Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2015. / ENGLISH ABSTRACT: Grape must gives rise to various stress conditions for the yeast inoculated for alcoholic fermentation. These include hyperosmotic stress due to the high initial sugar concentration and redox imbalances due to the fast depletion of oxygen. Under these stress conditions, Saccharomyces cerevisiae tends to produce glycerol as an osmoprotectant and to regenerate reducing equivalents. However, the production of glycerol often leads to increased acetic acid production. According to literature, it seems that many non-Saccharomyces yeasts have a different metabolic response to the above-mentioned stress conditions, especially since it has been found that they produce low levels of acetic acid. Only recently non-Saccharomyces yeasts were researched to be used as starter cultures in wine fermentations. It is found that they can confer beneficial characteristics to the resulting wine. However, most of the non-Saccharomyces yeasts lead to stuck fermentations as confirmed by this study. Therefore, if the positive characteristics of these yeasts were to be exploited in wine making they need to be inoculated together with S. cerevisiae. When two yeasts are inoculated together, they affect each other and consequently the wine. In this context, the aim of this study was to investigate the metabolic response to hyperosmotic stress during wine fermentation of the following wine-related non-Saccharomyces yeasts: Lachancea thermotolerans, Torulaspora delbrueckii and Starmerella bacillaris. Fermentations were performed in a synthetic grape must medium with pure cultures of the mentioned strains as well as mixed cultures of each non-Saccharomyces yeast with S. cerevisiae. The fermentation behaviour was monitored and concentrations of various wine-related metabolites were determined. Concerning polyol concentrations, S. cerevisiae produced only glycerol while the non-Saccharomyces yeasts also produced other polyols. The low production of acetic acid in the non-Saccharomyces fermentations was confirmed especially in the case of L. thermotolerans. Moreover, this yeast produced high levels of the higher alcohols butanol and propanol. St. bacillaris produced significant levels of acetoin and isobutyric acid and T. delbrueckii produced an increased concentration of succinic acid. All these metabolites might play a role in maintaining intracellular redox balance. However, a more extensive systematic study is needed to investigate the extent of their involvement. The mixed cultures completed fermentation and had higher final glycerol levels than the control and lower acetic acid concentrations and therefore can contribute positively to the wine aroma. Furthermore, the mixed culture fermentations showed the potential of lowering the ethanol concentrations of wine. Furthermore it has been shown in literature that the yeasts present in the mixed culture can affect each other on gene expression level as well. However, there is little genetic information available on non-Saccharomyces yeasts. In this study, we sequenced the genes involved in glycerol and acetic acid biosynthesis of L. thermotolerans and T. delbrueckii. The gene sequences are fairly homologous with only a few differences. These gene sequences can be used to study gene expression of GPD1 and ALD6 from fermentation samples in order to determine to what extent the yeasts in a mixed culture influence the gene expression of one another. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Druiwemos gee oorsprong aan verskeie strestoestande vir die gis wat vir alkoholiese fermentasie geïnokuleer word. Hierdie strestoestande sluit hiper-osmotiese stres, as gevolg van die hoë suiker konsentrasie, in asook redoks wanbalanse toegeskryf aan die vinnige afname in beskikbare suurstof. Tydens hierdie toestande is Saccharomyces cerevisiae geneig om gliserol as beskerming teen die osmotiese stres te produseer, sowel as vir die regenereering van reduserings ekwivalente. Die produksie van gliserol lei egter dikwels tot toenemende asynsuur produksie. Volgens literatuur kom dit voor asof menige nie-Saccharomyces giste 'n ander metabolise reaksie tot die bogenoemde stresse het, omdat daar gevind is dat hulle laer vlakke van asynsuur produseer. Eers onlangs is navorsing gedoen op die potensiële gebruik van nie-Saccharomyces giste in gemengde kulture tydens wynfermentasies. Daar is bevind dat hulle voordelige eienskappe aan die wyn kan verleen. Meeste van die nie-Saccharomyces giste lei egter tot onvolledige fermentasies soos bevesting deur hierdie studie. Dus, indien die positiewe eienskappe van hierdie giste sou benut word in wynmaak sal hulle saam met S. cerevisiae geïnokuleer moet word. Wanneer twee giste saam geïnokuleer word, beïnvloed hulle mekaar en gevolglik die wyn. In hierdie konteks was die doel van die betrokke studie om die metaboliese reaksie tot hiperosmotiese stress tydens wynfermentasies te ondersoek in die volgende wyn verwante nie-Saccharomyces giste: Lachancea thermotolerans, Torulaspora delbrueckii en Starmerella bacillaris. Fermentasies was in sintetiese druiwemos medium uitgevoer met rein kulture van die genoemde gisrasse, sowel as gemengde kulture van elke nie-Saccharomyces gis met S. cerevisiae. Die fermentasiegedarg is gemonitor en die konsentrasies van verskeie wyn verwante metaboliete is bepaal. Wat die poliol konsentrasies betref, het S. cerevisiae slegs gliserol geproduseer terwyl die nie-Saccharomyces giste additionele poliole ook geproduseer het. Die lae produksie van asynsuur in die nie-Saccharomyces fermentasies is bevestig, veral in die geval van L. thermotolerans. Verder produseer hierdie gis hoë vlakke van asetoïen en iso-bottersuur en T. delbrueckii produseer 'n hoër konsentrasie van suksiensuur. Al hierdie metaboliete mag 'n rol speel in die handhawing van intrasellulêre redoksbalans. 'n Meer uitgebreide, sistematiese studie is egter nodig om die mate van hul betrokkenheid te ondersoek. Die gemengde kulture het hul fermentasies voltooi en het hoër finale gliserol vlakke as die kontrole gehad, asook laer asynsuur konsentrasies en kan dus positief bydra tot die wyn aroma. Verder het die gemengde kultuur fermentasies die potensiaal om die etanol vlakke van wyn te verlaag, getoon. Daar is verder in die literatuur gevind dat die giste teenwoordig in die gemengde kultuur mekaar op geenuitdrukkings vlak ook kan beïnvloed. Daar is egter min genetiese inligting beskikbaar vir die nie-Saccharomyces giste. In hierdie studie het ons die gene betrokke by die produksie van gliserol en asynsuur van L. thermotolerans en T. delbrueckii se nukleotied volgordes bepaal. Die gevolglike nukleotied volgordes is redelik homoloog met net 'n paar verskille. Hierdie volgordes kan gebruik word om die geenuitdrukking van GPD1 en ALD6 vanaf fermentasie monsters te bestudeer om sodoende te bepaal tot watter mate die giste in 'n gemengde kultuur mekaar se geenuitdukking kan beïnvloed.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2013. / ENGLISH ABSTRACT: In the present-day competitive global market, wine industries are constantly aiming to improve the wine-making process,including the role of yeast. The most commonly used wine yeast is Saccharomyces cerevisiae, which is able to produce high quality wines, but problem fermentations do sometimes arise. The occurrence of stuck and sluggish fermentations pose a serious problem leading to loss of productivity and quality. Although the precise mechanism leading to stuck fermentations is unknown, they are often correlated with high fructose to glucose ratios in the wine-must. S. cerevisiae is a glucophylic yeast, indicating its preference for consuming glucose over fructose. Both these hexose sugars are present in unfermented wine must, mostly in equal concentrations. As fermentation progresses, glucose is consumed at a faster rate than fructose, leading to an increase in the fructose to glucose ratio. Yeast are left with the undesirable fructose at the later stages of fermentation, when the environmental stresses on the yeast can lead to stuck or sluggish fermentation. This residual fructose can lead to undesirable sweetness, as fructose is about twice as sweet as glucose. Even with the extensive research into yeast metabolism, there is as yet no definitive explanation as to why yeasts ferment glucose faster than fructose. This study aimed to investigate the mechanism responsible for the faster consumption of glucose over fructose of a commercially used wine yeast strain S. cerevisiae VIN 13. The first two steps of sugar metabolism, uptake and phosphorylation, were investigated as the possible sites of discrepancy in fermentation rates. Enzyme rates and affinities for both glucose and fructose as substrates for the relevant enzymes were experimentally determined. These kinetic parameter values were used to improve an existing model of yeast glycolytic pathway to model wine fermentations. The feasibility of constructing and validating a kinetic model of wine fermentations were investigated, by comparing model predicted fluxes with experimentally determined fluxes. Another aspect of this study was an investigation into the effect of hexose sugar type on fermentation profiles. Wine fermentations were done with only one hexose sugar as carbon source to determine if it has an effect on the flux through metabolism. This work succeeded in the construction of a kinetic model that distinguished between glucose and fructose as carbon source. The glucose was consumed faster than fructose, with control lying in the hexose transport step. It was also established that fermentation prfiles of fermentations with only one sugar was the same for both one sugar type fermentations. Fermentation with either glucose or fructose as the sole carbohydrate source had the same specfic production and consumption rates as normal fermentations with both sugars. Construction of detailed kinetic models can aid in the metabolic and cellular engineering of novel yeast strains. By identifying the importance of hexose transport, and thus the glucophilic character of the yeast, in flux control, yeast transporters can be targeted for strain improvement. This may in turn lead to more effective fermentation practices for controlling problem fermentations, or to the development of novel strains that utilizes fructose in the same manner as glucose, and in so doing lower the risk of stuck or sluggish wine fermentation. / AFRIKAANSE OPSOMMING: In die hedendaagse kompeterende wynmark is wynmakers aanhoudend besig om die wynmaak proses te verbeter en dit sluit die verbetering van wyngis in. Die mees algemeenste gebruikte wyngis is Saccharomyces cerevisiae, omdat dit wyn van gehalte produseer, maar probleem fermentasies kom wel voor. Die verskynsel van vasval of stadige fermentasies kan lei tot die verlies van produksie en kwaliteit. Die oorsaak van probleem fermentasies is gewoontlik veelvoudig, maar die verhouding van glukose tot fruktose in die wyn-mos kan ongunstig raak om fermentasies te onderhou. S. cerevisiae is 'n glukofiliese gis, wat sy voorkeur om glukose bo fruktose te gebruik beskryf. Albei hierdie heksose suikers is teenwoordig in ongefermenteerde wyn-mos, meestal in gelyke hoeveelhede. Soos fermentasies vorder word glukose vinniger verbruik as fruktose wat lei tot 'n toename in die fruktose tot glukose verhouding. Die gis moet dus die fruktose in die later stadium van fermentasie gebruik wanneer die omgewings druk op die gis kan lei tot probleem fermentasies. Die oorblywende fruktose kan lei tot ongewenste soetheid aangesien fruktose twee keer soeter is as glukose. Selfs met die ekstensiewe navorsing met betrekking tot gis metabolisme is daar nog nie 'n verduideliking hoekom gis glukose vinniger as fruktose gebruik nie. Hierdie studie het beoog om die meganisme wat lei tot die vinniger verbruik van glukose oor fruktose te ondersoek vir 'n kommersieël gebruikte gis S. cerevisiae VIN 13. Die eerste twee stappe van suiker metabolisme, suiker opname en fosforilasie, was ondersoek as die moontlike punt van die verskil in fermentasie tempo. Ensiem snelhede en affiniteite vir beide glukose en fruktose as substrate vir die ensieme van belang was eksperimenteel bepaal. Hierdie waardes is gebruik om 'n bestaande model van gis glikolise aan te pas vir wyn fermentasies. Die uitvoerbaarheid van saamstel en valideer van 'n kinetiese model van wyn fermentasies was ondersoek, deur model voorspelde fluksie waardes met eksperimentele fluksie waardes te vergelyk. 'n Ander aspek van die studie was die ondersoek van die effek van heksose suiker tipe op fermentasie profiel. Wyn fermentasies is gedoen met slegs een heksose suiker as koolstof bron om te bepaal of dit 'n invloed het op die fluksie deur metabolisme. Hierdie werk het daarin geslaag om 'n kinetiese model saamtestel wat onderskei tussen glukose en fruktose as koolstof bron. Die glukose is vinniger verbruik as fruktose, met beheer gesetel in die heksose opname stap. Dit was ook vasgestel dat fermentasie profiele van fermentasies met slegs een suiker nie verskil het vir fermentasies met slegs fruktose of glukose. Fermentasies met slegs een suiker het dieselfde spesifieke produksie en konsumpsie tempo gehad as die normale fermentasie met albei suikers. Die konstruksie van 'n gedetailleerde kinetiese model kan gebruik word in die metaboliese en sellulêre ontwikkeling van nuwe gisstamme. Deur die ontdekking van die belangrikheid van heksose opname in fluksie beheer, wat lei tot die glukofiliese karakter van gis, kan gis opname geteiken word vir gis ontwikkeling. Dit mag om die beurt lei tot meer effektiewe fermentasie praktyk in die beheer van probleem fermentasies, of die ontwikkeling van nuwe stamme wat fruktose in dieselfde manier as glukose benut, en sodoende die risiko van vasval of stadige wyn fermentasies verlaag. / National Research Foundation / Post-graduate Merit Bursary

<p>Cilj ove doktorske disertacije je bio da se oceni mogućnost upotrebe tri sorte domaće &scaron;ljive, različitih epoha sazrevanja (Čačanska rana, Čačanska lepotica i Požegača), kao sirovina za proizvodnju voćnog vina. Utvrđeni mehanički sastav plodova i hemijske karakteristike kljuka i soka ispitivanih sorti &scaron;ljive ukazuju da se čačanska lepotica i Požegača mogu smatrati boljim sirovinama za proizvodnju voćnog vina u odnosu na sortu Čačanska rana. Vr&scaron;ena je optimizacija uslova alkoholne fermentacije (temperature, vrednosti pH, trajanja fermentacije i doze enzimskog preparata), u sklopu koje je, takođe, ispitana i upotreba različitih pektolitičkih enzima za tretman kljuka i ocenjen uticaj upotrebe različitih sojeva kvasaca, kao proizvodnih mikroorganizama, na kvalitet vina od &scaron;ljive. Utvrđeno je da, među ispitanim proizvodnim organizmima, kvasac Spriferm (S. cerevisiae) daje vino od &scaron;ljive najboljeg kvaliteta. Postupkom numeričke optimizacije dobijene su sledeće vrednosti procesnih parametara fermentacije vina od &scaron;ljive: temperatura 25 &deg;C, vrednost pH 3,5 i doza pektolitičkog enzima 0,5 g/100 kg. Pri navedenim uslovima dobijeni fitovani modeli predviđaju prinos etanola od 7,5% v/v, prinos glicerola od 5g/l, prinos vina od 48% (48 ml vina na 100 g kljuka) i formiranje 710 mg/l metanola. Karakterizacija proizvedenog vina od &scaron;ljive podrazumevala je određivanje sadržaja najvažnijih sastojaka: alkohola, kiselina, mineralnih materija, fenolnih i aromatičnih jedinjenja, kao i ocenu njegovih funkcionalnih karakteristika (antiradikalske, antimikrobne i antiproliferativne aktivnosti). Na kraju, ocenjena je mogućnost smanjenja produkcije metanola u vinu od &scaron;ljive primenom različitih fizičko-hemijskih tretmana kljuka. Utvrđena je značajno veća efikasnost postupaka koji uključuju neki vid toplotnog tretmana kljuka u odnosu na postupke koji podrazumevaju upotrebu određenog enolo&scaron;kog sredstva.</p> / <p>The aim of this PhD thesis was to assess the possibility of using three native plum varieties, with different ripening periods (Ĉaĉanska rana, Ĉaĉanska lepotica and Poņegaĉa), as raw material for the production of fruit wines. Determined mechanical composition and chemical characteristics of fruit pomace and juice indicate that the Ĉaĉanska lepotica and Poņegaĉa are considered as better raw materials for the production of fruit wine compared to Ĉaĉanska rana. Optimization of fermentation conditions (temperature, pH, the duration of fermentation and the dose of pectolytic enzyme) was conducted. This step also included investigation of the different pectolytic enzymes use for the treatment of pomace and evaluated the impact of using different yeast strains, as well as the effect of different production microorganisms on the plum wine quality. It was found that, among the tested production microorganisms, Spriferm (S. cerevisiae) yeast gives the plum wine of best quality. Numerical optimization procedure resulted with the following values of the process parameters of plum wine fermentation: temperature 25 &deg;C, pH value 3.5 and pectolytic enzyme dose of 0.5 g/100 kg. Under these conditions the obtained fitted models predict the ethanol yield of 7.5% v/v, glycerol yield 5 g/l, the wine yield of 48% (48 ml from 100 g of pomace) and the formation of 710 mg/l of methanol. Characterization of the produced plum wines included the determination of the most important ingredients: alcohol, acids, minerals, phenolic and aromatic compounds, as well as evaluation of their functional characteristics (antiradical, antimicrobial and antiproliferative activities). Finally, the possibility of reducing the methanol production in plum wine was estimated by applying different physico-chemical treatments of the pomace. Significantly higher efficiency of procedures that involve some form of heat treatment of pomace, compared to treatments which involve the use of certain oenological means, was observed.</p>

La levure Saccharomyces cerevisiae joue un rôle essentiel dans la production de composés aromatiques, tels que les esters, les alcools supérieurs et les acides organiques, ainsi que dans la transformation de précurseurs d'arômes du raisin pendant la fermentation du vin. Afin d'identifier les bases génomiques et métaboliques de ces propriétés, un croisement a été réalisé entre deux souches de levures de vin, sélectionnées pour leurs besoins en azote différents lors de la fermentation. 130 ségrégants de génération F2 ont été génotypés par séquençage complet du génome et individuellement phénotypés pendant la fermentation en mesurant les métabolites extracellulaires par HPLC et GC-MS. Les flux métaboliques intracellulaires ont été estimés à l’aide d’un modèle à base de contraintes. Une analyse QTL (quantitative trait locus) a été utilisée pour identifier les allèles influençant les variations d'arômes et de flux métaboliques. Plus de 80 QTL expliquant la variation de 59 caractères quantitatifs ont été détectés. Ces caractères comprennent des paramètres fermentaires, de consommation de substrat, la production de principaux métabolites et d’arômes fermentaires, ainsi que le métabolisme de composés aromatiques du raisin. L’intérêt de la cartographie QTL pour identifier les déterminants génétiques de variations de flux intracellulaires (f-QTLs) a par ailleurs été démontrée. Les QTL détectés ont été disséqués et des gènes dont les allèles contribuent spécifiquement aux variations phénotypiques ont été identifiés. Ces résultats soulignent la complexité génomique et métabolique de la synthèse et de la transformation d'arômes par la levure. L'identification de ces déterminants génétiques permet de mieux comprendre les liens entre variation génétique des levures et traits technologiques et fournit une base précieuse pour le développement de souches optimisées par des stratégies génétiques de croisement assisté par marqueurs. / The yeast Saccharomyces cerevisiae plays a vital role in the production of aroma compounds, such as esters, higher alcohols and organic acids, and the conversion of grape-derived aroma precursors during wine fermentation. To identify the genomic and metabolic bases for these processes, a cross was performed between two wine yeast strains selected because of their different nitrogen requirement during fermentation. 130 F2-segregants were genotyped by whole genome sequencing and individually phenotyped during wine fermentation by measuring extracellular metabolites using HPLC and GC-MS. Intracellular metabolic fluxes were estimated by constraint-based modeling. Quantitative trait locus (QTL) mapping was used to identify allelic variants influencing variations in the aroma profile and metabolic fluxes. More than 80 QTLs explaining variation in 59 quantitative traits were detected. These traits consisted of general fermentation parameters, substrate consumption, the production of main metabolites and fermentative aromas and the metabolism of grape aroma compounds. The applicability of QTL mapping to detect regions influencing intracellular fluxes (f-QTLs) was furthermore demonstrated. Found QTLs were dissected and genes with allele specific contributions to the phenotype were identified. These results emphasize the genomic and metabolic complexity of yeast aroma formation. In addition, the identification of genetic determinants increases knowledge about the links between genetic variation and industrial traits and provides a valuable foundation for the development of optimized strains by marker-assisted selection breeding strategies.

Les souches œnologiques présentent une importante diversité dans leur besoin en azote, qui se traduit par des différences de capacité fermentaire. A l'heure actuelle, les mécanismes impliqués dans la variabilité des profils fermentaires, suite à un épuisement en azote dans le milieu, ne sont pas connus. L'identification de ces mécanismes serait un atout dans la compréhension des phénomènes conduisant aux fermentations problématiques et dans les reprises de fermentation. Afin d'identifier ces mécanismes, nous avons couplé une approche de physiologie et génomique classique, à une approche de génétique impliquant la recherche de QTL basée sur l'efficacité fermentaire en condition de carence en azote. Nous avons ainsi caractérisé cette différence de besoin en azote entre souches comme étant une variabilité dans la capacité à percevoir la carence en azote et à développer un programme de quiescence réduisant le flux d'énergie et augmentant un état de stress. Ces remaniements d'énergie se traduisant alors par des différences de capacités fermentaires. L'approche QTL a quant à elle permis de détecter 23 régions du génome potentiellement impliquées dans le maintien de la capacité fermentaire. Après analyse nous avons identifié 4 gènes dont les variations alléliques sont responsables des variations phénotypiques entre souches. L'utilisation de ces gènes pourrait permettre la conception de marqueurs génétiques, exploités pour la sélection de souches ayant de bonnes capacités fermentaires. Les données issues de cette approche QTL suggèrent une étroite corrélation entre les différences de réponse au stress par les souches et l'implication des mécanismes de perception et de signalisation de l'azote. Enfin, l'ensemble de nos travaux offre une nouvelle hypothèse, en désignant la voie TOR comme le mécanisme responsable de la variation des capacités fermentaires entre souches. / Oenological strains present an important diversity in nitrogen requirement, which result by difference in the fermentative performances. Nowadays, mechanisms involved in variability of fermentation profiles, result in nitrogen depletion in the medium, are not known. The identification of these mechanisms would be an advantage in the comprehension of phenomena leading to problematic fermentation and the fermentation restart. To identify these mechanisms, we have coupled a physiological and classical genomic approach with a genetic approach involving the QTL mapping based on the fermentation capacity in conditions of deficiency. We have characterized this difference in nitrogen requirement between strains as variability in the ability to sense nitrogen starvation and develop a quiescent program that reduces the flow of energy and increases its adaptation to stress. These energy rearrangements result in differences of fermentative performances. QTL approach allowed to detect 23 genome regions potentially involved in maintaining of the fermentative capacity. After analysis we have identified 4 genes for which allelic variations are responsible for the phenotypic variation between strains. The use of these genes may allow the design of genetic markers, exploited for the selection of strains with good fermentation capacity. The data from this QTL approach suggest a correlation between differences in stress response and the involving of mechanisms sensing and nitrogen signaling. Finally, all our work supplies a new hypothesis, pointing to the TOR pathway as the mechanism responsible of variation in fermentation capacity between strains.

Les souches Saccharomyces cerevisiae présentent une forte diversité phénotypique, notamment au niveau des propriétés fermentaires parmi les souches œnologiques. Les bases moléculaires de ces différences de comportements ainsi que les mécanismes d'adaptation à l'environnement œnologique sont encore mal connues. Les variations d'expression génique contribuent à cette diversité phénotypique, cependant les réseaux et les gènes concernés sont peu décrits. Afin d'aborder ces questions, nous avons développé une approche intégrée « génétique-génomique » qui combine la cartographie de QTL en fermentation alcoolique et les profils d'expression d'une population recombinée. La recherche de QTL d'expression nous a permis de détecter 1465 eQTL correspondant à des régulations locales ou distantes dont certaines regroupées en hotspots. Nous avons déterminé qu'une duplication d'un segment chromosomique est impliquée dans le contrôle de la cinétique de fermentation. Nos données ont révélé que les perturbations d'expression concernent de nombreux réseaux métaboliques. Nous avons caractérisé plus finement les sources de variations d'expression qui affectent les systèmes de détoxification, et avons montré que les modifications de régulation de plusieurs exporteurs membranaires sont liées à des mutations dans des facteurs de transcription. Nous avons également décrypté les variations contrôlant les gènes du métabolisme de la thiamine. Nous montrons qu'une altération du senseur Thi3p, conduit à privilégier l'expression des gènes de biosynthèse de la thiamine chez la souche œnologique aux dépens d'un gène de pyruvate décarboxylase. Ces travaux nous ont ainsi permis d'accéder à une partie des bases moléculaires responsables de la diversité et de l'adaptation des souches aux conditions œnologiques. / Saccharomyces cerevisiae strains have a high phenotypic diversity, particularly in terms of fermentation properties among wine strains. The molecular bases underlying these behavior differences and the mechanisms of adaptation to the wine environment are still poorly known. Changes in gene expressions contribute to this phenotypic diversity. However, the regulatory networks and the genes involved are badly described. To address these questions, we developed an integrated “genetics-genomics” approach that combines QTL mapping in alcoholic fermentation and expression analysis of a recombinant population. The search for expression QTL allowed us to detect 1465 eQTL corresponding to local or distant regulations, several of them being grouped into hotspots. We highlighted that a duplication of a chromosomal segment is involved in the control of the fermentation kinetics. Our data showed that the expression disturbances are involved in many metabolic networks. We characterized more precisely the sources of expression variations affecting the detoxification systems, and showed that the changes in regulation of several membrane exporters are linked to mutations in transcription factors. We have also deciphered the variations controlling genes of the thiamine metabolism. We showed that an alteration of the sensor Thi3p tends to favor the expression of genes for the thiamine biosynthesis in wine strain at the expense of a gene encoding a pyruvate decarboxylase. This work allowed us to access some of the molecular bases responsible of the diversity and the strains adaptation to oenological conditions.

Thesis (PhD)--University of Stellenbosch, 2011. / ENGLISH ABSTRACT: During winemaking, a number of biochemical changes occur as a result of the metabolic activity of wine lactic acid bacteria (LAB) associated with malolactic fermentation (MLF). The latter process, which occurs mostly after alcoholic fermentation by wine yeasts, involves the conversion of L-malate to L-lactate and CO2, thus resulting to wine acidity reduction, microbiological stabilization and alterations of wine organoleptic quality. Although Oenococcus oeni is predominantly the most preferred species suitable for carrying out MLF in wine owing to its desirable oenological properties, Lactobacillus plantarum has also been considered as a potential candidate for MLF induction. Other species in the genera of Lactobacillus and Pediococcus are often associated with wine spoilage. These microorganisms induce wine spoilage by producing off-flavours derived from their metabolic activity. It is therefore of paramount importance to understand the mechanism by which wine microbiota cause spoilage. The purpose of this study was to investigate the presence of genes encoding enzymes of oenological relevance in wine-associated LAB strains. In order to achieve this, different sets of specific primers were designed and employed for a wide-scale genetic screening of wine LAB isolates for the presence of genes encoding enzymes involved in various metabolic pathways, such as citrate metabolism, amino acid metabolism, hydrolysis of glycosides, degradation of phenolic acids as well as proteolysis and peptidolysis. PCR detection results showed that the majority of the tested strains possessed most of the genes tested for. It was also noted that, among the O. oeni strains tested for the presence of the pad gene encoding a phenolic acid decarboxylase, only two strains possessed this gene. None of the O. oeni strains has previously been shown to possess the pad gene, and this study was the first to report on the presence of this gene in O. oeni strains. In an attempt to genetically characterize this putative gene, DNA fragments from the two positive O. oeni strains were sequenced. The newly determined sequences were compared to other closely related species. Surprisingly, no match was found when these sequences were compared to the published genomes of three O. oeni strains (PSU-1, ATCC BAA-1163 and AWRI B429). This reinforced a speculation that the pad gene in these two strains might have been acquired via the horizontal gene transfer. In addition, it remains to be further determined if the presence of this gene translates to volatile phenol production in wine. In this study, a novel strain isolated from South African grape and wine samples was also identified and characterized. The identification of this strain was performed through the 16S rDNA sequence analysis, which indicated that this strain belongs to Lactobacillus florum (99.9% sequence identity). A novel PCR assay using a species-specific primer for the rapid detection and identification of Lb. florum strains was also established. For further characterization, this strain was also investigated for the presence of genes encoding enzymes of oenological relevance. PCR detection results indicated that the Lb. florum strain also possess some of the genes tested for. In addition to genetic screening of wine LAB isolates for the presence of different genes, this study was also aimed at evaluating the regulation of the mleA gene encoding malate decarboxylase in three oenological strains of O. oeni. The regulation of this gene was tested in a synthetic wine medium under various conditions of pH and ethanol. From the expression analysis, it was observed that the mleA gene expression was negatively affected by high ethanol content in the medium. On the other hand, low pH of the medium seemed to favour the expression of this gene as the mleA gene expression was more pronounced at pH 3.2 than at pH 3.8. The findings from this study have shed more light on the distribution of a wide array of enzyme-encoding genes in LAB strains associated with winemaking. However, it remains unknown if the enzymes encoded by these genes are functional under oenological conditions, given that wine is such a hostile environment encompassing a multitude of unfavourable conditions for the enzymes to work on. Evaluating the expression of these genes will also help give more insights on the regulation of the genes under winemaking conditions. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Gedurende wynmaak, sal 'n aantal biochemiese veranderinge plaasvind as gevolg van die metaboliese aktiwiteit van wyn melksuurbakterieë (MSB) wat betrokke is by appelmelksuurgisting (AMG). Die laasgenoemde proses, wat meestal na alkoholiese fermentasie deur wyngiste plaasvind, behels die omskepping van L-malaat na L-laktaat en CO2, om sodoende die wyn se suur te verminder, mikrobiologiese stabiliteit en verandering van wyn organoleptiese kwaliteit. Alhoewel Oenococcus oeni hoofsaaklik die mees gewenste spesies is wat geskik is vir die uitvoering van AMG in wyn weens sy geskikte wynkundige eienskappe, Lactobacillus plantarum word ook beskou as 'n potensiële kandidaat vir AMG induksie. Ander spesies in die genera Lactobacillus en Pediococcus word dikwels geassosieer met wynbederf. Hierdie mikro-organismes veroorsaak wynbederf deur die produksie van wangeure as gevolg van hul metaboliese aktiwiteite. Dit is dus van kardinale belang dat die meganisme van die wynbederf verstaan word. Die doel van hierdie studie was om die teenwoordigheid van koderend ensieme gene van wynkundige belang in wynverwante MSB stamme te ondersoek. Ten einde dit te bereik, was verskillende stelle van spesifieke peilers ontwerp en toegepas vir 'n groot skaal se genetiese toetsing van wyn MSB isolate vir die teenwoordigheid van ensiemkoderende gene betrokke by verskeie metaboliese paaie, soos sitraat metabolisme, aminosuur metabolisme, hidrolise van glikosiede, agteruitgang van fenoliese sure sowel as proteolise en peptidolise. PKR opsporings resultate het getoon dat die meerderheid van die stamme getoets, die meeste van die gene getoets voor besit. Dit is ook opgemerk dat, onder die O. oeni stamme getoets vir die teenwoordigheid van die pad geen, slegs twee stamme hierdie geen besit. Geen O. oeni stamme het voorheen gewys dat hul die pad geen besit, en hierdie studie was die eerste bewys oor die teenwoordigheid van hierdie geen in O. oeni stamme. In 'n poging om die geen geneties te karakteriseer, is DNA-fragmente van die twee positiewe O. oeni stamme se sekwens volgorde bepaal. Die DNA volgorde is vergelyk met ander nouverwante spesies. Verrassend, was geen passende DNA volgorde gevind met die gepubliseerde genome van drie O. oeni stamme (PSU-1, ATCC BAA-1163 en AWRI B429) nie. Dit versterk die spekulasie dat die pad geen in hierdie twee stamme via die horisontale geen-oordrag verkry is. Verder moet dit nog bepaal word of die teenwoordigheid van hierdie geen lei na vlugtige fenol produksie in wyn. In hierdie studie, is ongeïdentifiseerde stam geïsoleerd van Suid-Afrikaanse druiwe en wyn monsters ook geïdentifiseer en karakteriseer. Die identifisering van hierdie stam is uitgevoer deur middel van die 16S rDNA volgorde analise, wat aangedui het dat hierdie stam behoort aan Lactobacillus florum (99.9% volgorde identiteit). PKR toetse met behulp van die spesie-spesifieke peiler vir die vinnige opsporing en identifikasie van Lb. florum stamme is ook ontwikkel. Vir verdere karakterisering, was hierdie stam ook ondersoek vir die teenwoordigheid van koderende ensiem gene van wynkundige belang. PKR opsporings resultate het aangedui dat die Lb. florum stam ook oor 'n paar van die gene getoets voor besit. Bykomend tot genetiese toetsing van wyn MSB isolate vir die teenwoordigheid van verskillende gene, het die studie ook die evaluering van die regulering van die mleA geen, kodering malaatdekarboksilase in drie wyn stamme van O. oeni. Die regulering van hierdie geen was getoets in die sintetiese wynmedium onder verskillende pH en etanol kondisies. Van die uitdrukkingsresultate, is daar waargeneem dat die mleA geenuitdrukking is negatief geraak deur hoë etanol-inhoud in die medium. Aan die ander kant, in die lae pH medium was die uitdrukking van hierdie geen bevoordeel by pH 3.2 as by pH 3.8. Die bevindinge van hierdie studie het meer lig gewerp op die verspreiding van die wye verskeidenheid van ensiem-koderende gene in MSB stamme wat verband hou met wynmaak. Dit bly egter steeds onbekend of die ensieme gekodeer deur hierdie gene funksioneel is onder wynkondisies, gegewe dat wyn so 'n vyandige omgewing is menigte ongunstige toestande vir die werking van ensieme. Evaluering van die uitdrukking van hierdie gene sal ook help om meer insigte gee oor die regulering van die gene onder wynmaak toestande.

Les fermentations alcooliques peuvent s’accompagner de phénomènes de mortalité des levures entraînant des fermentations languissantes ou stoppées. Les mécanismes sous-jacents de la mortalité des levures en conditions de limitation nutritionnelle au cours des fermentations alcoolique sont encore mal connus. Dans ce travail, nous avons abordé la mortalité des levures en référence au schéma conceptuel développé dans les études de vieillissement cellulaire qui ont montré que la résistance à la carence peut être influencée par la nature du nutriment limitant la croissance cellulaire. Nous avons étudié l’apparition de la mort cellulaire en analysant la capacité des levures à mettre en place une réponse appropriée à différentes carences nutritionnelles. Nous avons montré que plusieurs carences nutritionnelles (acide oléique, ergostérol, acide pantothénique et acide nicotinique) entraînent une perte de viabilité de façon dépendante de l’azote. Nous avons démontré que la voie de signalisation azotée TOR/Sch9 est impliquée dans la mise en place de cette mort cellulaire. Dans de telles conditions, les levures n’acquièrent pas de résistance au stress du fait d’une modification à un niveau post-transcriptionnel. Nous avons examiné la capacité de différentes sources d’azote à entraîner la mort cellulaire, et nous avons montré qu’elles agissent différemment sur la mort cellulaire et que le NH4+ a une forte capacité à induire la mortalité. Enfin, les approches QTL nous ont permis d’identifier plusieurs régions contrôlant la mort cellulaire en limitation en acide oléique et acide pantothénique, cohérent avec un contrôle multigénique. 3 régions QTL communes à ces deux limitations ont été identifiées, ce qui suggère des mécanismes communs de contrôle de la survie des levures dans ces deux conditions de carences nutritionnelles. / Yeast cell death can occur during wine alcoholic fermentation and lead to sluggish or stuck fermentations. The mechanisms underlying cell death during yeast starvation in alcoholic fermentations remain unclear. In this work we addressed yeast cell death using conceptual framework from ageing studies showing that yeast resistance to starvation can be influenced by the nature of the nutrient limiting cell growth. We examined cell death occurrence considering yeast cells ability to elicit an appropriate response to a set of nutrient limitations. We showed that several micronutrients limitations (oleic acid, ergosterol, pantothenic acid and nicotinic acid) trigger cell death in a nitrogen-dependent manner. We provide evidence that the nitrogen Tor/Sch9 signaling pathway is involved in triggering cell death. In such conditions, yeast cells fail to acquire stress resistance given a restriction at a post-transcriptional level. We have examined the ability of different nitrogen sources to trigger cell death showing that they impact differentially on cell death and that NH4+ had a strong death inducing capacity. Finally, the QTL approaches allowed the mapping of a set of loci controlling cell death under oleic acid and pantothenic acid starvation that are consistent with a multigenic control. 3 QTL regions appeared to be common to these two limitations which suggests some common control of the yeast survival in these two nutrient-limited situations.

Résumé : Saccharomyces cerevisiae, utilisée depuis des millénaires pour la fermentation du vin du fait de son endurance et de ses qualités inégalables, est de nos jours largement utilisée pour inoculer les mouts de raisin. Néanmoins, lors de l'inoculation, les souches oenologiques doivent faire face à des stress spécifiques qui peuvent compromettre le début de la fermentation. L’objectif de ce travail est d'élucider les bases métaboliques et moléculaires de la résistance multi-stress pendant la phase de latence en conditions oenologiques. Nous avons tout d'abord caractérisé un ensemble de levures oenologiques en mettant l'accent sur des facteurs de stress caractéristiques des vins rouges et des vins blancs. La température et le stress osmotique affectent fortement cette phase pour toutes les souches, alors que le SO2, les lipides et la thiamine ont un effet souche-dépendant. Ces données ont servi de base à deux approches parallèles. Une approche d'évolution expérimentale a permis, en appliquant des pressions sélectives caractéristiques de la phase de latence, de sélectionner des souches évoluées présentant une phase de latence plus courte. Plusieurs mutations de novo potentiellement impliquées dans le phénotype évolué ont été identifiées par séquençage de leur génome. En parallèle, une approche QTL combinant des croisements inter-souches, une étape de propagation industrielle et séchage des descendants, et la sélection de cellules bourgeonnantes par FACS a été développée. Ces deux stratégies ont permis d’identifier plusieurs variants alléliques impliqués dans la paroi cellulaire, le transport du glucose, le cycle cellulaire et la résistance au stress, jouant un rôle potentiellement important pendant la phase de latence. L’ensemble de ces résultats apporte de nouvelles connaissances sur la diversité et les bases génétiques de l'adaptation des levures à la phase de latence oenologique et offre un cadre d’amélioration des propriétés des souches. De plus, nous avons montré que K. marxianus a un potentiel pour des cultures mixtes et des contributions aromatiques positives en conditions oenologiques, ouvrant de nouvelles possibilités pour des études ultérieures.Titre : Résistance au stress lors de la phase de latence en fermentation oenologique et développement de levures optimiséesMots clés : Fermentation oenologique, levure, phase de latence, résistance multi-stress, QTL, évolution adaptative, K. marxianus / Abstract: Saccharomyces cerevisiae has been used for millennia to perform wine fermentation due to its endurance and unmatched qualities and is nowadays widely used as wine yeast starter. Nevertheless, at the moment of inoculation, wine yeasts must cope with specific stress factors that can compromise the fermentation start. The objective of this work was to elucidate the metabolic and molecular bases of multi-stress resistance during wine fermentation lag phase. We first characterized a set of commercialized wine yeast strains by focusing on stress factors typically found at this stage in red wines and in white wines. Temperature and osmotic stress had a drastic impact in lag phase for all strains whereas SO2, low lipids and thiamine had a more strain dependent effect. Based on these data, we developed two parallel approaches. Using an evolutionary engineering approach where selective pressures typically present in lag phase were applied, we obtained evolved strains with a shorter lag phase in winemaking conditions. Whole genome sequencing allowed to identify several de novo mutations potentially involved in the evolved phenotype. In parallel, a QTL mapping approach was conducted, combining an intercross strategy, industrial propagation and drying of the progeny populations and selection of the first budding cells by FACS. Both strategies allowed the identification of several allelic variants involved in cell wall, glucose transport, cell cycle and stress resistance, as important in lag phase phenotype. Overall, these results provide a deeper knowledge of the diversity and the genetic bases of yeast adaptation to wine fermentation lag phase and a framework for improving yeast lag phase. Additionally, we showed that K. marxianus has potential for mixed cultures and positive aromatic contributions under oenological conditions, opening new possibilities for further studies.Title: Stress resistance during the lag phase of wine fermentation and development of optimized yeastsKeywords: Wine fermentation, yeast, lag phase, multi-stress resistance, QTL, adaptive evolution, K. marxianus

Les Fonctions biologiques sont le résultat de l'interaction de beaucoup de processus, avec differents objectives, complexités, niveaux d'hiérarchie, et changements de conditions que modi ent le comportement de systèmes. Nous utilisons des équations diferenciales ou dynamiques plus générales, et Stochastic Systèmes de Transition pour décrire la dynamique de changements des modèles. La composition, réconciliation et reutilisation des modèles nous permettent d'obtenir des descriptions de systèmes biologiques complètes et compatibles et leur combiner. Notre spéci cation de Systèmes Hybrides avec BioRica assures l'intégrité de modèles, et implement notre approche. Nous appliquons notre approche pour décrire in-silico deux systèmes: la dynamique de la fermentation du vin, et des décisions cellulaires associées à la formation de tissu d'os.