Orientador: Telma Teixeira Franco / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-25T04:11:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tagliari_CristianeVanessa_M.pdf: 4616067 bytes, checksum: 69983d195fdc3c5a4db642ac7b419d83 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Para reduzir os problemas ambientais, a indústria de papel e celulose vem buscando alternativas para seus processos de branqueamento através da tecnologia enzimática. Desta forma, xilanases tem sido empregadas durante o processo de pré-branqueamento de polpas Kraft, com intuito de diminuir a carga de cloro utilizada nas etapas subseqüentes. Xilanases ativas a altas temperaturas (acima de 45 °C) e pH alcalino possuem elevado potencial de aplicação em branqueamento de polpas de papel, já que podem ser introduzidas livremente nos diferentes estágios do processo sem a necessidade de drásticas etapas de resfriamento ou ajustes de pH. Bactérias são aptas a produzir enzimas que atuam nestas condições, tornando atrativo o estudo da produção de xilanase por Bacillus pumilus. Para viabilizar a aplicação de xilanases em larga escala é necessário que esta seja obtida com alta produtividade e baixo custo. Neste trabalho foram investigadas as condições de produção de xilanases alcalinas por B. pumilus em fermentação submersa. O meio de cultivo foi estudado por planejamento estatístico, objetivando maximizar a produção de xilanases em frascos agitados. Após determinar as melhores condições de cultivo, um biorreator com volume útil de 2L foi utilizado para produzir a quantidade necessária de enzima para aplicação nos testes de branqueamento. A maior produção da enzima em frascos agitados (129 U/mL) foi verificada no ponto central do segundo planejamento experimental em 20 horas de fermentação, o qual apresentava 3% xilana, 0,6% peptona, 0,15% sulfato de amónio e pH 9,5. Foi verificado que a produtividade aumentou (170 U/mL em 10 horas) quando a enzima foi produzida em biorreator de 2 L, evidenciando o potencial do B. pumilus para a produção de xilanases alcalinas e termofílicas. Quanto a aplicação da enzima no pré-branqueamento de polpas Kraft, foi verificado uma deslignificação de 26% quando a polpa foi tratada com xilanases na dosagem de 50U/g polpa seca, resultado superior aos encontrados na literatura. / Abstract: Environmental concerns, have put a restriction on the usage of chlorine during bleaching process in the paper and pulp industry. Therefore, xylanase pretreatment has been used to lower bleaching chemical consumption. Enzymes which are active under alkaline conditions and higher temperatures, have great potential for industrial application, such as the bleaching process, without any need for cooling or changes in pH and with the advantage in lowering the release of polluting organic chlorine compounds. Bactérias are able to produce enzymes that act in these conditions, than being attractive xylanase production by Bacillus pumilus. For industrial large scale aplication, the enzyme should be obtained with high productivity and low cost. This work investigated the optimal conditions of alkaline xylanases produced by B. pumilus in submerged fermentation. The culture media was studied by statistical factorial design, aiming to increase the xilanases production. The best conditions were applied in 2L bioreactor to produce the enzyme necessary for application in bleaching process. The highest xylanase production in culture flasks (129 U/mL) was obtained at central point of the second factorial design in 20 hours of fermentation, which contained 3% xylan, 0.6% peptone, 0.15% ammonium sulfate and pH 9.5. It was observed that the productivity increased (170 U/mL in 10 hours) when the enzyme was produced in 2 L biorreator, evidencing the potential of the B. pumilus for the production of thermophilic and alkaline xylanases. The effect of xylanase treatment (50U/g pulp) on hardwood pulp was significant. A decrease of 2.5 units in kappa number was achieved (26% of delignification) suggesting that the xylanase from B. pumilus has a great potential in kraft pulp bleaching. / Mestrado / Mestre em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-08Bitstream added on 2014-06-13T20:04:39Z : No. of bitstreams: 1 terrasan_crf_dr_rcla.pdf: 2923287 bytes, checksum: 6f131c106722e1d7349212e5619e3b4f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Xilanases e β-xilosidases são as principais enzimas responsáveis pela degradação da xilana, o segundo principal constituinte da parede celular vegetal. Tanto a produção destas enzimas por micro-organismos, quanto a caracterização bioquímica das mesmas têm sido amplamente estudadas devido às suas inúmeras aplicações biotecnológicas. Neste trabalho, as principais xilanase e β-xilosidase produzidas por uma linhagem de Penicillium janczewskii em meio de cultura líquido foram purificadas por métodos clássicos de purificação de proteínas, sendo, posteriormente, caracterizadas bioquimicamente. A xilanase apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 65 °C e a β-xilosidase em pH 5,0 e a 75 °C. Ambas as enzimas apresentaram características interessantes principalmente com relação à atividade ótima de ambas as enzimas em elevadas temperaturas, a prolongada estabilidade da β-xilosidase a 60 °C, e a estabilidade da xilanase em pH mais alcalinos, considerando-se algumas de suas possíveis aplicações. Visando uma futura aplicação, a produção destas enzimas foi avaliada em cultivos sólidos utilizando-se como substrato o bagaço de malte, resíduo da indústria cervejeira. As melhores condições para produção enzimática foram: utilização da umidade inicial do substrato de 50% fornecida com solução de sais de Vogel, tempo de cultivo de sete dias a 25 °C para produção de xilanases e a 20 °C para produção de b-xilosidases. O material fermentado apresentou aumento no teor protéico, na quantidade de alguns aminoácidos essenciais e ausência de micotoxinas. Ainda com um enfoque ambiental o filtrado de cultura de P. janczewskii, produzido em condições anteriormente selecionadas, foi aplicado no biobranqueamento de uma polpa kraft de eucalipto pré-branqueada com oxigênio, sendo realizados ensaios para seleção da concentração de xilanases e do tempo de reação / Xylanases and β-xylosidases are the main enzymes responsible for the degradation of xylan, the second main constituent of plant cell walls. The production of these enzymes by microorganisms, and their biochemical characterization has been extensively studied due to their wide range of biotechnological applications. In this work, the main xylanase and β-xylosidase produced in liquid cultures by a Penicillium janczewskii strain were purified by classical methods of protein purification, and further biochemically characterized. The xylanase showed optimal activity at pH 6.0 and 65 °C and β-xylosidases at pH 5.0 and 75 °C. Considering some possibilities of applications, the enzymes presented interesting characteristics especially in relation to the optimal activity at high temperatures, the prolonged stability of the β-xylosidase at 60 °C, and the stability of the xylanase in alkaline pH. Aiming at a future application, the production of these enzymes was investigated in solid state fermentation using brewer’s spent grain, a residue of the brewing industry, as substrate. The optimized conditions were: 50% initial substrate moisture supplied by Vogel’s salt solution, culturing for 7 days at 25 °C for xylanase production and at 20 °C for b-xylosidase production. The fermented substrate showed increase in protein content, in the amount of some essential amino acids, and absence of mycotoxins. Maintaining the environmental focus, the P. janczewskii crude filtrate, produced under previously selected conditions, was applied in the biobleaching of eucalyptus kraft pulp pre-bleached with oxygen. Trials were conducted for the selection of xylanase concentration and reaction time

Orientador: Roberto Ruller / Coorientador: Leticia Maria Zanphorlin Murakami / Banca: Mário Tyago Murakami / Banca: Clelton Santos / Resumo: O processamento da biomassa lignocelulósica para a produção do etanol de segunda geração (E2G) e outras aplicações requer enzimas termoestáveis capazes de operar sob altas temperaturas e longos períodos de incubação. Nesse contexto, reportamos aqui a validação experimental preliminar de uma abordagem in silico para a obtenção enzimas hidrolíticas termoestáveis. Simulações computacionais da endoxilanase GH11 de Bacillus subtilis (XBS) usando a metodologia de otimização de interações eletrostáticas (EIO) indicaram três resíduos (K99, R122 and K154) críticos para o aumento da termoestabilidade através da substituição de cargas. Assim, analisamos os efeitos da mutação K99E em diversas propriedades da XBS selvagem (XBSWT) e também de uma XBS obitida in vitro através de evolução dirigida (XBSM6). Após expressão heteróloga em células de Escherichia coli BL21 e purificação através de cromatografia de afinidade, realizamos a caracterização bioquímica e biofisica das enzimas. Além disso, conduzimos estudos de termotolerância incubando as enzimas em condições industriais (pH 4,8 e 50 °C). Finalmente, realizamos testes de suplementação de um coquetel enzimático comercial esperando obter melhoras no processo de hidrólise da biomassa. Os resultados mostraram que a mutação K99E foi capaz de aumentar a temperatura de desnaturação térmica (Tm) das enzimas em aproximadamente 1 °C e melhorar a termotolerância de XBSWT e XBSM6 sem alterar suas condições ótimas. Somado a isso, a enzima... / Abstract: Processing of lignocellulosic biomasses for second-generation bioethanol (SGB) production and others applications requires thermostable enzymes able of operating under high temperatures and long incubation periods. In this context, we report here the preliminary experimental validation of an in silico approach for engineering hydrolytic enzymes towards thermostability. Previous computational simulations of GH11 endo-xylanase from Bacillus subtilis (XBS) using the electrostatic interaction optimization (EIO) methodology indicated three amino acid residues (K99, R122 and K154) critical for increasing thermostability through charge replacement. Thus, we analyzed the effects of the K99E mutation on several proprietes of two XBS enzymes: the wild-type XBS (XBSWT) and an XBS obitited in vitro by directed evolution (XBSM6). After heterologous expression in Escherichia coli BL21 cells and purification by affinity chromatography, we performed the biochemical and biophysical characterization of enzymes. We also conducted thermotolerance studies, incubating the enzymes under industrial conditions (pH 4.8 and 50 ° C). Finally, we performed supplementation assays of a commercial enzyme cocktail hoping to obtain improvements in the biomass hydrolysis process. The results showed that the K99E mutation was able to increase the enzymes thermal denaturation temperature (Tm ) by approximately 1 °C and improve thermotolerance of XBSWT and XBSM6 without alter its optimum conditions. In addition, ... / Mestre

Complexos celulolíticos possuem aplicações principalmente nas indústrias alimentícia, do vestuário e do papel; entretanto, seu uso de maior potencial é a hidrólise da celulose, componente dos resíduos lignocelulósicos, visando à produção do etanol. Dentre os microorganismos produtores de celulases, destacam-se os mutantes do gênero Trichoderma, que são os mais estudados e utilizados industrialmente. Mutantes de Penicillium echinulatum também estão entre os micro-organismos atualmente estudados para a produção de celulases. Neste trabalho, são apresentados dados de produção de celulases por P. echinulatum em cultivos submersos em frascos agitados e em biorreatores com agitação mecânica e airlift de circulação interna, na presença de celulose e sorbitol. A caracterização do meio e o tempo de adição do indutor e fontes de carbono também foram estudados, inicialmente, em frascos sob agitação recíproca. As condições que apresentaram os melhores resultados em frascos foram testadas em biorreatores com agitação mecânica e airlift. Estudaram-se condições hidrodinâmicas, como velocidade de fluxo e aeração em biorreator airlift para a otimização da produção de celulases, bem como composições de meios em biorreator com agitação mecânica, onde o oxigênio dissolvido foi mantido em níveis mínimos de 20% da saturação. Como indicadores de avaliação, foram realizadas análises enzimáticas de FPA (atividade sobre papel filtro), β-glicosidase, endoglicanase e xilanase; concentração de biomassa; consumo da fonte de carbono e variação do pH. Os resultados obtidos em frascos sob agitação mostraram que sorbitol, ao ser empregado como substituto parcial da celulose, apresenta vantagem na produção enzimática e na reologia do cultivo. Também, constatou-se que o tempo de adição da celulose influencia a produção enzimática em cultivos submersos e que a lactose, associada ao sorbitol, promove maiores títulos enzimáticos. Em relação ao uso dos biorreatores, verificaram-se melhores resultados em airlift para o meio contendo 0,25% (m/v) de sorbitol e 0,75% (m/v) de celulose, quando comparado ao biorreator com agitação mecânica. Ensaios com alimentação em três estágios não apresentaram resultados relevantes quanto à produção enzimática e à produtividade volumétrica. Testes iniciados com sorbitol e alimentados com celulose apresentaram melhores resultados com relação aos realizados em regime de batelada. Ensaios iniciados com 0,25% (m/v) de sorbitol apresentaram maior produtividade volumétrica quando comparados aos iniciados com 1% (m/v). Constatou-se que a celulose pode ser substituída, também, por uma fonte de carbono insolúvel, de baixo custo e de fácil obtenção, o bagaço de cana de açúcar. Em frascos sob agitação, a atividade de celulases e xilanases em cultivos com bagaço apresentaram atividade similar a cultivos contendo celulose cristalina. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-29T19:10:52Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Carla Eliana Todero Ritter.pdf: 1645876 bytes, checksum: 6a9ed7c12fe070ac0185405e87dfc3f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-29T19:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Carla Eliana Todero Ritter.pdf: 1645876 bytes, checksum: 6a9ed7c12fe070ac0185405e87dfc3f6 (MD5) / Cellulolytic enzymes have many uses, particularly in the food, textile, and paper industries. However, their major potential use is in the hydrolysis of cellulose a component of lignocellulosic residues for ethanol fuel production. Among the cellulase-producing microorganisms, mutants of the Trichoderma genus are the most studied and most widely used in the industry. Penicillium echinulatum mutants are also among those microorganisms currently being studied for cellulase production. The present study provides data on cellulase production by P. echinulatum in submerged culture in flasks under agitation and in stirred tank and internal circulation airlift bioreactors, in the presence of cellulose and sorbitol. Medium composition and supplementation timing of inducers and carbon sources, initially for flasks under agitation, were also studied. Assay conditions showing the best results in flasks were tested in bioreactors with mechanical agitation and airlift. Hydrodynamic conditions, such as flow speed and aeration in airlift bioreactor for cellulase production optimization, as well as medium formulations in bioreactor with mechanical agitation, with oxygen maintained at a minimum 20% saturation level, were studied. Enzymatic analyses of FPA (filter paper activity), β-glucosidase, endogluconase, and xylanase; biomass concentration; carbon source consumption; and pH variation were used as evaluation indicators. Results obtained in flasks under agitation showed that sorbitol might be used as a partial substitute of cellulose, in favor of enzymatic production and cultivation rheology. It was further observed that cellulose supplementation influences the enzymatic production in submerged cultures, and that lactose in association with sorbitol produces higher enzymatic titers. With regard to bioreactors, the best results were obtained with the airlift bioreactor for a medium containing 0.25% (w/v) sorbitol and 0.75% (w/v) cellulose, when compared to the bioreactor with mechanical agitation. Assays with 3-phase supplementation did not show any relevant results with regard to enzymatic production and volumetric productivity. Assays initiated with sorbitol and supplemented with cellulose showed better results when compared to those conducted in the batch-production model. Assays initiated with 0.25% (w/v) sorbitol showed higher volumetric productivity compared to those initiated with 1% (w/v) sorbitol. It was found that cellulose might be replaced by sugar cane bagasse, a low-cost and readily available source of insoluble carbon.

O Penicillium echinulatwn linhagem 9A02Sl é um fungo filamentoso que apresenta um sistema celulolítico com potencial para aplicaqão em processos de degradação de materiais lignocelulósicos para produção de etanol. O crescente interesse nesse combustível e a abundância de materiais lignocelulósicos que podem ser usados como matéria-prima fez aumentar o interesse no estudo de celulases. Neste estudo, a linhagem 9A02Sl de Penicillium echinulatum foi cultivada em cultivos submersos em frascos mantidos sob agitação recíproca, com variações quanto às fontes de carbono. Além de crescimento, foram avaliadas as produções de celulases, ~-glicosidases e xilanases e a expressão das enzimas através ale zimogramas em géis de poliacrilamida para detemlinação da massa molecular. Observou-se que o crescimento micelial provocou a redução do pH do meio de cultivo, e que não está relacionado a produção de enzimas. A celulose apresentou-se como indutora para todas as enzimas analisadas. A carboximetilcelulose mostrou-se uma eficiente fonte de carbono para a produção de atividade sobre papel filtro, endoglicanases e xilanases, apesar do baixo crescimento micelial. Celobiose, glicerol e glicose estimularam a produção de ~glicosidases. Uma banda de atividade endoglicanêlsica de 74 kDa foi detectada nos zimogramas de todos os caldos enzimáticas obtidos na presença d1e diferentes fontes de carbono, sugerindo esta seja uma enzima constitutiva. A expressão da ~-glicosidase oconeu ao fmal do cultivo (5° e 6° dias), sendo que em todos os cultivos avaliados houve a expressão de uma banda de 220 kDa, indicando tratar-se de uma enzima constitutiva. A expressão de outras bandas com diferentes massas moleculares sugerem que diferentes genes, fotmats multiméricas ou modificações pós-traducionais estão envolvidos no perfil destas enzimas em Peni'cillium echinulatum. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-09-22T17:54:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Denise Zampieri.pdf: 18671785 bytes, checksum: 0c85c4e913bd6377f21bfe2a1fe9e8ff (MD5) / Made available in DSpace on 2015-09-22T17:54:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Denise Zampieri.pdf: 18671785 bytes, checksum: 0c85c4e913bd6377f21bfe2a1fe9e8ff (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq / The st:rain of Penicillium echinulatum 9A02Sl is a filamentous fungus that presents a cellulolytic system with potential application in processes of degradation of lignocellulosic materiais for ethanol production. The growing interest in fhel and the abundance of lignocellulosic materiais that can be used as raw material has inc:reased the interest in cellulases. In this study, the strain P echinulatum 9A02Sl was grown in submerged cultivation in agitated flasks in presence of different carbon sources. In addition to growth, it was evaluated the production of cellula.ses, Pglucosidases and xylanases, and enzyme expres:sion in activity polyacrylamide gels in order to detemlinate the molecular ma.ss. The mycelial growth decreased pH o f the medium and this fact was not related to enzyme production. The cellulose was an inducer for all the enzymes ana.lyzed. The carboximetilcellulose was found to be an effi[cient carbon source for production o f filter paper a.ctivity, endogluca.nases and xylanases, despite the low mycelial growth. Cellobiose, glycerol and glucose stimulated the production of P-glucosidases. An endoglucanase band of 74 kDa was detected in zymograms o f all enzyme broths obtained in the presence o f different carbon sources, suggesting it is a constitutive enzyme. The expression of P-glucosidase occuned at the end of cultivation (5 and 6 days), and in all medium that was evaluated was observed a 250 kDa band, indica.ting that this is a. constitutive enzyme. The expression of other bands with different molecular mass suggest that different genes, multimeric fonns or post-translational modifications are involved in the expression ofthese enzymes in P echinulatum.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-31Bitstream added on 2014-06-13T20:19:51Z : No. of bitstreams: 1 santos_eao_me_ilha.pdf: 4044422 bytes, checksum: c62efee73c7a71e03187bde6c4a67542 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Celulose e hemicelulose são os polissacarídeos mais encontrados em todo o mundo. Em plantas, a celulose e a hemicelulose estão situados entre a lignina formando as fibras de celulose. As enzimas hemicelulolíticas produzidas por micro-organismos têm atraído uma grande atenção desde a década passada, particularidade devida as suas características biotecnológicas em vários processos industriais como indústrias de alimentos, ração animal, etanol e papel e celulose. Assim neste trabalho foram isoladas linhagens fungicas de duas regiões de Cerrado, na qual oito linhagens fúngicas foram analisadas quanto ao perfil de produção enzimática sob fermentação em estado sólido, utilizando resíduo agroindustrial como substrato. Foram determinadas atividade enzimática para xilanase e CMCase. A melhor atividade enzimática para xilanase obteve-se a partir do fungo mesofílico Neosartorya spinosa P2D19 com 20,6 U ml-1 (133,0 U/g), após 72 horas de cultivo sob fermentação em estado sólido. A enzima mostrou-se mais ativa em pH 5,0, porém cerca de 85% da atividade foi mantida em pH 7,5. A temperatura ótima dessa xilanase foi em 60° C / Cellulose and hemicellulose are polysaccharides found all over the world. In plants, the cellulose and hemicellulose are localed between the lignin forming the cellulose fibers. Hemicellulolytic enzymes produced by microorganisms has attracted great attention over the past decade due to its special features in several biotechnological industrial processes such as food industries, animal feed, ethanol and pulp and paper. In this study, fungal strains were isolated from two Cerrado areas, from which eight fungal strains were analyzed for enzyme production profile in solid fermentation state using agro industrial residue as substrate. Enzyme activity was determined for xylanase and CMCase. The highest xylanase enzyme activity was obtained with fungi mesophilic Neosartorya spinosa strain P2D16 with 20.6 U.ml-1 (133 U/g) after 72 hours of cultivation under solid fermentation state. The enzyme was more active at pH 5.0, although of its 85% activit was maintained at pH 7.5. The optimum temperature for xylanase activity was 60° C

O Penicillium echinulatwn linhagem 9A02Sl é um fungo filamentoso que apresenta um sistema celulolítico com potencial para aplicaqão em processos de degradação de materiais lignocelulósicos para produção de etanol. O crescente interesse nesse combustível e a abundância de materiais lignocelulósicos que podem ser usados como matéria-prima fez aumentar o interesse no estudo de celulases. Neste estudo, a linhagem 9A02Sl de Penicillium echinulatum foi cultivada em cultivos submersos em frascos mantidos sob agitação recíproca, com variações quanto às fontes de carbono. Além de crescimento, foram avaliadas as produções de celulases, ~-glicosidases e xilanases e a expressão das enzimas através ale zimogramas em géis de poliacrilamida para detemlinação da massa molecular. Observou-se que o crescimento micelial provocou a redução do pH do meio de cultivo, e que não está relacionado a produção de enzimas. A celulose apresentou-se como indutora para todas as enzimas analisadas. A carboximetilcelulose mostrou-se uma eficiente fonte de carbono para a produção de atividade sobre papel filtro, endoglicanases e xilanases, apesar do baixo crescimento micelial. Celobiose, glicerol e glicose estimularam a produção de ~glicosidases. Uma banda de atividade endoglicanêlsica de 74 kDa foi detectada nos zimogramas de todos os caldos enzimáticas obtidos na presença d1e diferentes fontes de carbono, sugerindo esta seja uma enzima constitutiva. A expressão da ~-glicosidase oconeu ao fmal do cultivo (5° e 6° dias), sendo que em todos os cultivos avaliados houve a expressão de uma banda de 220 kDa, indicando tratar-se de uma enzima constitutiva. A expressão de outras bandas com diferentes massas moleculares sugerem que diferentes genes, fotmats multiméricas ou modificações pós-traducionais estão envolvidos no perfil destas enzimas em Peni'cillium echinulatum. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq / The st:rain of Penicillium echinulatum 9A02Sl is a filamentous fungus that presents a cellulolytic system with potential application in processes of degradation of lignocellulosic materiais for ethanol production. The growing interest in fhel and the abundance of lignocellulosic materiais that can be used as raw material has inc:reased the interest in cellulases. In this study, the strain P echinulatum 9A02Sl was grown in submerged cultivation in agitated flasks in presence of different carbon sources. In addition to growth, it was evaluated the production of cellula.ses, Pglucosidases and xylanases, and enzyme expres:sion in activity polyacrylamide gels in order to detemlinate the molecular ma.ss. The mycelial growth decreased pH o f the medium and this fact was not related to enzyme production. The cellulose was an inducer for all the enzymes ana.lyzed. The carboximetilcellulose was found to be an effi[cient carbon source for production o f filter paper a.ctivity, endogluca.nases and xylanases, despite the low mycelial growth. Cellobiose, glycerol and glucose stimulated the production of P-glucosidases. An endoglucanase band of 74 kDa was detected in zymograms o f all enzyme broths obtained in the presence o f different carbon sources, suggesting it is a constitutive enzyme. The expression of P-glucosidase occuned at the end of cultivation (5 and 6 days), and in all medium that was evaluated was observed a 250 kDa band, indica.ting that this is a. constitutive enzyme. The expression of other bands with different molecular mass suggest that different genes, multimeric fonns or post-translational modifications are involved in the expression ofthese enzymes in P echinulatum.

Complexos celulolíticos possuem aplicações principalmente nas indústrias alimentícia, do vestuário e do papel; entretanto, seu uso de maior potencial é a hidrólise da celulose, componente dos resíduos lignocelulósicos, visando à produção do etanol. Dentre os microorganismos produtores de celulases, destacam-se os mutantes do gênero Trichoderma, que são os mais estudados e utilizados industrialmente. Mutantes de Penicillium echinulatum também estão entre os micro-organismos atualmente estudados para a produção de celulases. Neste trabalho, são apresentados dados de produção de celulases por P. echinulatum em cultivos submersos em frascos agitados e em biorreatores com agitação mecânica e airlift de circulação interna, na presença de celulose e sorbitol. A caracterização do meio e o tempo de adição do indutor e fontes de carbono também foram estudados, inicialmente, em frascos sob agitação recíproca. As condições que apresentaram os melhores resultados em frascos foram testadas em biorreatores com agitação mecânica e airlift. Estudaram-se condições hidrodinâmicas, como velocidade de fluxo e aeração em biorreator airlift para a otimização da produção de celulases, bem como composições de meios em biorreator com agitação mecânica, onde o oxigênio dissolvido foi mantido em níveis mínimos de 20% da saturação. Como indicadores de avaliação, foram realizadas análises enzimáticas de FPA (atividade sobre papel filtro), β-glicosidase, endoglicanase e xilanase; concentração de biomassa; consumo da fonte de carbono e variação do pH. Os resultados obtidos em frascos sob agitação mostraram que sorbitol, ao ser empregado como substituto parcial da celulose, apresenta vantagem na produção enzimática e na reologia do cultivo. Também, constatou-se que o tempo de adição da celulose influencia a produção enzimática em cultivos submersos e que a lactose, associada ao sorbitol, promove maiores títulos enzimáticos. Em relação ao uso dos biorreatores, verificaram-se melhores resultados em airlift para o meio contendo 0,25% (m/v) de sorbitol e 0,75% (m/v) de celulose, quando comparado ao biorreator com agitação mecânica. Ensaios com alimentação em três estágios não apresentaram resultados relevantes quanto à produção enzimática e à produtividade volumétrica. Testes iniciados com sorbitol e alimentados com celulose apresentaram melhores resultados com relação aos realizados em regime de batelada. Ensaios iniciados com 0,25% (m/v) de sorbitol apresentaram maior produtividade volumétrica quando comparados aos iniciados com 1% (m/v). Constatou-se que a celulose pode ser substituída, também, por uma fonte de carbono insolúvel, de baixo custo e de fácil obtenção, o bagaço de cana de açúcar. Em frascos sob agitação, a atividade de celulases e xilanases em cultivos com bagaço apresentaram atividade similar a cultivos contendo celulose cristalina. / Cellulolytic enzymes have many uses, particularly in the food, textile, and paper industries. However, their major potential use is in the hydrolysis of cellulose a component of lignocellulosic residues for ethanol fuel production. Among the cellulase-producing microorganisms, mutants of the Trichoderma genus are the most studied and most widely used in the industry. Penicillium echinulatum mutants are also among those microorganisms currently being studied for cellulase production. The present study provides data on cellulase production by P. echinulatum in submerged culture in flasks under agitation and in stirred tank and internal circulation airlift bioreactors, in the presence of cellulose and sorbitol. Medium composition and supplementation timing of inducers and carbon sources, initially for flasks under agitation, were also studied. Assay conditions showing the best results in flasks were tested in bioreactors with mechanical agitation and airlift. Hydrodynamic conditions, such as flow speed and aeration in airlift bioreactor for cellulase production optimization, as well as medium formulations in bioreactor with mechanical agitation, with oxygen maintained at a minimum 20% saturation level, were studied. Enzymatic analyses of FPA (filter paper activity), β-glucosidase, endogluconase, and xylanase; biomass concentration; carbon source consumption; and pH variation were used as evaluation indicators. Results obtained in flasks under agitation showed that sorbitol might be used as a partial substitute of cellulose, in favor of enzymatic production and cultivation rheology. It was further observed that cellulose supplementation influences the enzymatic production in submerged cultures, and that lactose in association with sorbitol produces higher enzymatic titers. With regard to bioreactors, the best results were obtained with the airlift bioreactor for a medium containing 0.25% (w/v) sorbitol and 0.75% (w/v) cellulose, when compared to the bioreactor with mechanical agitation. Assays with 3-phase supplementation did not show any relevant results with regard to enzymatic production and volumetric productivity. Assays initiated with sorbitol and supplemented with cellulose showed better results when compared to those conducted in the batch-production model. Assays initiated with 0.25% (w/v) sorbitol showed higher volumetric productivity compared to those initiated with 1% (w/v) sorbitol. It was found that cellulose might be replaced by sugar cane bagasse, a low-cost and readily available source of insoluble carbon.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:03:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3025_1.pdf: 1641923 bytes, checksum: eebfd9fe41f05ee2cb2a6c66f3c18bd4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Trichosporon são leveduras pertencentes ao filo Basidiomycota, algumas espécies são destacadas na atividade proteolítica, xilanolítica dentre outras enzimas. Os objetivos deste estudo foram verificar a viabilidade, autenticar a taxonomia, caracterizar quanto à capacidade queratinolítica e/ou queratinofílica em meio sólido e cultivo submerso, selecionar isolados em meio sólido e em fermentação por cultura submersa para a produção de xilanases e otimizar as condições de produção de xilanases em culturas de Trichosporon preservados sob óleo mineral na Micoteca URM. Foram realizadas a reativação e autenticação das culturas através das características morfofisiológicas. Para caracterização queratinolítica e/ou queratinofílica e xilanolítica foram utilizados como substratos penas de aves e xilana em meio sólido e no cultivo submerso foram utilizados como fontes de carbono penas de aves e xilose respectivamente. Para determinação das melhores condições de produção de xilanases foi realizado planejamento fatorial completo (24). Das 22 amostras mantidas na Micoteca URM, 91% permaneceram viáveis e foram autenticadas confirmando a espécie depositada. Os vinte isolados viáveis foram capazes de colonizar as penas, apresentando atividade queratinofílica. Em meio sólido, todas as culturas apresentaram crescimento, sem presença de halo de degradação, contudo em cultivo submerso, todas as culturas apresentaram atividade queratinolítica, sendo T. aquatile URM4440 com 2,65 U/mL o melhor produtor que apresentou atividade ótima em pH 8,6 a 40°C. Na detecção da atividade xilanolítica, 12 culturas apresentaram halo de degradação, sendo selecionadas para teste em cultivo submerso. Em meio líquido, o isolado T. cutaneum URM4789 com 24,25 U/mL foi o melhor produtor, o qual apresentou atividade ótima em pH 6,0 a 60°C, sendo selecionado para otimização das condições de produção de xilanases. O melhor resultado das condições de produção da atividade xilanolítica foi obtido no ensaio 13, nas seguintes condições: tempo de 96 horas; concentração de xilose 1,5%; ausência de extrato de levedura; pH 7,0 e temperatura 27°C, nessas condições 65,15 U/mL de atividade enzimática foi obtida. As variáveis, concentração de xilose, temperatura e o pH mostraram efeito significativo sobre a produção de xilanases. Dentre as espécies avaliadas, T. aquatile URM4440 e T. cutaneum URM4789 apresentaram os melhores resultados quanto às atividades queratinolíticas e xilanolíticas respectivamente

Orientador: Telma Teixeira Franco / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-25T20:58:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bim_MonicaAndrea_M.pdf: 4401190 bytes, checksum: 58cf555e454e041ffe09f9a7a32378ae (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A xilana, a qual é hidrolisada pela xilanase, é um abundante biopolímero encontrado no tecido de vegetais como constituinte principal da parede celular. Muitas das xilanases comercialmente disponíveis são produzidas por fungos com atividade ótima a pHs ácidos ou neutros e a temperaturas abaixo de 45°C. Existem várias aplicações para a xilanase, mas o seu maior potencial de uso é na industria de papel e celulose nos processos de branqueamento da polpa. Deste modo, xilanases ativas em condições alcalinas são potencialmente úteis nos processos de branqueamento de polpa de papel sem necessidade de mudanças no pH do processo e com a vantagem de diminuir a quantidade de componentes organoclorados nos efluentes das indústrias de papel. As duas motivações principais deste trabalho foram: primeiro, utilizar sistema de duas fases aquosas (SDFA) para extrair e purificar a xilanase do caldo de fermentação, produzido por Bacillus pumilus, pois o uso de SDFA pode ser uma alternativa mais econômica e de fácil operação, para purificação de bioprodutos, visto que as etapas de extração e purificação representam até 80% do custo destes bioprodutos. Segundo, aplicar a xilanase no branqueamento da polpa kraft de eucalipto visando a redução de organoclorados no efluente das indústrias de papel e celulose ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Xylan, a group of heteropolysaccharides, is an abundant biopolymer found in plant tissues as major component of cell wall, which is hydrolysed by xylanase. Several of the xylanases commercially available produced by fungi are active at neutral or acidic pH and their optimum temperature is below 45°C. Various applications for xylanases in bioconversion and food industries have been suggested and one of the major potential applications of xylanases involves the pulp and paper industry. This way, enzymes which are active at alkaline conditions have great potential in bleaching process without any need for changes in pH and with the advantage in lowering the release of polluting organic chlorine compounds. The two main motivations of this work was: first, to extract and to purify the enzyme from the crude fermentation broth, produced by Bacillus pumilus, using aqueous two phase systems (ATPS). Second, application ofxylanase ftom crude fermentation broth at hardwood kraft pulp bleaching. The enzyme from crude fermentation broth was extracted by partitioning in ATPS composed of phosphate and polyethyleneglycol (pEG). The effect of tie-line length, PEG molecular weight and NaCl and phosphate concentrations upon the purification factors and yields of xylanase were investigated by statistical design. The best system studied was that one containing 22% PEG6000, 10%¿K IND. 2¿¿HP¿O IND. 4¿ and 12% NaCl with a purification factor of 40 and 97% yield of enzyme activity ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Engenharia Química