Orientador: Ljubica Tasic / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T16:14:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_ThaisPereira_M.pdf: 827343 bytes, checksum: a4f6f9404835341a96ecd4f5ca467c69 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A bactéria gram-negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é responsável pelo cancro cítrico, uma doença de grande importância econômica em todo o mundo. Seus mecanismos de virulência ainda são pouco conhecidos, mas acredita-se que o processo de translocação das proteínas de virulência para a célula da planta hospedeira seja realizado por meio dos sistemas de secreção, principalmente do tipo III e hipoteticamente do tipo IV, onde se destaca o papel das chaperones secretórias. O alvo do nosso estudo é uma proteína hipotética, a XACb0032, que em ensaios de duplo híbrido, apresentou interação com a também hipotética XACb0033 anteriormente indicada como possível chaperone do sistema secretório tipo IV (TTFS). Ambas as proteínas hipotéticas são codificadas pelo locus virB do plasmídeo pXAC64. Os estudos estruturais apresentados iniciaram-se com a clonagem em pET23a, seguidos de testes de expressão desta proteína utilizando cepas de Escherichia coli, BL21(DE3)pLysS e RP códon plus. A expressão da XACb0032 foi bem sucedida utilizando a cepa RP códon plus. Os problemas encontrados para purificar a insolúvel XACb0032 foram resolvidos utilizando a sua co-expressão com a XACb0033. Após dois passos de purificação, obtivemos o complexo das proteínas (XACb0032/XACb0033) puro e em quantidades satisfatórias para análises espectroscópicas. O complexo destas proteínas foi analisado por dicroismo circular (CD), emissão de fluorescência (estática e dinâmica), ressonância magnética nuclear (RMN) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Todos os dados obtidos indicaram que o complexo purificado exibe a estrutura enovelada e que após a adição de adenosina difosfato (ADP) ocorre uma mudança evidente na sua forma e no seu tamanho, indicando uma possível quebra do complexo XACb0032/XACb0033 após a liberação de ADP na célula. Portanto, podemos supor que o sistema de secreção do tipo IV deve funcionar da seguinte maneira: 1. Ligação da chaperone XACb0033 à XACb0032 mantendo-a em uma conformação semi-desenovelada; 2. Ligação do complexo ao ATP; 3. Reconhecimento do sistema ATP + complexo pelo TTFS, logo a ATPase cliva o ATP; 4. Formação do ADP e sua presença promove a dissociação da XACb0032 do complexo; 5. Possível secreção da proteína alvo, ou seja, a XACb0032 poderia passar através do canal de secreção até atingir a célula eucariótica / Abstract: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causative agent of citrus canker, a disease of significant economic importance worldwide. The molecular bases of the virulence mechanism are still unknown, but is believed that transfer of bacterial virulence proteins directly into the host cell cytoplasm is mediated by protein secretion systems, mainly type III and hypotheticaly type IV. The target of our study was XACb0032. This protein, in two hibrid system, interacted with XACb0033, a protein previously annoted as a possible cytoplasmatic chaperone of type four secretion system (TFSS). Both proteins are hypothetic and encoded by virB locus on pXAC64 plasmid. Structural studies were initiated by pET23a cloning; followed by expression tests with Escherichia coli strands BL21(DE3)pLysS and RP. The XACb0032 RP-expression was successful, however, the protein was insoluble. This problem was solved with its co-expression with XACb0033. After two purification steps, the pure protein complex has been analysed by following spectroscopic methods: circular dichroism (CD), fluorescence emission (static and dinamic), nuclear magnetic ressonance (NMR) and small angle X-ray scattering (SAXS). Our results indicate that the complex shows a folded structure and that after ADP addition, a drastic change occured in the complex size and shape, that might indicate complex breaking upon ADP production in cell. Based on these observations, we can provide the following model for TFSS pathway concerning these proteins: 1. The chaperone (XACb0033) binds to the XACb0032 to keep it in a semiunfolded conformation; 2. This complex binds with ATP; 3. ATP bound to complex docks onto the TFSS apparatus and ATPase hydrolysis ATP; 4. ADP is formed and its presence provides that XACb0032 protein dissociates from complex; 5. The XACb0032 could be able to pass through the needle into the eukaryotic cell / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

A captação de maltose em bactérias é feita por um sistema transportador do tipo ABC composto por uma proteína ligadora de substrato (MalE), duas proteínas transmembrana e uma ATPase. No presente trabalho descrevemos a clonagem, expressão e análise bioquímica e estrutural da proteína MalE da bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) O gene malE de Xac foi clonado em vetor de expressão pET28a, a proteína recombinante foi expressa em Escherichia coli e purificada por cromatografia de afinidade ao níquel. Amostras da proteína solúvel foram analisadas quanto à estrutura secundária, interação com possíveis ligantes, estabilidade frente a diferentes condições físico-químicas. Ensaios de cristalização possibilitaram a obtenção de cristais em diferentes condições, um deles apresentou grupo espacial P6122, mas não foi possível resolver a estrutura. Com base nas estruturas conhecidas de ortólogos de MalE, geramos um modelo estrutural para a proteína de Xac e foram feitas análises quanto à interação com trealose e maltose. Modelos estruturais dos componentes transmembrana (LacF e LacG) e ATPase (UgpC) do sistema transportador de maltose de Xac também foram gerados. Os resultados representam uma contribuição importante para o conhecimento sobre a fisiologia e sistemas de transporte de Xac. / Maltose uptake in bacteria is mediated by an ABC transporter comprising a substrate binding protein (MalE), two transmembrane proteins, and one ATPase. In the present study, we describe the cloning, expression and biochemical as well as structural analyses of the MalE protein of the phytopagen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac). The malE gene of Xac was cloned in the pET28a expression vector, the recombinant protein was expressed in Escherichia coli and, subsequently, purified by nickel affinity chromatography. Samples of soluble protein were analyzed regarding secondary structure, interaction with putative ligants and stability under different physico-chemical conditions. Crystallization trials were carried out under different conditions, one particular condition yielded crystal with a P6122space group, but the structure was not solved. Based on known ortholog structures, a structural model for Xac MalE was obtained allowing interaction with modeled threhalose and maltose. Structural models the transmembrane (LacF and LacG) and ATPase (UgpC) components were also obtained. The present results represent an important contribution to the knowledge of the physiology and transporter systems found in Xac.

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T07:18:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fattori_Juliana_D.pdf: 11382370 bytes, checksum: c763644c24af47a0076a054c0186f7b1 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O presente estudo teve por objetivo a caracterização estrutural de quatro possíveis chaperonas de secreção da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Esta caracterização é importante para entender as funções destas proteínas e consequentemente compreender os mecanismos de virulência da Xac que é a causadora do cancro cítrico. Das quatro proteínas estudadas, a XACb0033 é considerada uma possível chaperona de secreção do sistema de secreção do tipo IV; a XAC1346 são possíveis chaperonas de secreção do sistema de secreção do tipo III e a XAC1990, foi identificada em 2007 como uma proteína do sistema flagelar (FlgN). As quatro proteínas, clonadas em pET23a, foram expressas em E. coli, purificadas e obtidas enoveladas conforme as análises de dicroísmo circular (CD). Por CD também se observou um alto conteúdo helicoidal na estrutura secundária das proteínas. Elas foram caracterizadas por filtração em gel analítica, espectrometria de massas, técnicas de difusão de ressonância magnética nuclear (DOSY-NMR) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Por SAXS obteve-se um modelo do envelope molecular de duas proteínas que foi condizente com a estrutura tridimensional obtida por bioinformática. Baseando-se nos resultados obtidos foi possível especular a classificação da XAC0419 como provável chaperona secretória da classe I e a FlgN (XAC1990) foi classificada como uma chaperona flagelar (classe III); e para a XACb0033 observou-se similaridade estrutural com a VirE1, que é a única chaperona secretória do sistema de secreção do tipo IV conhecida até o momento / Abstract: The aim of this study was the structural characterization of four possible secretion chaperones from the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). This characterization is very important to better understand the function of such proteins and the virulence mechanisms from Xac, which is the bacterium responsible for provoking the citrus canker. Among the target proteins, XACb0033 is a possible secretion chaperone from type IV secretion system, XAC0419 and XAC1346 are possible secretion chaperones from type III secretion system and XAC1990 was earlier identified as a flagellar protein (FlgN). All four target proteins, cloned into pET23a, were expressed in E. coli, purified and found folded as observed in the circular dichroism analyses (CD). It was also verified (CD experiments) that these proteins have a high helical content. These proteins were further characterized by analytical gel filtration, mass spectrometry (MS), diffusion techniques in nuclear magnetic resonance (DOSY-NMR) and small angle X-ray scattering (SAXS). Molecular envelops were built for two target proteins applying the SAXS data. These envelops were in good agreement with the 3D structures predicted by bioinformatics. Finally, XAC0419 was considered a possible class I secretion chaperone based on the obteined results. XAC1990 (FlgN) was confirmed as a flagellar chaperone (class III), while obtained results for XACb0033 pointed structural similarity with VirE1, the unique type IV secretion system chaperone known so far / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prando_Alessandra_D.pdf: 9977861 bytes, checksum: 15d25bce7d95433f95b938e68fdeaac8 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Até o momento, pouco se sabe sobre os mecanismos de virulência da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC), agente causador do cancro cítrico. Acredita-se que chaperonas de secreção (CS) estão envolvidas no processo de patogenicidade de XAC primeiramente formando complexos com fatores de virulência e auxiliando no encaminhamento desses para os sistemas de secreção utilizando o ATP como fonte de energia. Neste trabalho foram adquiridos dados de fluorescência de emissão, dicroísmo circular, desenovelamento térmico e de ressonância magnética nuclear de H NMR e de 2D {N,H} HSQC de duas proteínas da XAC, a XAC1990 (FlgN) e XACb0033. Para ambas proteínas foram propostas estruturas 3D usando a análise de footprinting com restrições SASA e rmsd. Para as estruturas propostas foi verificado que os dados de fluorescência corroboram com a estrutura 3D não ocorrendo o mesmo para os dados de CD e NMR que revelaram baixo conteúdo helicoidal além de ausência de estrutura 3 D. A interação da proteína FlgN com a sua proteína parceira FlgK também foi sugerida através das análises de CD e fluorescência. Na segunda parte do trabalho foram estudadas as interações entre a proteína Hsp90 da laranja com diferentes ligantes aplicando a técnica de Saturation Transfer Difference (STD-NMR) e espectroscopia de fluorescência. Estas análises revelaram dados que corroboraram com o modelo proposto e, além disso, indicaram que os hidrogênios H-8 e H-2 da adenina e H-1'da ribose estão localizados no sítio ligante da proteína com os fosfatos orientados para fora. Através da fluorescência foram calculados os valores de Kd e foi verificado que a geldanamicina é um potente inibidor de Hsp90 da laranja / Abstract: So far, the Xanthomonas axonopodis pv. citri (XAC) mechanisms of bacterial virulence is unknown. It is believed that secretion chaperones (CS) are involved in the XAC's virulence process by first forming complexes with virulence factors, and assisting in their presentation to corresponding secretion systems using ATP as a source of energy. Fluorescence emission, circular dichroism, thermal unfolding and nuclear magnetic resonance NMR H and 2D {N,H} HSQC data from two proteins of XAC, XAC1990 (FlgN) and XACb0033 were collected. For both proteins, 3D structures were proposed using the footprinting analysis with RMSD and SASA restrictions. For the proposed structures were verified which the fluorescence data were consistent with the 3D structure. The CD and NMR data revealed low-helical content and absence of 3D structure. The interaction of the protein FlgN with its partner, FlgK, was suggested by CD and fluorescence analysis. In the second part, the interactions between the orange's Hsp90 protein with different ligants using Saturation Transfer Difference (STD-NMR) and fluorescence spectroscopy techniques were studied. These analyzes revealed which the data were consistent with the proposed model and moreover showed that the adenine's hydrogens H-8 and H-2 and ribose's hydrogen H-1'are located in the protein binding site with the phosphate driven out. By fluorescence values were calculed Kd and it was verified that geldanamycin is a potent inhibitor of orange's Hsp90 / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-28Bitstream added on 2014-06-13T20:21:38Z : No. of bitstreams: 1 teixeira_ec_dr_araiq.pdf: 2441746 bytes, checksum: 6a8b98becf92d1426314457c9b30825c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho teve como principal objetivo realizar estudos funcionais na bactéria Xac, estudando o possível envolvimento dos genes copA, copB e cutC no mecanismo de resistência a cobre nesta bactéria. Estes estudos funcionais envolveram: análise da expressão dos genes durante o crescimento na presença de cobre por Northern e Western blots e por eletroforese bi-dimensional, produção e purificação das proteínas recombinantes e produção de anticorpos, inativação de um dos genes (copA) para avaliar a participação da proteína CopA no mecanismo de resistência a cobre e análise da interação das proteínas de resistência a cobre com outras proteínas de Xac através do ensaio de duplo híbrido de leveduras. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem mutante infecta a planta, mas os sintomas são mais retardados na presença do metal, quando comparada à linhagem selvagem. O crescimento das células mutantes na ausência e presença de cobre in planta indicou maior sensibilidade ao cobre pelas células mutantes. Na tentativa de verificar se as proteínas CopA, CopB e CutC interagem com outras proteínas de Xac, um ensaio de duplo híbrido de leveduras foi realizado. Através deste ensaio, algumas proteínas foram identificadas, as quais necessitam de estudos de caracterização adicionais. / Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker, a serious disease that affects the most commercial citrus cultivars causing serious economic impacts. Symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruit and leaves and general tree decline. By sequencing the genome of this bacterium (ONSA Network, FAPESP, Brazil), a better knowledge of this microorganism and its molecular interactions with the host might be elucidated. For this, we analyzed the gene expression during growth in the presence of copper by Northern and Western blots, 2D-electrophoresis, production and purification of the CopA, CopB, and CutC recombinant proteins, inactivation of the copA gene to evaluate the participation of CopA protein in the copper resistance mechanism, and protein-protein interactions assays by the yeast two-hybrid assay. Results showed that the mutant strain infects the plant, but the lesions formation was retarded in the presence of copper. The mutant strain showed more sensitivity to copper than the wild type strain during growth in planta. In order to verify whether the CopA, CopB, and CutC proteins interact with other proteins of Xac, a yeast two-hybrid assay was performed. By this assay, some proteins were identified, which need further characterizations.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-06-03Bitstream added on 2014-06-13T18:35:00Z : No. of bitstreams: 1 bonini_m_me_botfca.pdf: 503952 bytes, checksum: 1553a755d247df6ec4852dd6104b7a70 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Empresa Privada / O presente trabalho teve por objetivo avaliar a produção e a sensibilidade de 48 isolados de Xanthomonas axonopodis pv. citri e de 14 isolados de Xanthomonas spp. à bacteriocinas. Estudos foram realizados para verificar o efeito da temperatura, tempo de incubação e do tipo do meio de cultura sobre a produção de bacteriocina por isolados de X. axonopodis pv. citri. Todos isolados de X. axonopodis pv. citri não foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por eles, não sendo essas afetadas pelo meio BDA, nutriente ágar + NaCl e YPDA, nos diferentes tempos e temperaturas de incubação. Porém, isolados de X. axonopodis pv. passiflorae foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por 25 isolados de avaliados e o isolado de X. campestri pv. campestris e o de X. axonopodis pv. manihotis apresentaram sensibilidade variável. Dos 25 isolados de X. axonopodis pv. citri apenas cinco não foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas por dois isolados de X. axonopodis pv. passiflorae. As bacteriocinas produzidas pelos isolados de X. axonopodis pv. citri (FDC-806) e de X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) foram termolábeis e resistentes à lisozima e sensíveis a DNAse. A bacteriocina produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. passiflorae foi resistente à ação de proteinase K, tripsina e RNAse enquanto que a produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. citri foi sensível a essas enzimas. / The objective of this work was to evaluate the production and sensitivity of 48 Xanthomonas axonopodis pv. citri strains and 14 Xanthomonas spp. strains to bacteriocins. A number of studies were carried out to verify the effect of temperature, incubation time, and type of culture medium on bacteriocine yield by X. axonopodis pv. citri strains. None of the X. axonopodis pv. citri strains were sensitive to the bacteriocins produced by themselves, and were not affected by the PDA, nutrient agar + NaCl, and YPDA media, at the different incubation times and temperatures studied. However, X. axonopodis pv. passiflorae and strains were sensitive to the bacteriocins produced by the 25 Xac strains evaluated, while a X. campestri pv. campestris and X. axonopodis pv. manihotis strains showed variable sensitivity. Of the 25 X. axonopodis pv. citri strains, only five were not inhibited by the bacteriocins produced by the two X. axonopodis pv. passiflorae strains. The bacteriocins produced by X. axonopodis pv. citri (FDC-806) and X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) were thermolabile and resistant to lysozyme and sensitive to DNAse. The bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. passiflorae was resistant to the action of proteinase K, trypsin and RNAse, while the bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. citri isolate was sensitive to those enzymes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-19Bitstream added on 2014-06-13T20:37:29Z : No. of bitstreams: 1 lopes_mv_me_jabo_prot.pdf: 799999 bytes, checksum: a3da99204a58afdd2f525f466e3bf214 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Funep/Oxiquimica / O objetivo do presente trabalho foi analisar as condições climáticas do Estado de São Paulo e desenvolver mapas de zonas de risco de epidemias de cancro cítrico, podridão floral e pinta preta do citros. Foram utilizados dados meteorológicos referentes aos anos de 2002, 2003, 2004 e 2005, os quais foram utilizados os modelos de previsão. Para o cancro cítrico desenvolvido por Campbell e Madden (1990) e Hau e Kranz (1990); podridão floral dos citros desenvolvido por Timmer e Zitko (1993) e Timmer e Brown (2000); pinta preta desenvolvido por Hau e Kranz (1990) e Bergamin Filho (1995. Após a contabilização dos índices, foram calculadas as porcentagens de dias favoráveis à ocorrência das doenças durante o ano e em períodos pré-definidos. A partir destas informações, foram gerados os mapas temáticos do Estado de São Paulo, com a distribuição espacial da porcentagem de dias favoráveis à ocorrência das doenças. A região Noroeste do Estado foi a que apresentou a maior porcentagem de dias favoráveis à ocorrência de cancro cítrico. As regiões Sul e Leste foram as que apresentaram maior favorabilidade de ocorrência da podridão floral do s citros. Para a pinta preta a região Sul com pontos no centro do Estado foi a que apresentou maior porcentagem de dias favoráveis a ocorrência da doença. / The objective of the present work was to analyze the climatic conditions of the State of São Paulo and to develop maps of zones of risk of epidemics of citrus canker, postbloom fruit drop of citrus and citrus black spot. They had been used given meteorological referring to the years of 2002, 2003, 2004 and 2005, which had been used the forecast models. For the citrus canker developed by Campbell and Madden (1990) and Hau and Kranz (1990); postbloom fruit drop of citrus developed by Timmer and Zitko (1993) and Timmer and Brown (2000); it citrus black spot developed for Hau and Kranz (1990) and Bergamin Filho (1995). The frequency of the data was hourly and when some station presented imperfection in the series of data, these had been surpassed of the station next. After the accounting of the indices, had been calculated the percentages of days favorable to the occurrence of the diseases in the year and in the periods. From these information, the thematic maps of the State of São Paulo had been generated, with the space distribution of the percentage of days favorable to the occurrence of the diseases. The region the Northwest of the State was the one that presented the biggest percentage of days favorable to the occurrence of citrus canker. The regions South and East had been the ones that had presented greater favorable of occurrence of the postbloom fruit drop of citrus. For the citrus black spot the South region with points in the center of the State was the one that presented greater percentage of favorable days the occurrence of the diseases.

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Shaker Chuck Farah / Banca: Celso Eduardo Benedetti / Resumo: O presente trabalho teve como principal objetivo realizar estudos funcionais na bactéria Xac, estudando o possível envolvimento dos genes copA, copB e cutC no mecanismo de resistência a cobre nesta bactéria. Estes estudos funcionais envolveram: análise da expressão dos genes durante o crescimento na presença de cobre por Northern e Western blots e por eletroforese bi-dimensional, produção e purificação das proteínas recombinantes e produção de anticorpos, inativação de um dos genes (copA) para avaliar a participação da proteína CopA no mecanismo de resistência a cobre e análise da interação das proteínas de resistência a cobre com outras proteínas de Xac através do ensaio de duplo híbrido de leveduras. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem mutante infecta a planta, mas os sintomas são mais retardados na presença do metal, quando comparada à linhagem selvagem. O crescimento das células mutantes na ausência e presença de cobre in planta indicou maior sensibilidade ao cobre pelas células mutantes. Na tentativa de verificar se as proteínas CopA, CopB e CutC interagem com outras proteínas de Xac, um ensaio de duplo híbrido de leveduras foi realizado. Através deste ensaio, algumas proteínas foram identificadas, as quais necessitam de estudos de caracterização adicionais. / Abstract: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker, a serious disease that affects the most commercial citrus cultivars causing serious economic impacts. Symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruit and leaves and general tree decline. By sequencing the genome of this bacterium (ONSA Network, FAPESP, Brazil), a better knowledge of this microorganism and its molecular interactions with the host might be elucidated. For this, we analyzed the gene expression during growth in the presence of copper by Northern and Western blots, 2D-electrophoresis, production and purification of the CopA, CopB, and CutC recombinant proteins, inactivation of the copA gene to evaluate the participation of CopA protein in the copper resistance mechanism, and protein-protein interactions assays by the yeast two-hybrid assay. Results showed that the mutant strain infects the plant, but the lesions formation was retarded in the presence of copper. The mutant strain showed more sensitivity to copper than the wild type strain during growth in planta. In order to verify whether the CopA, CopB, and CutC proteins interact with other proteins of Xac, a yeast two-hybrid assay was performed. By this assay, some proteins were identified, which need further characterizations. / Doutor

Orientador: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Renate Krause Sakate / Banca: Julio Rodrigues Neto / Resumo: O presente trabalho teve por objetivo avaliar a produção e a sensibilidade de 48 isolados de Xanthomonas axonopodis pv. citri e de 14 isolados de Xanthomonas spp. à bacteriocinas. Estudos foram realizados para verificar o efeito da temperatura, tempo de incubação e do tipo do meio de cultura sobre a produção de bacteriocina por isolados de X. axonopodis pv. citri. Todos isolados de X. axonopodis pv. citri não foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por eles, não sendo essas afetadas pelo meio BDA, nutriente ágar + NaCl e YPDA, nos diferentes tempos e temperaturas de incubação. Porém, isolados de X. axonopodis pv. passiflorae foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por 25 isolados de avaliados e o isolado de X. campestri pv. campestris e o de X. axonopodis pv. manihotis apresentaram sensibilidade variável. Dos 25 isolados de X. axonopodis pv. citri apenas cinco não foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas por dois isolados de X. axonopodis pv. passiflorae. As bacteriocinas produzidas pelos isolados de X. axonopodis pv. citri (FDC-806) e de X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) foram termolábeis e resistentes à lisozima e sensíveis a DNAse. A bacteriocina produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. passiflorae foi resistente à ação de proteinase K, tripsina e RNAse enquanto que a produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. citri foi sensível a essas enzimas. / Abstract: The objective of this work was to evaluate the production and sensitivity of 48 Xanthomonas axonopodis pv. citri strains and 14 Xanthomonas spp. strains to bacteriocins. A number of studies were carried out to verify the effect of temperature, incubation time, and type of culture medium on bacteriocine yield by X. axonopodis pv. citri strains. None of the X. axonopodis pv. citri strains were sensitive to the bacteriocins produced by themselves, and were not affected by the PDA, nutrient agar + NaCl, and YPDA media, at the different incubation times and temperatures studied. However, X. axonopodis pv. passiflorae and strains were sensitive to the bacteriocins produced by the 25 Xac strains evaluated, while a X. campestri pv. campestris and X. axonopodis pv. manihotis strains showed variable sensitivity. Of the 25 X. axonopodis pv. citri strains, only five were not inhibited by the bacteriocins produced by the two X. axonopodis pv. passiflorae strains. The bacteriocins produced by X. axonopodis pv. citri (FDC-806) and X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) were thermolabile and resistant to lysozyme and sensitive to DNAse. The bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. passiflorae was resistant to the action of proteinase K, trypsin and RNAse, while the bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. citri isolate was sensitive to those enzymes. / Mestre

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Raquel Luciana Boscariol-Camargo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:37:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_ThiagoSena_M.pdf: 6491430 bytes, checksum: 1dd8f0cde7283c457f3dfd61e7ff367d (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Huanglongbing (HLB), também conhecido como greening é uma das mais importantes doenças dos citros no mundo e é causada pela bactéria Candidatus Liberibacter spp. Esta doença é originária da China e da África, onde estão presentes as variantes Ca. L. asiaticus e Ca. L. africanus, respectivamente. Em 2004, a doença foi encontrada no Brasil onde foi identificada a forma asiática e também uma nova variante denominada Ca. L. americanus. A bactéria Ca.Liberibacter vive e se desenvolve no floema da planta hospedeira, causando amarelecimento do ramo infectado, deformação e queda do fruto. Até o momento não foi possível o cultivo em meio de cultura de Ca. Liberibacter e muito pouco é conhecido sobre sua biologia. Outra doença importante para a cultura, o cancro cítrico, também é originária do continente asiático, e causa grandes perdas de produção devido à desfolha da planta e a queda precoce de frutos. Seu agente causal, a bactériaXanthomonas axonopodis pv. citri provoca lesões necróticas em folhas, ramos e frutos. Não existem variedades resistentes ao HLB ou ao cancro cítrico, o que torna necessários estudos buscando fontes alternativas de resistência às doenças. Uma das possibilidades para se obter resistência é o uso de plantas geneticamente modificadas com genes que expressam peptídeos antimicrobianos ou que atuem no mecanismo de ativação da resposta das plantas às doenças. Os genes atacinaA e Xa21 já foram empregados em construções genéticas para variedades de laranjas doces, sendo que ambos apresentaram resistência a patógenos bacterianos em outras culturas, e diminuição no número de lesões causadas pelo patógeno X axonopodis em: I plantas transgênicas de laranja doce. Outro gene interessante, o Nprl, é um regulador que atua 0(1, indução de respostas de defesa da planta contra patógenos. Em outras culturas, a superexpressão de Npr 1 culturas promoveu aumento da resistência a fungos e bactérias. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a resposta de plantas de laranjas geneticamente modificadas com estes três genes, quando infectadas com Ca. Liberibacter, e a resposta das plantas contendo o gene AtNpr 1 quando inoculadas com X axonopodis. O monitoramento da resposta à inoculação com Ca. Liberibacter foi realizado através da avaliação da presença de sintomas de HLB, e pela quantificação da bactéria nos tecidos do floema por meio de qPCR, utilizando-se a região ribossomal 16S bacteriana, previamente caracterizada. Já as plantas inoculadas com a bactéria causadora do cancro cítrico foram analisadas através da expressão de PR-proteínas, da quantificação do desenvolvimento da população bacteriana por meio de curva de crescimento, e pela análise visual de sintomas. A bactéria Ca. Liberibacter foi capaz de se multiplicar em todos os eventos de transformação analisados, porém quatro deles (transformados com o gene AtNprl) não manifestaram sintoma da doença. Duas plantas desta construção também apresentaram redução no número e tamanho das lesões causadas por X axonopodis, indicando uma possível tolerância desta planta à bactéria. / Abstract: Huanglongbing (HLB), also known as greening, is the world most important citrus disease and it is caused by the bacterium Candidatus Liberibacter spp. This disease was originated from China and Africa, where were discovered the variants Ca. L. asiaticus and Ca. L. africanus, respectively. In 2004, the disease was detected in Brazil, where the variants asiaticus and a new one called americanus were identified. The Ca. Liberibacter bacteria inhabit phloem vessels of host plants, causing yellowing of infected branches, and fruits abscission. At the moment, it was not possible to cultivate Ca. Liberibacter, and very little is known about its biology. Another important disease of citrus, the citrus canker, is also originated from Asian continent and causes huge damages to citrus production because of leaf drop and prematurely falI of fruits. Its causal agent, the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri, causes necrotic lesions in leaves, branches and fruits. There is no varietal resistance to HLB ar citrus canker, and it is necessary to develop studies in order to achieve altemative resistance sources to these diseases. One possibility to obtain resistance is the use of genetically modified plants expressing antimicrobial peptides genes, or expressing genes that act in theplant defense response machinery. The genes attacinA and Xa21 were used in genetic constructions for sweet orange varieties, and both showed resistarice to bacterial pathogens in other crops, with small number of lesions caused by X axonopodis in transgenic sweet orange plants. Another interesting gene, the Nprl, is a regulator that acts in the induction of plant defense response against pathogens. 1n other crops, the Npr 1 super-expression caused high leveI of resistance to bacterial and fungal pathogens. The goal ofthe present study was to evaluate the response of genetically modified sweet orange plants with these three genes, after infection of Ca. Liberibacter, and the response of plants containing the AtNprl gene, after X axonopodis inoculation. The response to Ca. Liberibacter infection was analyzed by the evaluation of HLB symptoms and by the quantification of phloem-associated bacteria by qPCR based on a previously characterized Ca. Liberibacter 168 ribosomal region. PIants inoculated with the causal agent of citrus canker were analyzed by RT-PCR to detect the expression of PR-proteins. The quantification of bacterial population was deveIoped using a growth curve and by visual analysis of symptoms. The bacterium Ca. Liberibacter grown in alI the transformation events analyzed, however four of them (transformed with the AtNprl gene) did not develop disease symptoms. Also, two. plants of this construction showed reduction in the number and size of lesions caused by X axonopodis, indicating a possible induction of plant tolerance to citrus canker. / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular