κB-Signalweg zu identifizieren. Dabei wurde die Infektion mit H. pylori mit den Induktoren TNFα und IL-1β verglichen. Insgesamt wurden 24 Regulatoren identifiziert. Die Identifikation dieser Faktoren vertieft nicht nur unser Verständnis des NF-κB-Signalweges, sondern bietet auch neue molekulare Ziele für mögliche zukünftige Therapien. Bei der detaillierten Analyse der L. pneumophila-induzierten NF-κB-Aktivierung konnte ein einzigartiger, zwei-phasiger Ablauf gezeigt werden. Zunächst verursachte bakterielles Flagellin eine starke, aber kurze Aktivierung. Später war p65 dauerhaft über Stunden im Kern lokalisiert, was eng an die Replikation der Bakterien gekoppelt war. Da die kontinuierliche Kernlokalisation für Transkriptionsfaktoren der NF-κB Familie sehr ungewöhnlich ist, könnte dies ein Hinweis für eine Manipulation durch das Bakterium sein, um das Überleben der Wirtszelle zu sichern. / Infection with pathogens leads to activation of the transcription factor NF-κB. This contributes both to the immune response as well as survival of host cells. In infection with the bacterium Helicobacter pylori, this dual function provides a mechanistic link between the chronic inflammation and cancer development. In infection with the intracellular pathogen Legionella pneumophila, the survival oft he host cell is necessary for replication. However, in both infections, the signaling pathways leading to NF-κB activation are not well understood. Here, in order to investigate NF-κB activation, monoclonal cell lines were generated that stably express the NF-κB subunit p65 fused to GFP. Nuclear translocation of p65-GFP can be visualized by fluorescence microscopy and quantified by software-based picture analysis. Using this technology, oscillations of p65-GFP nuclear translocation could be shown after H. pylori infection. To identify new factors important for NF-κB activation, the new assay was used to conduct an RNAi-based screen. In the screen, infection with H. pylori was compared to induction with the cytokines TNFα and IL-1β. In total, 24 key regulators for NF-κB were identified. The identification of these factors broadens our understanding of NF-κB signaling and could provide targets for future therapies. Finally, detailed observation of NF-κB activation induced by L. pneumophila in single cells revealed a unique, biphasic NF-κB activation. During the first hours, bacterial flagellin induced strong but transient activation. Then, p65 translocated continuously to the nucleus over hours without oscillation. Testing an array of bacterial mutants, a tight link between bacterial replication and continuous NF-κB activation could be shown. Because this continuous nuclear localization is very unusual for a transcription factor of the NF-κB family, this indicates that L. pneumophila could manipulate NF-κB to ensure host cell survival.

Das Typ III Sekretionssystem (T3SS) ist ein Proteinkomplex den Gramnegative Bakterien nutzen um in einem Schritt Effektorproteine (Effektoren) aus dem Zytosol über die Doppelmembran zu sekretieren. Für viele Bakterien ist das T3SS ein essenzieller Virulenzfaktor, der es ihnen erlaubt mit ihrem Wirt zu interagieren und diesen zu manipulieren. Charakteristisch für das T3SS ist die strukturelle Komponente, der Nadelkomplex. Dieser ähnelt strukturell einer Spritze, deren Basalkörper die bakteriellen Membranen und das Periplasma durchspannt und einer Nadel, die vom Basalkörper aus dem Bakterium ragt. Basierend auf dem Modell einer Spritze wird angenommen, dass Effektoren entfaltet und anschließend durch Basalkörper und Nadelkanal sekretiert werden. Trotz der kontinuierlichen Forschung an T3SS entbehrt dieses Modell einer experimentellen Grundlage und der Mechanismus ist nicht vollständig erklärt. Ziel der Arbeit war es, eine experimentelle Basis für den Sekretionsmechanismus des T3SS zu schaffen. Um zu verstehen, wie das T3SS Effektoren sekretiert, wurden zunächst Fusionsproteine konstruiert, welche aus einem Effektor und einem stabil gefalteten Knotenprotein bestehen. Aufgrund des Knotens in der Fusion ist davon auszugehen, dass dieser während der Sekretion nicht entfalten kann. Die Effektordomäne wird sekretiert während der Knoten im Kanal verbleibt und diesen verstopft. Nach unseremWissen ist diese Arbeit die erste Visualisierung von Effektorfusionen an isolierten Nadelkomplexen. Die Effektorfusion wird N-terminal voran durch den Kanal sekretiert, wobei der Kanal das Substrat umschließt und gegen Proteasen und chemische Modifikationen abschirmt. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern eine Grundidee der Funktionsweise des T3SS und liefern eine vielversprechende Strategie für in situ-Strukturanalysen. Dieser Ansatz lässt sich auch auf andere Proteinsekretionssysteme übertragen, bei welchen Substrate vor dem Transport entfaltet werden müssen. / The Type III Secretion System (T3SS) is a complex used by Gram-negative bacteria to secrete effector proteins from the cytoplasm across the bacterial envelope in a single step. For many pathogens, the T3SS is an essential virulence factor that enables the bacteria to interact with and manipulate their respective host. A characteristic structural feature of the T3SS is the needle complex (NC). The NC resembles a syringe with a basal body spanning both bacterial membranes and a long needle-like structure that protrudes from the bacterium. Based on the paradigm of a syringe-like mechanism, it is generally assumed that effectors are unfolded and secreted from the bacterial cytoplasm through the basal body and needle channel. Despite extensive research on T3SS, this hypothesis lacks experimental evidence and the mechanism of secretion is not fully understood. This work aimed to provide an experimental basis for the model of the T3SS mechanism. In order to elucidate details of the effector secretion mechanism, fusion proteins consisting of an effector and a bulky protein containing a knotted motif were generated. It is assumed that the knot cannot be unfolded during secretion of the chimera. Consequently, these fusions are accepted as T3SS substrates but remain inside the NC channel and obstruct the T3SS. This is, to our best knowledge, the first time effector fusions have been visualized together with isolated NCs and it demonstrates that effector proteins are secreted directly through the channel with their N-terminus first. The channel encloses the substrate and shields it from a protease and chemical modifications. These results corroborate an elementary understanding of how the T3SS works and provide a powerful tool for in situ-structural investigations. This approach might also be applicable to other protein secretion systems that require unfolding of their substrates prior to secretion.

Das humane Magenpathogen Helicobacter pylori (H. pylori) besiedelt den menschlichen Magen und kann zu der Entstehung schwerwiegender Krankheiten wie Magenkrebs und Magengeschwüren führen. Die Pathogenese ist eng mit dem bakteriellen Typ IV Sekretionssystems (T4SS) assoziiert, das die Translokation des Effektorproteins CagA in die Wirtszelle vermittelt. Bisher ist noch unbekannt, in welchem Ausmaß wirtszellspezifische Faktoren die T4SS induzierte Pathogenese beeinflussen. Dieser Aspekt wurde in dieser Arbeit durch die Analyse verschiedenster Zelllinien das erste Mal systematisch untersucht. Interessanterweise unterschied sich die zelluläre Antwort auf die T4SS spezifische Infektion erheblich in Abhängigkeit der verwendeten Zelllinie. Die Ergebnisse beweisen, dass Wirtszellfaktoren eine ebenso große Rolle in der H. pylori induzierten Pathogenese spielen wie bakterielle Effektoren. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit eine genomweite Screening-Methode etabliert, die es ermöglicht, neue Komponenten des T4SSs, translozierte NF-B Effektoren und bakterielle Adhäsine zu identifizieren. Auch der Einfluss von CagA auf den EGF-Rezeptor wurde hier näher untersucht. Der Rezeptor steht ebenfalls eng mit der Entstehung von Krebs in Verbindung. Hierbei stellte sich heraus, dass CagA die Endozytose des EGF-Rezeptors durch die Aktivierung der Nicht-Rezeptor Tyrosinkinase c-Abl hemmt und dadurch die Rezeptorpopulation auf der Wirtszelloberfläche erhöht. Interessanterweise führt dieser Effekt jedoch nicht zu einer Verstärkung der EGF-Rezeptor Signaltransduktion. Vielmehr kommt es zu einer Hemmung der EGF-Rezeptor Transaktivierung und zu einer Blockade der EGF vermittelten Wundheilung. Die Daten weisen auf eine Rolle des EGF-Rezeptors in der H. pylori induzierten Geschwürbildung hin. Auch der zu Grunde liegende molekulare Mechanismus der Rezeptor-Inhibierung konnte hier entschlüsselt werden, der sowohl von CagA als auch von der Phosphatase SHP-2 gesteuert wird. / The human gastric pathogen Helicobacter pylori (H. pylori) elicits a tremendous medical burden because of its causative association with peptic ulcer disease and gastric cancer. The pathogenic potential of H. pylori is intricately linked to the expression of a pathogenicity island encoded type IV secretion system (T4SS), which translocates the bacterial effector protein CagA into the eukaryotic host cell. The role of host cell determinants in T4SS mediated pathogenesis has not yet been systematically examined. To elucidate the role of host cell factors within T4SS induced host cell responses, different eukaryotic cell lines were analyzed systematically for respective phenotypes. Remarkably, T4SS mediated host responses among these cell lines varied considerably, thereby demonstrating the importance of host cell components in H. pylori induced pathogenesis. In addition, a H. pylori genome wide bacterial screen for factors important in pathogenesis, such as unknown T4SS components or novel NF-kappaB effector molecules, was developed and optimized. The precise function of the prominent effector protein CagA remains unclear. To functionally characterize the role of CagA, its impact on the epidermal growth factor (EGF)-receptor pathway was analyzed. The results suggest a mechanism where EGF-receptor endocytosis is completely blocked by a CagA induced activation of c-Abl, leading to an elevated receptor surface exposition. Surprisingly, EGF-receptor transactivation and EGF-dependent wound healing are selectively blocked during prolonged infections as well, indicating that an increased receptor-population on the cell surface does not necessarily promote signaling. This data suggests a role for the EGF-receptor in H. pylori- induced ulcer disease. The underlying molecular mechanism was identified as being SHP-2 and CagA dependent.

Die genomische Insel (GI) FhaGI 1 des Stammes Francisella hispaniensis (Fhis) AS02 814 kann sowohl in die tRNAVal integriert als auch als episomale Form vorliegen und kodiert für einen putativen Prophagen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Verwendung synthetisch hergestellter, verkürzter Varianten von FhaGI-1 gezeigt werden, dass die GI auf andere Francisella Spezies übertragbar ist. Die ortsspezifische Integration und Exzision der GI sind Integrase-abhängige Prozesse, die durch weitere regulatorische Gene beeinflusst werden. Die Identifizierung der GI FphGI 1 in drei F. philomiragia-Stämmen zeigt, dass die tRNAVal als Integrationsort für GIs in Francisella dient. Die vermutlich nicht funktionale Integrase von FphGI 1 ist wahrscheinlich die Ursache für das Fehlen einer episomalen Form der GI. Das Vorhandensein von GIs in Francisella liefert einen Hinweis darauf, dass horizontaler Gentransfer zwischen verschiedenen Francisella Spezies möglich ist. Auf Grundlage von FhaGI 1 wurden zwei Varianten eines Francisella- Phagenintegrationsvektors (pFIV1-Val und pFIV2 Val) generiert. Der FIV Teil der Vektoren bildet eine zirkuläre, episomale Form, die nach der Transformation in verschiedene Francisella Spezies ortspezifisch in die tRNAVal integriert. Es konnte gezeigt werden, dass die Vektoren für die Expression von Reportergenen sowie die Komplementation von Francisella Deletionsmutanten geeignet sind. Sie sind sowohl in vitro als auch während der Infektion von Wirtszellen ohne Selektionsdruck stabil und zählen zu den low-copy-Vektoren. Damit erweitern die FIV-Vektoren das Repertoire der vorhandenen Werkzeuge zur genetischen Manipulation von Francisellen. Da der Stamm Fhis AS02 814 für Untersuchungen nicht zur Verfügung stand, wurde FhaGI 1 synthetisch in zwei Hälften hergestellt, die jedoch bisher nicht zusammengeführt werden konnten. Damit ist eine Aussage darüber, ob es sich bei FhaGI 1 tatsächlich um einen funktionalen Prophagen handelt, bis jetzt nicht möglich / The genomic island (GI) FhaGI 1 of strain Francisella hispaniensis (Fhis) AS02 814 can exist as a circular episomal form or integrated into the tRNAVal gene and codes for a putative prophage. In this work small-sized variants of FhaGI 1 were used to show that the GI can be transferred to other Francisella species. The site-specific integration and excision of the GI are integrase-dependent processes that are influenced by further regulatory genes. The identification of the GI FphGI 1 in three F. philomiragia strains shows that the tRNAVal gene serves as an integration site for GIs in Francisella. The integrase of FphGI 1 is probably non-functional and hence presumably the reason for the missing episomal form of the GI. The presence of GIs in Francisella might be an indication that horizontal gene transfer between different Francisella species could be possible. Two variants of a Francisella phage integration vector (pFIV1 Val and pFIV2 Val) were successfully constructed based on FhaGI 1. The FIV Val part of the vectors integrates site-specifically into the tRNAVal after transformation into different Francisella species. It was demonstrated that the vectors can be used for the expression of reporter genes as well as for the complementation of Francisella deletion mutants. They remain stable without selective pressure during in vitro growth and during the infection of host cells and fall into the group of low-copy-vectors. The FIV Val vectors expand the repertoire of tools that can be used for the genetic manipulation of Francisella. As strain Fhis AS02 814 could not be obtained for further analysis, FhaGI 1 was synthetically generated in two halves which could not be joined so far. Consequently, it is not possible to state whether FhaGI 1 actually codes for a functional prophage.