Die adaptive Immunantwort wird von T-und B-Lymphozyten realisiert. Nachdem der Antigenrezeptor auf T-Zellen durch die Interaktion mit einem MHC-Peptid Komplex auf APZ getriggert wurde, sind kostimulatorische Moleküle ein zweiter Kontrollpunkt für die Immunantworten interagierender Zellen. Für das Abschalten von ungewollten Immunantworten, z.B. Autoimmunantworten, sind Moleküle der kostimulatorischen Molekülfamilien auf den T- und B-Zellen von außerordentlicher Bedeutung. Ein zentrales kostimulatorisches Molekül ist das Molekül CTLA-4. Wir untersuchten den Einfluss von regulatorischen Zellen auf den Verlauf einer EAE, die durch einen Wechsel von Remission und Rezidiv gekennzeichnet ist. Neben den CD4+CD25+Foxp3+CTLA-4+ T-Zellen konnten wir ebenfalls CD4+CD25-Foxp3+CTLA-4+ T-Zellen in den das Gehirn infiltrierenden Lymphozyten sichtbar machen. Wir fanden gleiche Zahlen an CD4+CD25+ Zellen, die auch intrazellulär CTLA-4 exprimierten, während der akuten Phase und ersten Remission, wobei aber Oberflächen CTLA-4+CD4+ Zellen während der akuten Phase deutlich erhöht waren. Eine Depletion der natürlich vorkommenden CD4+CD25+ Treg Zellen vor dem Auslösen einer EAE führte zu einem schnelleren Krankheitsausbruch und schwererem sekundär progressivem Krankheitsverlauf. Obwohl die erste Remission von der CD4+CD25+ Treg Zelldepletion unbeeinflußt blieb, konnten bereits im ersten Krankheitsschub signifikant erhöhte Antigen spezifische proinflammatorische Zytokine der T-Zellen detektiert werden. Damit wird deutlich, dass der sekundär progressive Verlauf durch CD4+CD25+ Treg Zelldepletion bereits zeitig während des Krankheitsverlaufes eingeleitet wird. Wir konnten CTLA-4 ebenfalls in B-Zellen nachweisen. Die Expression von intrazellulärem und Oberflächen CTLA-4 in aktivierten B-Zellen ist strikt T-Zellen abhängig und hat ihr Maximum 48-72h nach Stimulation in vitro. Durch den Einsatz hochsensitiver Zellanreicherungsverfahren konnte der Nachweis der mRNA für CTLA-4 in den B-Zellen aus T-Zellabhängigen Zellkultursystemen erbracht werden. Die Induktion der mRNA für CTLA-4 kann unter bestimmten Umständen durch CD19 Kreuzvernetzung in B-Zellen erfolgen. Durch den Einsatz von Knochenmarkschimären, in denen CTLA-4 spezifisch nur in B-Zellen deletiert wird, konnte gezeigt werden, dass CTLA-4 in B-Zellen die primäre IgE und IgM und die sekundäre IgM Produktion in Thymus abhängigen Immunantworten steuert. Diese Daten implizieren für alle Thymus abhängigen Immunantworten eine noch komplexere Regulation, bei der CTLA4 in B-Zellen deren Effektorfunktion intrinsisch modulieren kann. / T and B lymphocytes carry out the adaptive immune response. After the antigen receptor on T cells is triggered through interaction with an MHC:peptide complex on APCs, costimulatory molecules are a second checkpoint for immune responses of interacting cells. To terminate unwanted immune responses, such as autoimmune responses, molecules of the costimulatory molecule family on T and B cells are of great importance. A central costimulatory molecule is CTLA-4 (CD152). We investigated the influence of regulatory cells on the course of an EAE, a disease marked through alterations of remission and relapses. Apart from the CD4+CD25+Foxp3+CTLA-4+ T cells we also detected CD4+CD25-Foxp3+CTLA-4+ T cells within the brain-infiltrating lymphocyte population. Furthermore we found similar numbers of CD4+CD25+ cells that also expressed intracellular CTLA-4, during the acute phase and first remission from EAE, whereas surface CTLA-4+CD4+ cells were clearly elevated during the acute phase. The depletion of the natural occurring CD4+CD25+ Treg cells before EAE induction leads to an accelerated disease onset and an increase in disease severity combined with a secondary progressive disease course. Even though the first remission was unaffected by the depletion of CD4+CD25+ Treg cells before disease induction, the antigen specific proinflammatory cytokine production of T cells during the acute phase was already significantly increased. The data show, that the secondary progressive disease course after CD4+CD25+ Treg cell depletion is already determined early during the course of EAE. On a second approach we found CTLA-4 expression as well on B lymphocytes. The expression of intracellular and surface CTLA-4 on activated B cells is strictly T cell dependent and the expression is maximal 48-72h after stimulation in vitro. Through the use of highly sensitive cell sorting strategies we were able to detect the mRNA for CTLA-4 in B cells cultured with activated T cells. CTLA-4 mRNA in B cells is inducible in isolated B cells via crosslinking of CD19 in vitro. We generated bone marrow chimeric mice, in which only B cells were CTLA-4 deficient. With these mice we could show, that CTLA-4 on B cells controls the primary IgE and IgM, as well as the secondary IgM production in thymus dependent immune responses. These data imply a more complex regulation of thymus dependent immune responses, in which CTLA-4 on B cells can modulate B cell effector functions.

Neutrophile Granulozyten produzieren „Neutrophil Extracellular Traps“ (NETs), ein mit antimikrobiellen Molekülen bestücktes Netzwerk aus Chromatinfasern, das während eines Zelltodprogramms namens „NETosis“ von den sterbenden Neutrophilen ausgestoßen wird. Ihre netzartige Struktur erlaubt es ihnen, eine weitere Verbreitung des Infektionserregers zu verhindern; zudem erzeugen sie eine hohe lokale Konzentration an toxischen Molekülen, die Mikroorganismen töten können. Unter normalen Bedingungen werden NETs von Nukleasen zerkleinert und anschließend von Makrophagen entfernt. Wenn dieser Aufräummechanismus gestört ist, aktivieren NETs das Immunsystem und führen zur Produktion von Autoantikörpern oder entzündungsfördernden Zytokinen. NETs werden mit einer wachsenden Liste von inflammatorischen und Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Wie genau dabei NETs durch das Immunsystem erkannt werden, ist noch nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass NETs durch den zytosolischen DNA Sensor „cyclic GMP-AMP synthase“ (cGAS) detektiert werden können und dass dadurch die Expression von Typ I Interferonen (TIIFN) induziert wird. Zu Beginn demonstriere ich, dass NETs durch rekombinantes cGAS erkannt werden und dass mit isolierten NETs stimulierte Immunzellen cGAS-abhängig TIIFN produzieren. Des Weiteren zeige ich, dass Neutrophile, die NETosis begehen, in Nachbarzellen ebenfalls cGAS-anhängig TIIFN induzieren können. Abschließend konnte ich diese Ergebnisse in einem in vivo Mausmodel für systemische NET-Produktion bestätigen. Die vorliegende Arbeit zeigt einen Mechanismus, wie NETs durch das Immunsystem erkannt werden und dadurch sowohl zur Entstehung als auch zur Progression von Krankheiten beitragen kann. Sie ermöglicht dementsprechend die Entwicklung neuer Interventionsstrategien, welche zur Heilung oder Linderung einer Vielzahl von Erkrankungen beitragen können. / The first line of cellular defense of the immune system are neutrophils. They are the most abundant white blood cell, which exert an array of antimicrobial effector functions. Neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), a composite of chromatin and antimicrobial molecules, into the extracellular space during a form of regulated cell death called NETosis. Their net-like structure prevent further dissemination of the invader and establishes a high local concentration of toxic molecules that mediate pathogen killing. NETs provide a platform for undesired immune activation and contribute to the production of autoantibodies and pro-inflammatory cytokines. NETs are implicated in a growing list of inflammatory and autoimmune diseases, but the exact mechanism how NETs are recognized by the immune system is not fully understood. In this study, I demonstrate that the cytosolic DNA sensor cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) senses NETs and induces the production of type I interferons (TIIFN). I first showed that NETs are recognized by recombinant cGAS and that cells treated with isolated NETs produce TIIFN in a cGAS dependent mechanism. Secondly, I demonstrate that neutrophils undergoing NETosis are taken up by neighboring immune cells and induce cGAS-dependent TIIFN expression. Lastly, I confirmed our in vitro results in a mouse model of systemic NET induction. Wildtype mice injected with Concanavalin A significantly upregulate the expression of interferon stimulated genes, while cGAS-/- mice and Cybb-/- mice, which are incapable of producing NETs, fail to induce this response.

Epidemiologische Daten belegen eine Assoziation von Infektionen mit der Exazerbation von Autoimmunerkrankungen, wobei man aber die Wege, die dahin führen noch nicht voll versteht. Die gängigste Hypothese sieht die Ursache für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen in der Kreuzreaktivität zwischen mikrobiellen und Selbst-Antigenen, die von der selben T-Zelle erkannt werden. Dieser Antigen-spezifische Mechanismus konnte allerdings bisher nicht durch die Forschung belegt werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass im Modell der experimentellen autoimmunen Enzephalitis durch die Aktivierung mit Lipopolysacchariden gramnegativer Bakterien (LPS) Schübe in normalen Mäusen ausgelöst werden können. Diese Art der Behandlung führt in-vitro zur Proliferation und zur Zytokinproduktion bei einem Teil der T-Helfer (Th)-Effektor/Gedächtniszellen. Dabei ist zwar der physische Kontakt zwischen Th-Zellen und CD4--LPS-responsiven Zellen essentiell, jedoch geschieht die Aktivierung nicht über den T-Zellrezeptor. Als entscheidend hat sich die Bindung von kostimulatorischen Rezeptoren auf Th-Zellen durch kostimulatorische Moleküle auf CD4--Zellen erwiesen. Diese Form der Bystander-Aktivierung bietet eine Antigen-unabhängige Erklärung für die Zusammenhänge von Infektion und Autoimmunität, die mit den klinischen und epidemiologischen Daten besser vereinbar ist als die Antigen-spezifischen Modelle. / Infections sometimes associate with exacerbations of autoimmune diseases through pathways that are poorly understood. Antigen-specific mechanisms such as cross-reactivity between a microbial antigen and a self-antigen have received no direct support. Here it is shown that activation by lipopolysaccharide (LPS) induces relapses of experimental autoimmune encephalitis (EAE) in normal mice. This form of treatment induces proliferation and cytokine production in a fraction of effector/memory T helper (Th) lyphocytes in vitro via physical contact of Th cells with CD4--LPS-responsive cells. TCR mediated signals are not necessary; rather what is required is ligation of costimulatory receptors on Th cells by costimulatory molecules on the CD4- cells. This form of bystander activation provides an antigen-independent link between infection and autoimmunity that might fit the clinical and epidemiological data on the connection between infection and autoimmunity better than the antigen-specific models.

In der Arbeit wurde die Rolle von Bakterien für das Entstehen von Autoimmunität untersucht. Insbesondere wurde untersucht, inwieweit Bakterien entweder spezifisch (über "Kreuzreaktivität") oder antigenunabhängig (über "Bystander-Aktivierung") eine Aktivierung von autoreaktiven CD4+- T-Zellen induzieren können. Es konnte gezeigt werden, dass es bei dem untersuchten, MBP-spezifischen T-Zellrezeptor multiple, natürlich vorkommende, kreuzreaktive Peptide mikrobiellen Ursprungs gibt, die eine Aktivierung der T-Zellen hervorrufen und in vivo experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) induzieren können. Weiterhin wurde untersucht, inwieweit Lipopolysaccharid (LPS) als unspezifischer Aktivator des Immunsystems eine Aktivierung der autoreaktiven T-Zellen in vitro hervorrufen kann und inwieweit in vivo EAE durch LPS hervorgerufen werden kann. Es wurde gezeigt, dass LPS in vitro einen kleinen Anteil der CD4+ - T-Zellen aktiviert. Wurden den transgenen T+alpha- -Mäusen LPS appliziert, erkrankten diese an EAE. Somit gibt es sowohl in vitro als auch in vivo in den T+alpha- -Mäusen Hinweise für eine Relevanz von "Bystander-Aktivierung". Abschließend wurde diskutiert, inwieweit entweder "Kreuzreaktivität" oder "Bystander-Aktivierung" als Auslöser für Autoimmunität unter physiologischen Bedingungen in Frage kommt. Aufgrund der in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse wurde postuliert, dass keine der beiden Mechanismen alleiniger Auslöser sei, da es aufgrund der Häufigkeit von Infektionen, kreuzreaktiven Peptiden und des Vorkommens von autoreaktiven T-Zellen auch in gesunden Individuen ansonsten sehr viel häufiger zu Autoimmunität kommen müsste. Unter bestimmten Bedingungen könnte die Aktivierung von T-Zellen über Kreuzreaktivität oder über "Bystander-Aktivierung" Autoimmunität auslösen oder verstärken, wenn bereits andere Mechanismen des Immubnsystems, die Autoimmunität verhindern, versagt haben. / In this thesis the role of bacteria for the induction of autoimmunity was investigated. In detail, it was examined whether bacteria are able to activate autoreactive CD4+-T-cells antigen-specific ("cross-reactivity") or antigen-unspecific ("bystander-activation"). It was shown that the examined transgenic MBP-peptide specific T-cell-receptor recognized many natural occurring cross-reactive peptides of microbial origin, which induced an activation of the T-cells in vitro and which could induce autoimmune encephalomyelitis (EAE) in the T-cell-receptor transgenic mice in vivo. Furthermore, it was examined, whether lipopolysaccharide (LPS) as activator of the innate immune system could induce an unspecific activation of the autoreactive T-cells in vitro and whether administration of LPS in the transgenic mice could induce EAE in vivo. It was shown that LPS activates a small percentage of CD4+ - T-cells. Application of LPS to the transgenic T+alpha- mice induced EAE. Therefore, the role of bystander-activation was indicated in vitro and in vivo. Finally, it was discussed, whether either cross-reactivity or bystander-activation could be sufficient for inducing autoimmunity under physiologic conditions. Due to the results presented in this work, it is postulated that none of the both mechanisms could be inductor of autoimmunity alone. If one of these mechanisms was sufficient, autoimmunity in humans should be a frequent event, because infections and autoreactive T cells are both findings which occur in healthy humans very often. However, under certain conditions either cross-reactivity or bystander-activation could trigger or exacerbate autoimmunity, when other mechanisms which inhibit autoimmunity have failed.

Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist eine Autoimmunerkrankung, bei der eine Vielzahl an Organen betroffen sein kann. Hierbei spielen T-Zellen mit gestörter Zytokinproduktion, insbesondere von IL-2 und IFN-γ, eine besondere Rolle. Mit Fortschreiten der Krankheit sinkt die Anzahl an IL-2-Produzenten und gleichzeitig steigt die Anzahl an IFN-γ-Produzenten. Während die Rolle von IFN-γ in SLE bisher kontrovers diskutiert wird, wirkt sich die verringerte Produktion von IL-2 beispielsweise negativ auf regulatorische T-Zellen aus, was zur Pathogenese der Krankheit beiträgt. In dieser Arbeit erfolgte eine Charakterisierung der Zytokinproduzierenden CD4+ Gedächtnis-T-Zellen in erkrankten NZBxW Mäusen, einem Modell für SLE. Anhand der Produktion von IL-2 und/oder IFN-γ wurde dabei in DN (IFN-γ—IL-2— doppelt negative), IL-2 SP (IFN-γ—IL-2+ einzelpositive), DP (IFN-γ+IL-2+ doppelt positive) und IFN-γ SP (IFN-γ+IL-2— einzelpositive) Zellen unterschieden. Ein mehrstufiges Verfahren der Zellsortierung ermöglichte die Isolierung der vier Zellpopulationen. Genexpressionsanalysen legten offen, dass die während der Krankheit vermehrt vorkommende Population der IFN-γ SP Zellen im Vergleich zu DP Zellen deutliche Unterschiede in ihrem Genexpressionsmuster aufweist. IFN-γ SP Zellen exprimieren u.a. verstärkt Chemokinrezeptoren, co-stimulatorische und co-inhibitorische Moleküle, sowie Apoptose-Marker und zeigen eine verminderte Produktion von Effektorzytokinen. Weiterführende funktionelle Analysen untermauerten die Expressionsdaten und zeigten eine verminderte Proliferationsfähigkeit und verstärkte Apoptose der IFN-γ SP Zellen. Die Daten zeigen, dass der Phänotyp der IFN-γ SP Zellen in erkrankten NZBxW Lupus-Mäusen gestört ist, wodurch die IFN-γ SP Zellen zur Erkrankung beitragen könnten. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease, which can affect almost every organ system of the body. Thereby altered cytokine production by T cells plays an important role in the pathogenesis of the disease. With disease progression, production of IL-2 decreases and production of IFN-γ increases. It has been shown that IL-2 deficiency affects Treg homeostasis in SLE and thus contributes to its pathogenesis. The role of IFN-γ in SLE is, however, controversial. In this work, a comprehensive characterization of four subpopulations of memory CD4 T cells of diseased NZBxW lupus-prone mice was performed. These cell subsets are DN (IFN-γ—IL-2— double negative), IL-2 SP (IFN-γ—IL-2+ single positive), DP (IFN-γ+IL-2+ double positive) and IFN-γ SP (IFN-γ+IL-2—single positive) cells. A multi-step cell sorting procedure was used to isolate these cell subsets. The data showed that IFN-γ SP cells were characterized by a different gene expression profile than DP cells. In detail, IFN-γ SP cells revealed an enhanced expression of chemokine receptors, co-stimulatory and co-inhibitory molecules as well as apoptosis markers and decreased production of effector cytokines. In addition, functional analyses showed that IFN-γ SP cells were tended to increased apoptosis and decreased proliferation. These data show an altered phenotype of IFN-γ SP cells of diseased NZBxW lupus-prone mice, which might be important for the disease pathogenesis at least in this animal model of SLE.

Gestillte Kinder sind über die Muttermilch mit persistenten organischen Schadstoffen (POPs) belastet. Tierexperimentelle Studien deuten auf eine besondere Empfindlichkeit des sich entwickelnden Immunsystems für POPs hin. Mögliche Effekte dieser Verbindungen auf den kindlichen Organismus sind bisher kaum untersucht. Es wurden potenzielle Einflüsse verschiedener POPs (PCDDs, PCDFs, PCBs, beta-HCH, HCB und pp-DDE) auf natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und NK-Aktivität bei gestillten im Vergleich zu nicht gestillten Kindern untersucht. NK-Zellen sind eine Lymphozytensubpopulation (CD3-CD56/16+), die über ihre zytotoxische Aktivität allogene, virusinfizierte und maligne Zellen ohne vorherige Sensibilisierung töten kann. Es wurden 66 gesunde Kinder im Alter von 11-12 Monaten untersucht, davon waren 50 Kinder mindestens 4 Monate lang voll gestillt und 16 Kinder nicht gestillt. Aus einer Region mit bekannter erhöhter PCDD/PCDF-Belastung stammten 13 gestillte Kinder. Die NK-Zellzahlen wurden mittels Immunphänotypisierung am Durchflusszytometer bestimmt. Die Aktivität der NK-Zellen wurde mit einem nicht-radioaktiven, durchflusszytometrischen Zytotoxizitäts-Assay gemessen. Die POP-Konzentrationen im Blutfett der Probanden wurden kommerziell bestimmt. Weder bei den NK-Zellzahlen, noch bei der NK-Aktivität konnten zwischen den gestillten und nicht-gestillten Kindern signifikante Unterschiede im t-Test nachgewiesen werden. In Korrelationsanalysen zeigten sich keine signifikanten Einflüsse der POP-Konzentrationen auf NK-Zellzahlen und NK-Aktivität. Im Laufe der Untersuchung zeigte sich, dass der eingesetzte Zytotoxizitäts-Assay nur semiquantitative Daten lieferte. Die vorliegenden Ergebnisse und weitere Befunde bezüglich des Immunsystems der Probanden weisen darauf hin, dass die relativ hohe Belastung lange gestillter Säuglinge mit POPs nicht zu einer biologischen Wirkung im kindlichen Organismus führt. Angesichts der nachgewiesenen positiven Effekte des Stillens, kann diesbezüglich die bestehende Stillempfehlung bekräftigt werden. / Breast-fed infants are exposed to persistent organic pollutants (POPs) via breast milk. Animal studies indicate a special sensitivity of the maturing immune system to POPs. Possible effects of these compounds on the infantile organism are so far barely examined. Potential influences of several POPs (PCDDs, PCDFs, PCBs, beta-HCH, HCB and pp-DDE) on natural killer (NK) cells and NK activity of breast-fed infants in comparison to formula-fed infants were investigated. NK cells are a subset of lymphocytes (CD3-CD56/16+) that can kill allogeneic, virus-infected and malignant cells via their cytotoxic activity without prior sensitization. The study group consisted of 66 healthy infants examined at age 11 to 12 months, of which 50 infants were breast-fed and 16 infants were formula-fed. 13 breast-fed infants came from a region with known increased PCDD/PCDF-burden. Numbers of NK cells were measured by flow cytometric immunophenotyping. NK activity was analysed by a non-radioactive flow cytometric cytotoxicity assay. POP concentrations in the blood fat of the probands were calculated commercially. There were no significant differences between breast-fed and formula-fed infants concerning number and activity of NK cells in the t-test. Analysis of correlation showed no significant influences of POP concentrations on the number and activity of NK cells. In the course of the study the data obtained by the employed cytotoxicity assay proved to be only semiquantitative. The presented findings and further results concerning the immune system of the study subjects suggest that the relatively high burden of long-term breast-fed infants with POPs does not lead to a biological effect in the infantile organism. Regarding the proven positive effects of breast-feeding the existing recommendation to breastfeed can be encouraged.

Die Funktion und Spezifität von Natürlichen-Killer-T-Zellen (NKT) in angeborener und erworbener Immunität ist nicht vollständig geklärt. Die Mehrheit der NKT-Zellen erkennt alpha-galactosylceramid (alphaGalCer), ein Lipid eines marinen Schwamms mit ungeklärter Relevanz. Verschiedene mykobakterielle Lipide wurden isoliert und auf ihre CD1d-Bindung und NKT-Zell-Aktivierung untersucht. Phospatidylinositol-mannosid (PIM) von Mycobacterium bovis BCG konnte als erstes bakterielles NKT-Zell-Antigen identifiziert werden. PIM aktiviert CD1d-abhängig murine und humane NKT-Zellen zur IFN-gamma aber nicht zur IL-4 Produktion. Mehrere andere Lipid-Fraktionen aktivierten ebenfalls NKT-Zellen. Diese Stimulation war entweder eine direkte, T-Zell-Rezeptor (TZR)-vermittelte und/oder indirekte, Toll-like-receptor 2 (TLR2) vermittelte Aktivierung. Iso-globotrihexosylceramide (iGb3) wurde als das endogene NKT-Zell-Antigen beschrieben. IGb3 ist ubiquitär in Lysosomen vorhanden. Dies wirft die Frage nach der Regulation der Antigen-Verfügkarkeit und der Kontrolle der NKT-Zell-Aktivierung auf. Es konnte gezeigt werden dass die Regulation der Antigen-Verfügbarkeit essentiell für die Regulation der NKT-Zell-Aktivität ist. Unkontrolliertes Auftreten und erhöhte Konzentration von iGb3 führte zu einer substantiellen Reduktion der NKT-Zell-Zahl, vermutlich durch Aktivierungs-induziertem-Zelltod. Mit Hilfe von DNS-Microarray Analysen wurden die Gen-Expressionsprofile von naïven NKT-Zellen und klassischen CD4 T-Zellen, regulatorischen T-Zellen, NK-Zellen und aktivierten NKT-Zellen verglichen. Es konnte sowohl ein NKT-Zell-spezifisches Expressionsmuster etabliert als auch eine gemeinsame Expression von Genen in allen verglichenen Zelltypen identifiziert werden. Naive und aktivierte NKT-Zellen zeigen eine erhöhte Expression von Apoptose-regulierenden Genen welches auf eine starke Selbst-Kontrolle zur präzisen Regulation der eigenen Aktivität hinweist. / The function and specificity of Natural Killer T (NKT) cells in innate and acquired immunity still remains elusive. The vast majority of CD1d restricted NKT cells recognise alpha-galactosylceramid (alphaGalCer), derived from a marine sponge, a lipid of unclear physiological significance. Different mycobycterial glycolipids were isolated and examined for binding to CD1d as well as for their capacity of NKT cell stimulation. Phospatidylinositol-mannoside (PIM) derived from Mycobacterium bovis BCG was identified as the first bacterial lipid antigen presented by CD1d. PIM activated both murine and human NKT cells to secrete IFN-gamma but not IL-4 in a CD1d dependent manner. Additionally, several other lipid fractions with NKT cell activation capacities were identified. This activation was either a direct, T-cell-receptor (TCR) mediated and/or an indirect, toll-like-receptor 2 (TLR2) mediated activation. Iso-globotrihexosylceramide (iGb3) was described as the endogenous NKT cell antigen. iGb3 is a ubiquitously present lysosomal glycolipid which raises the question of regulation of antigen availability and NKT cell activation control. It could be shown that regulation of antigen availability plays a crucial role in regulation of NKT cell activation. Moreover, uncontrolled appearance and increased concentrations of the endogenous antigen iGb3 led to substantial decrease in NKT cell number, presumably by activation induced cell death. Using DNA Microarray analysis, the gene expression profiles of naïve NKT cells and classical CD4 T cells, regulatory T cells, NK cells as well as to activated NKT cells were compared. The profiles revealed a NKT cell specific gene expression pattern as well as expression of genes which NKT cells share with NK cells, conventional CD4+ T cells and Treg cells. Both, naïve and activated NKT cells display elevated expression of apoptosis regulating genes providing NKT cells with high degree of self-control to precisely regulate their own activity.

Transaldolase-Mangel (TALDO) ist ein extrem seltener, angeborener Stoffwechseldefekt, von dem weltweit nur 34 Fälle bekannt sind. Der Defekt geht auf den Verlust des Enzyms Transaldolase 1 aus dem nicht-oxidativen Pentosephosphat-Weg (nicht-oxPPW) zurück und äußert sich in einem weiten Spektrum klinischer Symptome. Die schwerwiegendsten Folgen sind Leber- und Nierenmangelfunktionen, die zum sehr frühen Tod führen können. Desweiteren leiden 15 % der Patienten an wiederkehrenden Infektionen. Neutrophile Granulozyten (Neutrophile) sind die häufigsten weißen Blutkörperchen im Menschen und essentiell für die angeborene Immunantwort gegen Infektionserreger. Ich habe hier funktionale Aspekte von TALDO-Neutrophilen untersucht. Der oxidative Pentosephosphat-Weg (oxPPW) stellt das Reduktionsäquivalent NADPH bereit, welches indirekt für die Entstehung von reactive oxygen species (ROS)-abhängigen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) verantwortlich ist. Der Beitrag des nicht-oxPPW zur ROS-abhängigen NET-Bildung ist bislang nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte ich für Neutrophile aus drei TALDO-Patienten eine jeweils komplett abwesende Entstehung ROS-abhängiger NETs und einen deutlich verringerten oxidativen Burst nach PMA-Stimulation zeigen. Um diese Beobachtungen in einem unabhängigen Modelsystem zu bestätigen, habe ich mit Hilfe des CRISPR-Cas9-Systems, ‚knock-out‘ Mutanten von Transaldolase 1 und dessen Partnerenzym Transketolase in der Neutrophil-ähnlichen Zelllinie PLB-985 hergestellt. Die dergestalt genetisch manipulierten Zellen waren nicht mehr zu PMA-induziertem Zelltod in der Lage. Dies ist somit der erste genetische Beweis für die Abhängigkeit des oxidativen Burst und der Bildung von NETs vom nicht-oxPPW. Diese Erkenntnis trägt zum einen zum mechanistischen Verständnis der NET-Entstehung bei und liefert zum anderen eine potentielle Erklärung für einige der bei TALDO beobachteten Symptome. Desweiteren wurden einige der metabolischen Erfordernisse für die Bildung von NETs mit Hilfe von Inhibitoren untersucht. Die erhaltenen Erkenntnisse zeigen, dass das initiale Maximum des oxidativen Bursts für NET-Bildung unerheblich ist und vielmehr die ROS-Generierung nach ca. 50 Minuten entscheidende Bedeutung für diese hat. / Transdaldolase 1-deficiency (TALDO) is a rare genetic disease with only 34 described cases globally. Transaldolase 1 is part of the non-oxidative pentose phosphate pathway (PPP) and its deficiency results in many clinical symptoms including kidney and liver failure, which can lead to early child-mortality. Some of these patients suffer from recurrent infections, for example in the respiratory tract. Neutrophils are the most abundant white blood cells and essential for the innate immune defence against bacterial and fungal pathogens. The PPP generates reduced NADPH that is crucial for the generation of superoxide by the NADPH oxidase NOX2. In turn, NOX2 is essential for neutrophil extracellular trap (NET) formation. NETs occur through the neutrophil-specific cell death netosis and consist of chromatin decorated with granular proteins. Here I report that neutrophils of three TALDO patients did not make NETs. Deletion of transaldolase 1, and its partner enzyme transketolase, in the neutrophil-like PLB-985 cell line reduced ROS generation and cell death. This confirms that transaldolase 1 is required for NET formation. We present, to the best of our knowledge, the first genetic evidence that the non-oxidative PPP is required for ROS generation and NET formation. Furthermore, some of the metabolic requirements for NET formation were assessed. The obtained data indicate that the initial peak of the oxidative burst is irrelevant for NET formation but the ROS generation after 50 minutes on the contrary has crucial significance.