ECF (Energy-Coupling Factor)-Transporter sind prokaryotische Aufnahmesysteme für Mikronährstoffe, die eine spezielle Gruppe von Transportern mit ATP-Bindekassette (ABC) darstellen. Sie beinhalten zwei asymmetrische Membranproteine, von denen eins (S) für die spezifische Bindung und Translokation des Substrates und das andere (T) für die Kopplung mit den ATPasen (A1,A2) zuständig ist. Bei ECF-Transportern der Subklasse I bilden diese Komponenten eine Einheit, während bei Vertretern der Subklasse II ein AAT-Modul mit wechselnden S-Einheiten interagiert. In der vorliegenden Arbeit wurde der Transportmechanismus, der eine Drehung der kompletten S-Einheit in der Membran beinhaltet, anhand des Biotintransporters BioMNY erstmals experimentell validiert. Durch Rekonstitution in Lipid-Nanodiscs, chemische Quervernetzung, fluoreszenz- und ESR-spektroskopische Techniken sowie einen Bindungstest mit radioaktivem Biotin wurde gezeigt, dass (i) die ATP-Bindung an die ATPasen zu einer Aufrichtung der S-Einheit (BioY) führt, (ii) diese Bewegung die Substratbeladung ermöglicht und (iii) BioY dabei ununterbrochen mit der T-Einheit (BioN) interagiert. Dies stellt einen Gegensatz zu Systemen der Subklasse II dar, für die ein ATP-abhängiger Austausch von S-Einheiten im Transportzyklus gezeigt worden war. Darüber hinaus wurde ein Escherichia coli-Stamm konstruiert, der durch Blockierung seines hochaffinen Biotintransporters und des -synthesewegs auf Spuren von Biotin nicht wachsen kann. Dieser Stamm ermöglichte einen eindeutigen Nachweis der Transportaktivität einiger solitärer BioY-Proteine. Aufgrund der einheitlichen Topologie von S-Einheiten ist ein Kippen auch für solitäre BioY-Varianten wahrscheinlich. Auch die metallspezifischen S-Einheiten CbiM und NikM besitzen ohne AAT-Modul eine basale Co2+- bzw. Ni2+-Transportaktivität. Ein ESR-spektroskopischer Kobaltnachweises zeigte, dass die aus nur zwei Membranhelices bestehende CbiN-Einheit für die Metallbeladung von CbiM essentiell ist. / ECF (Energy-Coupling Factor) transporters are a subgroup of ABC transporters that mediate uptake of micronutrients into prokaryotic cells. In contrast to canonical ABC importers, ECF transporters comprise two unrelated membrane proteins, one of which is responsible for specific and high affinity substrate binding (S) and the other one constitutes the coupling component (T) between S and the cytosolic ABC-ATPases (A1,A2). Subclass I transporters consist of four dedicated components whereas in subclass II transporters, a central AAT-module may interact with various S units. The biotin specific subclass I ECF transporter BioMNY was used to experimentally verify the hitherto hypothetic transport mechanism, which involves a rotation of the S unit within the membrane. With a series of experiments including reconstitution of BioMNY into lipid nanodiscs, site-specific cross-linking, a substrate binding assay with radioactive biotin and both fluorescence and EPR spectroscopic techniques, the ATP-dependent rotation of BioY (S) as a prerequisite for substrate binding and release was shown for the first time for an ECF transporter. Unlike subclass II transporters, for which an ATP-dependent release of the S unit was proposed, BioY interacts continuously with BioN (T) during the transport cycle. In a second focus of the work, an Escherichia coli reporter strain for biotin transporters was constructed. Due to inactivation of both biotin synthesis and the intrinsic high affinity biotin transporter, this strain was not capable of growing on trace amounts of biotin. With the use of this strain, transport activity of recombinantly produced solitary BioY proteins that naturally lack other ECF components was evidenced. Transport activity in the absence of AAT modules is also a feature of the Co2+ and Ni2+ specific S components CbiM and NikM. An EPR spectroscopic Co2+ detection assay helped underscoring the essential role of the small membrane protein CbiN for Co2+ loading of CbiM.

Zusammenfassung Thema dieser Arbeit sind zwei zentrale biochemische Aspekte der Proteinbiosynthese , wobei das Ribosom eine zentrale Komponente darstellt: erstens wird ein spezieller Faktor des Elongationszyklus in Pilzen, eEF3, und zweitens der proteinleitende Kanal bei der kotranslationalen Proteintranslokation durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) betrachtet. Für die Elongation der Polypeptidkette benötigen alle Organismen zwei Elongationsfaktoren, die GTPasen eEF1A (EF-Tu in Prokaryoten) und eEF2 (EF-G in Prokaryoten). Bei Fungi wird noch ein dritter Elongationsfaktor, eEF3, benötigt. Dieser Faktor ist eine ATPase mit ABC-Kassetten-Domänen. Durch einen nicht bekannten Mechamismus stimuliert er in Gegenwart von ATP die eEF1A-abhängige Bindung von Aminoacyl-tRNA an die ribosomale A-Stelle. Es wurde vorgeschlagen, dass eEF3 die Freisetzung von deacylierter tRNA aus der ribosomalen E-Stelle ermöglicht, und dadurch über allosterische Kopplung die Affinität der A-Stelle für Aminoacyl-tRNA erhöht. In dieser Arbeit wird die Kryo-EM Struktur von ribosomengebundenem eEF3 bei 13,3 Å vorgestellt. Dabei zeigt sich eine vollig neue ribosomale Bindungsstelle für eEF3 von der aus tatsächlich die Affinität für tRNA in der ribosomalen E-Stelle moduliert werden kann. Mit Hilfe der Kristallstruktur von eEF3 wurde ein molekulares Modell für eEF3 in seiner funktionalen Konformation generiert, welches die strukturelle Basis für die Aktivität dieses ABC-Proteins im Kontext der Translation liefert. Bei der kotranslationalen Translokation stellt der heterotrimere Sec61-Komplex einen signalsequenzgesteuerten proteinleitenden Kanal (PCC) dar, der die Translokation eines sekretorischen Proteins durch, oder die Integration von Membranproteinen in die ER-Membran erlaubt. Es wird angenommen, dass der aktive proteinleitende Kanal im ribosomengebundenen Zustand aus einer oligomeren Struktur mit mehreren Kopien des Sec61-Heterotrimers besteht. Die Kristallstruktur eines inaktiven PCC zeigt jedoch nur ein einziges Heterotrimer (Monomer), das auch im aktiven Zustand funktional sein könnte. In dieser Arbeit wird eine Kryo-EM-Struktur des aktiven proteinleitenden Kanals im Komplex mit einem translatierenden Ribosom aus Hefe präsentiert, die die bislang detailierteste Elektronendichtekarte für den PCC zeigt. Als charakteristisches Merkmal kann eine trichterförmige Pore auf der zytosolischen Seite visualisiert werden. Es wurden verschiedene molekulare Modelle für den aktiven Zustand in die Elektronendichte gedockt. Obwohl eine genaue molekulare Interpretation durch die Auflösung (12,3 Å) nach wie vor limitiert ist, erscheint es sehr wahrscheinlich, dass nur ein einziges, geöffnetes Sec61-Heterotrimer im aktiven Kanal vorliegt. / This work presents cryo-EM structures of two active ribosomal ligands in yeast, namely eEF3 and Sec61. Protein synthesis requires two canonical elongation factors in all kingdoms. These are the GTPases eEF1A (EF-Tu in prokaryotes) and eEF2 (EF-G in prokayotes). In fungi, a third elongation factor eEF3 is required, which belongs to the ATP-binding cassette- (ABC-) protein family. This factor is essential for the binding of the aminoacyl-tRNA-eEF1A-GTP ternary complex to the A site of the ribosome and has been suggested to do so by facilitating the clearance of deacyl-tRNA from the ribosomal E-site. The cryo-EM structure of the ATP-bound form of eEF3 in complex with an 80S ribosome shows that eEF3 binds the ribosome in the post-translocational conformation using a novel binding site. From there the affinity for tRNA in the ribosomal E site could be easily modified. Using the crystal structure of eEF3, a molecular model for eEF3 was generated, which provides the structural basis for the activity of an ABC protein in the context of translation. In co-translational translocation the trimeric Sec61-complex serves as a signal sequence-gated protein-conducting channel (PCC) which allows the translocation of a secetory protein through and the integration of a membrane protein into the lipid bilayer of the ER. Bound to a ribosome, the active PCC seems to have an oligomeric structure consisting of several copies of Sec61-trimers. The crystal structure of an inactive PCC, however, shows only a single heterotrimer (monomer) which could also be functional in the active state. The cryo-EM structure of the active PCC in complex with a translating ribosome shows the hitherto most detailed electron density map for the PCC. The most characteristic feature is a funnel-shaped off-centered pore at the cytosolic side. Several models for the active state were docked into the EM-density. Although a precise molecular interpretation is limited by the resolution (12, 3 Å), a single copy of an opened Sec61-heterotrimer seems to be the most reasonable fit for the density.

3-Jodthyronamin (3-T1AM) und Thyronamin (T0AM) sind endogene Signalmoleküle, die eine große strukturelle Ähnlichkeit zu Schilddrüsenhormonen aufweisen, allerdings die klassischen Wirkungen des aktiven Schilddrüsenhormons 3,5,3’-Trijodthyronin (T3) antagonisieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob Thyronamine (TAMs) Substrate von Dejodasen (Dio1, Dio2, Dio3) sind. Die TAMs wurden mit isozymspezifischen Dio-Präparationen inkubiert. Die Dejodierungsprodukte wurden mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert. Mit Präparationen der Dio1 wurden Dejodierungen von 3,3’,5’-Trijodthyronamin, 3’,5’- und 3,3’-Dijodthyronamin am phenolischen Ring sowie Dejodierungen von 3,5,3’-Trijodthyronamin und 3,5-Dijodthyronamin am Tyrosylring beobachtet. Dio2 haltige Präparationen katalysierten ebenfalls Dejodierungen von 3,3’,5’-Trijodthyronamin und 3’,5’-Dijodthyronamin am phenolischen Ring. Mit Dio3 haltigen Präparationen wurden alle TAMs mit jodiertem Tyrosylring dejodiert. In Kompetitionsversuchen inhibierten ausschließlich die TAMs, die als Substrate von Dio Isozymen identifizierten wurden, eine etablierte Dejodierungsreaktion eines bekannten Substrats. Im Gegensatz dazu interferierten TAMs, die in den LC-MS/MS Experimenten als Substrate der Dio Isozyme ausgeschlossen wurden, nicht mit der genannten etablierten Dejodierungsreaktion. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass TAMs Substrate aller drei Dio Isozyme sind und jedes Isozym eine eigene Substratspezifität aufweist. Diese Befunde weisen darauf hin, dass Dio Isozyme an der Biosynthese von TAMs beteiligt sein könnten. Ferner wurden die Biosynthesewege für 3-T1AM und T0AM eingegrenzt. Desweiteren gestatten die Ergebnisse neue Einblicke in die generellen strukturellen Voraussetzungen für Dio Substrate, da TAMs die bisher einzigen endogenen Dio Substrate darstellen, deren Seitenkette am Tyrosylring eine positive Ladung aufweist. / 3-iodothyronamine (3-T1AM) and thyronamine (T0AM) are novel endogenous signaling molecules that exhibit great structural similarity to thyroid hormones but apparently antagonize classical thyroid hormone (T3) actions. The present study investigated whether thyronamines (TAMs) are substrates of three Dio isozymes (Dio1, Dio2 and Dio3). TAMs were incubated with isozyme specific Dio preparations. Deiodination products were analyzed using a newly established method applying liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Phenolic ring deiodinations of 3,3’,5’-triiodothyronamine, 3’,5’- and 3,3’-diiodothyronamine as well as tyrosyl ring deiodinations of 3,5,3’-triiodothyronamine and 3,5-diiodothyronamine were observed with preparations containing Dio1. Preparations of Dio2 also deiodinated 3,3’,5’-triiodothyronamine and 3’,5’-diiodothyronamine at the phenolic rings. All TAMs with tyrosyl ring iodine atoms were deiodinated by Dio3 containing preparations. In functional competition assays, the newly identified TAM substrates inhibited an established iodothyronine deiodination reaction. By contrast, TAMs which had been excluded as Dio substrates in LC-MS/MS experiments, failed to show any effect in the competition assays, thus verifying the former results. In summary, all three Dio isozymes catalyzed TAM deiodination reactions with each isozyme exhibiting a unique substrate specificity. These data support a role for Dio isozymes in TAM biosynthesis and contribute to confining the biosynthetic pathways of 3-T1AM and T0AM. Furthermore, they provide new insights into the structural requirements for Dio substrates in general since TAMs represent the only endogenous Dio substrates described, so far, which possess a positively charged tyrosyl ring side chain.

Der Zellzyklus organisiert die Zellteilung, und kontrolliert die Replikation der DNA sowie die Weitergabe des Genoms an die nächste Zellgeneration. Er unterliegt einer strengen Kontrolle auf molekularer Ebene. Diese molekularen Kontrollmechanismen sind für das Überleben eines Organismus essentiell, da Fehler Krankheiten begüngstigen können. Vor allem Krebs ist assoziiert mit Abweichungen im Ablauf des Zellzyklus. Die Aufklärung solcher Kontrollmechanismen auf molekularer Ebene ermöglicht einerseits das Verständnis deren grundlegender Funktionsweise, andererseits können solche Erkenntnisse dazu beitragen, Methoden zu entwickeln um den Zellzyklus steuern zu können. Um die molekularen Abläufe des Zellzyklus in ihrer Gesamtheit besser zu verstehen, eignen sich computergestützte Analysen. Beim Zellzyklus handelt es sich um einen Signaltransduktionsweg. Die Eigenschaften dieser Prozesse stellen Rekonstruktion und Übersetzung in digital lesbare Formate vor besondere Herausforderungen in Bezug auf Skalierbarkeit, Simulierbarkeit und Parameterschätzung. Diese Studie präsentiert eine großskalige Netzwerkrekonstruktion des Zellzyklus des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae. Hierfür wurde die reaction-contingency Sprache benutzt, die sowohl eine mechanistisch detaillierte Rekonstruktion auf molekularer Ebene zulässt, als auch deren Übersetzung in ein bipartites Boolesches Modell. Für das Boolesche Modell mit 2506 Knoten konnte ein zyklischer Attraktor bestimmt werden, der das Verhalten einer sich teilenden Hefezelle darstellt. Das Boolesche Modell reproduziert zudem das erwartete phänotypische Verhalten bei Aktivierung von vier Zellzyklusinhibitoren, und in 32 von 37 getesteten Mutanten. Die Rekonstruktion des Zellzyklus der Hefe kann in Folgestudien genutzt werden, um Signaltransduktionswege zu integrieren, die mit dem Zellzyklus interferieren, deren Schnittstellen aufzuzeigen, und dem Ziel, die molekularen Mechanismen einer ganzen Zelle abzubilden, näher zu kommen. Diese Studie zeigt zudem, dass eine auf reaction- contingency Sprache basierte Rekonstruktion geeignet ist, um ein biologisches Netzwerk konsistent mit empirischer Daten darzustellen, und gleichzeitig durch Simulation die Funktionalität des Netzwerkes zu überprüfen. / The survival of a species depends on the correct transmission of an intact genome from one generation to the next. The cell cycle regulates this process and its correct execution is vital for survival of a species. The cell cycle underlies a strict control mechanism ensuring accurate cell cycle progression, as aberrations in cell cycle progression are often linked to serious defects and diseases such as cancer. Understanding this regulatory machinery of the cell cycle offers insights into how life functions on a molecular level and also provides for a better understanding of diseases and possible approaches to control them. Cell cycle control is furthermore a complex mechanism and studying it holistically provides for understanding its collective properties. Computational approaches facilitate holistic cell cycle control studies. However, the properties of the cell cycle control network challenge large-scale in silico studies with respect to scalability, model execution and parameter estimation. This thesis presents a mechanistically detailed and executable large-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae cell cycle control network based on reaction- contingency language. The reconstruction accounts for 229 proteins and consists of three individual cycles corresponding to the macroscopic events of DNA replication, spindle pole body duplication, and bud emergence and growth. The reconstruction translated into a bipartite Boolean model has, using an initial state determined with a priori knowledge, a cyclic attractor which reproduces the cyclic behavior of a wildtype yeast cell. The bipartite Boolean model has 2506 nodes and correctly responds to four cell cycle arrest chemicals. Furthermore, the bipartite Boolean model was used in a mutational study where 37 mutants were tested and 32 mutants found to reproduce known phenotypes. The reconstruction of the cell cycle control network of S. cerevisiae demonstrates the power of the reaction-contingency based approach, and paves the way for network extension with regard to the cell cycle machinery itself, and several signal transduction pathways interfering with the cell cycle.

Influenza A Viren besitzen ein segmentiertes, einzelsträngiges RNA-Genom, welches in Form viraler Ribonukleoprotein (vRNP)-Komplexe verpackt ist. Während das virale Genom im Zellkern repliziert wird, finden Assemblierung und Knospung reifer Viruspartikel an der apikalen Plasmamembran statt. Für die Virusbildung müssen die einzelnen viralen Komponenten hierher gebracht werden. Während intrinsische apikale Signale der viralen Transmembranproteine bekannt sind, sind der zielgerichtete Transport und der Einbau des viralen Genoms in neuentstehende Virionen noch wenig verstanden. In dieser Arbeit wurden potentielle Mechanismen des vRNP-Transportes untersucht, wie die Fähigkeit der vRNPs mit Lipidmembranen zu assoziieren und die intrinsische subzellulären Lokalisation des viralen Nukleoproteins (NP), eines Hauptbestandteils der vRNPs. Es konnte gezeigt werden, dass vRNPs nicht mit Lipidmembranen assoziieren, was mittels Flotation aufgereinigter vRNPs mit Liposomen unterschiedlicher Zusammensetzung untersucht wurde. Die Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass das virale M1 in der Lage ist, Bindung von vRNPs an negativ-geladene Lipidmembranen zu vermitteln. Subzelluläre Lokalisation von NP wurde des Weiteren durch Expression fluoreszierender NP-Fusionsproteine und Fluoreszenzphotoaktivierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass NP allein nicht mit zytoplasmatischen Strukturen assoziiert, stattdessen aber umfangreiche Interaktionen im Zellkern eingeht und mit hoher Affinität mit bestimmten Kerndomänen assoziiert, und zwar den Nukleoli sowie kleinen Kerndomänen, welche häufig in der Nähe von Cajal-Körperchen und PML-Körperchen zu finden waren. Schließlich wurde ein experimenteller Ansatz etabliert, welcher erlaubt, den Transport vRNP-ähnlicher Komplexe mittels Fluoreszenzdetektion aufzuzeichnen und Einzelpartikelverfolgungsanalysen durchzuführen. Unterschiedliche Phasen des vRNP-Transportes konnten beobachtet werden und ein 3-Phasen-Transportmodell wird skizziert. / Influenza A viruses have a segmented single-stranded RNA genome, which is packed in form of viral ribonucleoprotein (vRNP) complexes. While the viral genome is replicated and transcribed in the host cell nucleus, assembly and budding of mature virus particles take place at the apical plasma membrane. Efficient virus formation requires delivery of all viral components to this site. While intrinsic apical targeting signals of the viral transmembrane proteins have been identified, it still remains poorly understood how the viral genome is transported and targeted into progeny virus particles. In this study, potential targeting mechanisms were investigated like the ability of vRNPs to associate with lipid membranes and the intrinsic ability of the viral nucleoprotein (NP) – which is the major protein component of vRNPs – for subcellular targeting. It could be shown that vRNPs are not able to associate with model membranes in vitro, which was demonstrated by flotation of purified vRNPs with liposomes of different lipid compositions. Results indicated, however, that the matrix protein M1 can mediate binding of vRNPs to negatively charged lipid bilayers. Intrinsic subcellular targeting of NP was further investigated by expression of fluorescent NP fusion protein and fluorescence photoactivation, revealing that NP by itself does not target cytoplasmic structures. It was found to interact extensively with the nuclear compartment instead and to target specific nuclear domains with high affinity, in particular nucleoli and small interchromatin domains that frequently localized in close proximity to Cajal bodies and PML bodies. An experimental approach was finally established that allowed monitoring the transport of vRNP-like complexes in living infected cells by fluorescence detection. It was possible to perform single particle tracking and to describe different stages of vRNP transport between the nucleus and the plasma membrane. A model of three-stage transport is suggested.

Plastiden enthalten ihr eigenes Genom, das u.a. für Untereinheiten des photosynthetischen Apparates kodiert. Die Expression dieses Apparates wird hauptsächlich posttranskriptionell reguliert. Dafür notwendige Faktoren sind vor allem RNA-Bindeproteine, welche fast ausschließlich kernkodiert und posttranslational in die Plastiden importiert werden. Dazu gehören auch die äußerst abundanten chloroplastidären Ribonukleoproteine (cpRNPs). Die bisher näher untersuchten Mitglieder der cpRNP-Familie aus Arabidopsis thaliana sind an der Prozessierung und Stabilisierung von plastidären Transkripten beteiligt und phylogenetisch eng miteinander verwandt. In dieser Studie wurden zwei noch unbekannte Mitglieder der cpRNP Familie, CP33A und CP33B, näher untersucht. CP33A ist ein essentielles Protein der Chloroplastenbiogenese. Mutanten von CP33A keimen nur in der Gegenwart einer externen Kohlenstoffquelle. Die Blätter sind albinotisch, in ihrer Struktur anomal und das gesamte Wachstum ist stark eingeschränkt. Untersuchungen der RNA-Interaktionspartner von CP33A durch RIP-Chip-Analysen (RNA-Immunopräzipitation und Chip-Hybridisierung) zeigen, dass CP33A mit allen mRNAs assoziiert. Des Weiteren führt der Verlust von CP33A zu einer starken Reduktion vieler Transkripte, vor allem RNAs, die durch die plastidär kodierte RNA Polymerase (PEP) transkribiert werden und unprozessierte Vorläufer-Transkripte. CP33B interagiert ebenfalls mit multiplen plastidären RNAs. Dabei zeigt CP33B eine Präferenz für psbA. Feinkartierung der CP33B-Bindung innerhalb des psbA Leserahmens verdeutlichten, dass CP33B vor allem mit dem 3´Ende des Transkriptes interagiert. Phänotypische und genetische Untersuchungen der cp33b-Nullmutante ließen keinen vom Wildtyp abweichenden Phänotyp identifizieren und zeigten dass CP33B keinen essentiellen Einfluss auf die Proteinakkumulation photosynthetischer Untereinheiten, die Expression plastidärer Transkripte, das Spleißen und die Edierung seiner Ziel-RNAs hat. / Plastids harbour their own genome, which encodes for essential subunits of the photosynthetic apparatus. The expression of these subunits is mainly regulated on the posttranscriptional level. The important factors for posttranscriptional processing are RNA-binding proteins (RBPs), which are almost exclusively nuclear-encoded and imported posttranslational into the plastids. Among them are the chloroplast ribonucleoproteins (cpRNPs). The cpRNPs are a family of highly abundant RNA-binding proteins found in the chloroplast of land plants. Members of the Arabidopsis thaliana cpRNP family, that have been investigated in more detail, are involved in processing and stabilization of plastid transcripts and are phylogenetically closely related. In this study two unknown members of the cpRNPs, CP33A and CP33B, which cluster outside of this phylogenetic group, are investigated. CP33A is essential for chloroplast biogenesis. Null alleles of CP33A only germinate in the presence of an external carbon source. cp33a seedlings are albino, show strong growth inhibition and an abnormal leaf structure. Investigating RNA-ligands of CP33A using RIP-Chip (coimmunoprecipitation coupled to microarray analysis) shows an association with all chloroplast mRNAs. The loss of CP33A leads to a reduction of almost all transcripts, predominantly affecting RNAs transcribed by the plastid-encoded RNA polymerase (PEP) and unspliced and unprocessed precursor mRNAs. CP33B also interacts with multiple plastid RNAs. The main target is the mRNA of psbA. More than 90% of the stromal psbA mRNA is associated with CP33B. Fine mapping efforts suggest that CP33B preferentially interacts with the 3’-end of the psbA reading frame. Phenotypic and genetic analyses of cp33b-null mutants do not show any differences compared to wild-type plants. CP33B has no essential impact on: Protein accumulation of photosynthetic subunits, expression of plastid transcripts, RNA-splicing or RNA-editing of its target RNAs.

Publikationen die in letzter Zeit veröffentlicht wurden zeigten den G Protein-gekoppelte Rezeptor 30 (Gpr30) als neuer potenzieller Östrogen Rezeptor. Dieser Befund wird kontrovers diskutiert, zudem wurde die physiologische Funktion von Gpr30 bisher noch nicht vollständig geklärt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Erforschung der Rolle von Gpr30 in vivo. In einer primären und sekundären Untersuchung wurde eine phänotypische Charakterisierung einer Gpr30-defizienten Mauslinie vorgenommen. Diese Mauslinie wurde generiert, indem eine beta-Galactosidase-Neomycin Vektorkassette in den open reading frame des Gpr30 Gens eingesetzt wurde. Im Rahmen der primären Untersuchung zeigte die immunologische Analyse eine Reduzierung der T-Zellen sowohl bei den männlichen als auch bei den weiblichen mutanten Mäusen. In einer Thymus-Genexpressionanalyse konnten einige Gene identifiziert werden, die möglicherweise in der Regulation der Anzahl an T-Zellen involviert waren. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde eine Erhöhung der Kalzium-vermittelten T-Zellen Apoptose hypothetisiert. Gegenstand der sekundären Untersuchung war die Bestimmung eines möglichen metabolischen und kardiovaskulären Phänotyps, da Gpr30 überwiegend in den Blutgefäßen verschiedener Organe, sowie in der Pankreas und im Magen exprimiert ist. Zu diesem Zweck wurden die Mäuse einer Hochfettdiät unterzogen und es wurden metabolische sowie hemodynamische Tests durchgeführt. Um den Phänotyp dieser ersten Mauslinie zu bestätigen, wurde eine zweite Mauslinie ohne Selektionsmarker generiert. Insgesamt tragen die Ergebnisse der vorliegenden Studie zu einem besseren Verständnis der Funktion von Gpr30 in vivo bei. Eine Rolle des Rezeptors bezüglich der Regulation des Körpergewichts konnte widerlegt werden, während ein Einfluss auf den Lipid- und Muskelstoffwechsel angenommen werden kann. Zudem wurde gefunden, dass Gpr30 für einige Östrogen-regulierende, physiologische Prozesse nicht erforderlich ist. / Recent studies identified the G protein-coupled receptor 30 (Gpr30) as a potential new estrogen receptor. However, these findings remain still controversial and the physiological role of Gpr30 has not been clarified yet. In order to decipher the role of Gpr30 in vivo, we investigated the phenotype of a Gpr30 mutant mouse line, generated by the insertion of a beta-galactosidase-neomycin cassette into the Gpr30 open reading frame, in a primary and a secondary screen. The primary screen revealed a decrease of T cell levels in both male and female mutants. Thymus gene expression analysis allowed to detect some of the genes potentially involved in regulating T cell levels in these mice. On this basis a hypothesis of an increase in T cell calcium-mediated apoptosis was formulated. The secondary screen aimed at unraveling a potential metabolic and cardiovascular phenotype, being Gpr30 mainly expressed in the vasculature of several organs, as well as in the pancreas and in the chief gastric cells of the stomach. Therefore, mice were challenged with a defined high fat diet, and metabolic and hemodynamic tests were performed. To confirm the phenotype achieved in this first mouse line, a second one, devoid of any selection marker, was analyzed. Altogether the results achieved may contribute to a better understanding of Gpr30 function in vivo, disproving a role of Gpr30 in body weight regulation, suggesting a role in lipid and muscular metabolism, and providing evidence that Gpr30 may not be required for several estrogen-regulated physiological processes.

Um mit ihrer Umgebung zu kommunizieren verfügen lebende Zellen über Rezeptoren, welche die umschließende Membran überbrücken. Die vorherrschende G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) erhalten Informationen von Außerhalb durch Bindung eines Liganden, wodurch der Rezeptor aktiviert wird. Während der Aktivierung bildet sich innerzellulär ein offener Spalt, in den ein G-Protein (Gαβγ, G) mit seinem C-terminalen Ende koppeln kann. Die Bindung an einen GPCR führt in der Gα-Untereinheit vom Gαβγ zu einen GDP/GTP-Austausch, welcher für die weitere Signalübertragung ins Zellinnere notwendig ist. Die Kopplung von Rezeptor und Gαβγ umfasst eine Reihe von dynamischen strukturellen Änderungen, die Geschwindigkeit und Spezifität der Interaktion regeln. Hier haben wir MD-Simulationen (Molekulardynamik) verwendet, um die molekularen Details der GPCR Gαβγ Kopplung vor und während der GPCR-Gαβγ-Komplexbildung bis hin zum GDP/GTP-Austausch zu untersuchen. / To communicate with their environment, living cells feature receptors that provide a bridge across the enclosing membrane. The prevalent G protein-coupled receptors (GPCR) receive outside information through the binding of a ligand, which activates the receptor. During activation, an open intracellular crevice forms, to which a G protein (Gαβγ, G) can couple with its Gα C-terminus. Binding to GPCRs triggers GDP/GTP exchange in the Gα subunit of Gαβγ, necessary for further signal transfer within the cell. The coupling between receptor and Gαβγ involves a series of dynamic structural changes that govern speed and specificity of the interaction. Here we used molecular dynamics (MD) simulations to elucidate molecular details of the GPCR Gαβγ coupling process before and during GPCR Gαβγ complex formation up to the GDP/GTP exchange.

Der Abbau des Chlorophyll (Chl) ist ein Prozess, der typischerweise während der Blattseneszenz und der Reifung von Früchten und Samen stattfindet. Eine Störung dieses koordinierten Prozesses unter Frostbedingungen verzögert den Chl-Abbau und ist ein grosses Hindernis bei der Herstellung von hochwertigem Rapsöl. Der Abbau von Chl zu farblosen Kataboliten erfolgt in einer Serie von enzymatischen Schritten und wird durch die Chlorophyllase begonnen (Chlase). Es wurde vorgeschlagen, dass ein wasserlösliches Chl Protein (WSCP) den Transport des Chl von der Thylakoidmembran zum Wirkort der Chlase übernimmt. Weiterhin wurde angenommen, dass die Steigerungen der Genexpressionen dieser frühen Schritte den Prozess des Chl-Abbaus beschleunigen. In der vorliegenden Arbeit werden die Auswirkungen der Überexpression der Chlase aus Citrus clementii (CcCHLASE) und von WSCP aus Blumenkohl (Cau-WSCP) in transgenen Tabakpflanzen analysiert. Dazu wurde die cDNA Sequenz der CcCHLASE in E. coli exprimiert und mittels in vitro Experimenten die Hydrolysierung von Chl durch die Chlase bestätigt. Anschließend wurden CcCHLASE exprimierende Tabakmutanten generiert und drei T1-Linien wurden unter verschiedenen Stress- und Seneszenzbedingungen untersucht. Die Chlase überexprimierenden Linien zeigten unter allen getesteten Bedingungen einen im Vergleich zum Wildtyp erhöhten Chlide a Gehalt. Trotzdem unterschied sich die Menge an Endkataboliten in diesen Mutanten nicht vom Wildtyp. Andererseits zeigten WSCP überexprimierende Linien zwar keine erhöhten Chlide a Gehalte jedoch erhöhte Protochlorophyllid-(Pchlide)-Level. Das deutet auf eine Rolle des WSCP als Speichermolekül für Chlorophyllvorstufen hin. Die photoprotektive Funktion des WSCP wurde zusätzlich in WSCP überexprimierenden Linien bestätigt. Diese zeigen im Vergleich zu Wildtyp-Tabakpflanzen auch bei hohen Lichtintensitäten von 700 – 900 µmol Photonen m-2 s-1 verringerte Gehalte an Zeaxanthin und reduzierte Peroxidaseaktivitäten. / Chlorophyll (Chl) catabolism is characteristically seen during leaf senescence, fruit ripening and seed maturation. Disruption of this coordinated process under frost conditions delays Chl breakdown and is a great concern in rapeseed oil production. The present work addresses this problem by studying the effect of enhanced Chl catabolism in genetically modified tobacco plants. Chl is catabolised to colourless catabolites through a series of enzymatic reactions initiated by Chlorophyllase (Chlase). A water soluble chlorophyll protein (WSCP) has been proposed to transport Chl from thylakoid membranes to the site of action of Chlase. It was assumed that enhancing the gene expression of these early events in Chl catabolism would increase the Chl breakdown process. The present work analysed the overexpression of Chlase from Citrus clementii (CcCHLASE) and WSCP gene from cauliflower (Cau-WSCP) in modified tobacco plants. Initially, the cDNA sequence of CcCHLASE was expressed in E. coli and in vitro tests confirmed the hydrolytic activity of Chlase on Chl. Subsequently, tobacco plants overexpressing CcCHLASE were generated and three T1 lines were analysed at various stress and senescence conditions. The in vivo production of Chlorophyllide (Chlide) indicated the extent of increased Chl breakdown. The Chlase overexpressor lines showed higher Chlide a steady state levels under all tested conditions in comparison to the WT tobacco plants. However, the end catabolites did not show much difference from WT plants. On the other hand, WSCP overexpressor lines did not show any increase in Chlide a levels, but demonstrated an increased protochlorophyllide (Pchlide) levels. This suggested the role of WSCP as a storage molecule of Chl precursors. Additionally, photoprotective function of WSCP was confirmed in WSCP overexpressors, by lower zeaxanthin levels and peroxidase activity even at high light intensities of 700 – 900 µmol photons m-2 s-1 in comparison to the WT tobacco plants.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle des pro-apoptotischen Proteins Bim am endoplasmatischen Retikulum (ER) und an den Mitochondrien zu untersuchen. Für diese Untersuchungen wurden zwei Isoformen von Bim verwendet, zum einen BimL, welches an den Motor Dynein Komplex gebunden ist, zum anderen BimS, welches im Zytosol lokalisiert ist. Um eine konditionale Expression von Bim zu erreichen, wurde Myc-markierte humane cDNA unter der Kontrolle des Tet-Off Systems in einen adenoviralen Vector kloniert. Eine Überexpression von BimL und BimS induzierte in der Prostatakarzinomzelllinie DU145 Bax- und Bak-abhängigen apoptotischen Zelltod. Eine Überexpression des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 lokalisiert am ER zeigte eine vollständige Hemmung der Bim-induzierten Apoptose, was die Wichtigkeit des ER unterstreicht. Überexpression von Bcl-2 an den Mitochondrien führte eine partielle Hemmung herbei. Bim Expression induzierte Bax- und Bak-abhängig den Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials. Dieses wurde ebenso in mit am ER lokalisiertem Bcl-2 Zellen beobachtet. Bcl-2 lokalisiert an den Mitochondrien verminderte dagegen mitochondriale Permeabilisation. Proteinanalysen zeigten eine Hochregulierung von ER-Stress Proteinen nach Bim Überexpression. Zusätzlich wurde Cytochrom c Freisetzung aus den Mitochondrien und Aktivierung von Caspase-9, -3 und -8 beobachtet. Mit einem Breitband-Caspase Hemmer konnte der Bim-induzierte Zelltod vollständig gehemmt werden, was zeigt, dass Caspasen essentiell sind. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Bim, parallel zum mitochondrialen Signalweg, ER-Stress auslöst und, dass Bim eine effektive Apoptose durch die Interaktion des ER und der Mitochondrien induziert. / The aim of this thesis was to investigate the role of the pro-apoptotic BH3-only protein Bim, at the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria. For this purpose, a full length human myc-tagged Bim cDNA was cloned into an adenoviral vector, which allows for the conditional expression of the transgene under the control of a Tet-Off-system. Two different Bim isoforms were used for these investigations. One was BimL, which is bound to the motor dynein complex of the microtubule and the other one was BimS, which is localized in the cytosol. The enforced expression of each of these two isoforms in the prostate cancer cell line DU145, showed the capability of BimL and BimS to induce apoptosis via either Bak or Bax. Also, Bax- and Bak-dependent breakdown of the mitochondrial membrane potential upon overexpression of either Bim isoforms was measured. This effect was also observed in cells overexpression the anti-apoptotic protein Bcl-2 at the ER. However, targeting Bcl-2 to the mitochondria partially inhibited Bim-induced mitochondrial permeabilization. These findings indicated the execution of the intrinsic apoptotic pathway upon Bim signalling. Nevertheless, expression of Bcl-2 at the mitochondria partially suppressed Bim-induced apoptosis whereas ER-targeted Bcl-2 entirely prevented cell death induction by Bim underlining the importance of the ER. Further, an upregulation of ER stress proteins upon Bim expression was seen. Cytochrome c release form the mitochondria and activation of caspase-9, -3 and -8 was observed. In addition, the complete inhibition of Bim-induced cell death by a pan caspase inhibitor revealed that caspases are crucial. In conclusion, Bim induces the mitochondrial apoptotic pathway and, in parallel, triggers ER stress. It seems that Bim mediates cell death through the interaction of the mitochondria and the ER. The ER-mitochondria cross-talk leads to the amplification of the apoptotic death signal.