Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6491_1.pdf: 275857 bytes, checksum: 11202234a898c95248b39df4d5ac3e07 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Queratinases são enzimas que catalisam hidrólise de proteínas, possuindo grande especificidade por queratina. Essas enzimas são produzidas por um grande número de microrganismos, dentre eles, os fungos dermatófitos são os de maior importância. O potencial de aplicação biotecnológica das queratinases é amplo, podendo estas atuarem na medicina e em diversos setores industriais, como também em processos de biorremediação. Este trabalho teve como objetivo estudar amostras de dermatófitos quanto à produção de queratinase e dentre elas, eleger a melhor produtora para caracterização parcial desta enzima. A determinação qualitativa da atividade queratinolítica foi avaliada em meio sólido contendo como única fonte de carbono e nitrogênio a queratina, onde as amostras Microsporum canis 4962 e Trichophyton mentagrophytes 4156 demonstraram maior atividade queratinolítica dentro de cada gênero. Para determinação quantitativa da atividade queratinolítica, foi realizado a produção da enzima em cultivo submerso, onde o meio liquido contendo sais e queratina de penas foi utilizado. O cultivo foi realizado durante 25 dias, a 28 C em agitador orbital (120rpm), onde avaliou-se a concentração protéica, atividade proteásica, variação do pH e peso seco. O extrato bruto da amostra melhor produtora (Microsporum canis 4962) foi utilizado para caracterização parcial da enzima. A queratinase da amostra Microsporum canis 4962 apresentou uma temperatura ótima a 80ºC e uma termoestabilidade a altas temperaturas (70-90ºC) retendo cerca de 42% de sua atividade nesta faixa de temperatura. A maior atividade foi obtida no pH 9,0 apresentando cerca de 60 % de atividade na faixa alcalina de pH. Os dados obtidos do efeito dos inibidores de proteases mostraram que a queratinase em estudo trata-se de uma serino protease

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:03:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3025_1.pdf: 1641923 bytes, checksum: eebfd9fe41f05ee2cb2a6c66f3c18bd4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Trichosporon são leveduras pertencentes ao filo Basidiomycota, algumas espécies são destacadas na atividade proteolítica, xilanolítica dentre outras enzimas. Os objetivos deste estudo foram verificar a viabilidade, autenticar a taxonomia, caracterizar quanto à capacidade queratinolítica e/ou queratinofílica em meio sólido e cultivo submerso, selecionar isolados em meio sólido e em fermentação por cultura submersa para a produção de xilanases e otimizar as condições de produção de xilanases em culturas de Trichosporon preservados sob óleo mineral na Micoteca URM. Foram realizadas a reativação e autenticação das culturas através das características morfofisiológicas. Para caracterização queratinolítica e/ou queratinofílica e xilanolítica foram utilizados como substratos penas de aves e xilana em meio sólido e no cultivo submerso foram utilizados como fontes de carbono penas de aves e xilose respectivamente. Para determinação das melhores condições de produção de xilanases foi realizado planejamento fatorial completo (24). Das 22 amostras mantidas na Micoteca URM, 91% permaneceram viáveis e foram autenticadas confirmando a espécie depositada. Os vinte isolados viáveis foram capazes de colonizar as penas, apresentando atividade queratinofílica. Em meio sólido, todas as culturas apresentaram crescimento, sem presença de halo de degradação, contudo em cultivo submerso, todas as culturas apresentaram atividade queratinolítica, sendo T. aquatile URM4440 com 2,65 U/mL o melhor produtor que apresentou atividade ótima em pH 8,6 a 40°C. Na detecção da atividade xilanolítica, 12 culturas apresentaram halo de degradação, sendo selecionadas para teste em cultivo submerso. Em meio líquido, o isolado T. cutaneum URM4789 com 24,25 U/mL foi o melhor produtor, o qual apresentou atividade ótima em pH 6,0 a 60°C, sendo selecionado para otimização das condições de produção de xilanases. O melhor resultado das condições de produção da atividade xilanolítica foi obtido no ensaio 13, nas seguintes condições: tempo de 96 horas; concentração de xilose 1,5%; ausência de extrato de levedura; pH 7,0 e temperatura 27°C, nessas condições 65,15 U/mL de atividade enzimática foi obtida. As variáveis, concentração de xilose, temperatura e o pH mostraram efeito significativo sobre a produção de xilanases. Dentre as espécies avaliadas, T. aquatile URM4440 e T. cutaneum URM4789 apresentaram os melhores resultados quanto às atividades queratinolíticas e xilanolíticas respectivamente

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:03:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1611_1.pdf: 1139279 bytes, checksum: 13fba9643abab60fece169537288d269 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os fungos queratinolíticos ocorrem em muitos habitats naturais e sintéticos. Estes microrganismos existem juntos a outros fungos que possuem uma baixa atividade pela queratina e utilizam principalmente os produtos de sua decomposição. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a capacidade queratinofílica e queratinolítica de fungos filamentosos isolados de amostras de água de piscinas e de solo dos filtros destas piscinas em parques aquáticos de Recife-PE, selecionar a linhagem mais promissora para a produção da queratinase, avaliar parâmetros de melhores condições para produção dessa enzima e incorporar as amostras ao acervo da Micoteca URM/UFPE. As culturas foram isoladas da água de piscinas e do solo dos filtros de piscinas do parque aquático I e apenas água de piscinas dos parques aquáticos II e III, utilizando-se as técnicas Hair Bait e diluição de água e suspensão de solo dos filtros em água destilada esterilizada. A identificação foi efetuada através de observações das características macroscópicas e microscópicas das colônias. Para selecionar a linhagem mais promissora foi utilizado o meio líquido contendo sais e pena de frango. O estudo das melhores condições de produção foi avaliado os seguintes parâmetros: temperatura, pH, tempo de produção, velocidade de agitação, concentração do substrato e quantidade do inóculo. As atividades queratinolítica e proteásica foram determinadas espectrofotometricamente a 280 e 440 nm, respectivamente. Utilizando as técnicas Hair Bait e diluição e suspensão e plaqueamento em superfície, foram isoladas 49 espécies de fungos provenientes da água e do solo dos filtros das piscinas do parque I, e 31 espécies provenientes da água do parque II e 33 do parque aquático III. Dentre as espécies estudadas para a atividade queratinolítica Paecilomyces farinosus apresentou o melhor resultado com 4,2 U/mL de atividade enzimática. As melhores condições para a produção de queratinases são: pH 7,8, 30 °C, 180 rpm, 2,0% de pena de frando, 105 esporos/mL por quatro dias. A condição adequada para se ter uma maior produção de proteases, com menor custo, seria com pH 6,2, 30 °C, 180 rpm, 2,0% de pena de frango, 105 esporos/mL por 4 dias. Em todas as amostras o resultado da atividade proteásica obtido foi menor que 1 U/mL, comprovando que para a degradação da queratina é necessário uma atividade proteolítica bastante específica. A água e o solo dos filtros das piscinas são ricos em fungos potencialmente patógenos ao homem

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-09T13:41:06Z No. of bitstreams: 1 Patyanne Carvalho Correia.pdf: 804722 bytes, checksum: 984e0900e0184bfd493feebf393b0390 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-09T13:41:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Patyanne Carvalho Correia.pdf: 804722 bytes, checksum: 984e0900e0184bfd493feebf393b0390 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / Keratinase are proteolytic enzymes whose substrate are a group of fibers and insoluble proteins denominate keratin. Some several micro-organisms such as fungi are capable to produce keratinase and to hydrolyze disulfide bonds present in keratinous substrates. The aim of this study was to select a producer keratinase and develop an integrated system which combines production, extraction and purification of keratinase by extractive fermentation in aqueous two-phase system (ATPS), prepared with polyethylene glycol (PEG) and citrate salts. Were observed the fermentation with Aspergillus sp SIS 11 was the higher producer of keratinases (7.65 U / mL), which the best conditions for enzyme production showed feather 0.5% o and pH 9.0. An ATPS which is composed of 20% (w/w) PEG 400 molar mass (g/mol), pH 8.0, 20% (w / w) sodium citrate, provided the best conditions for extractive keratinase production. Promoting greater (purification) 7.41, partition coefficient 0.74 and enzyme recovery 503.6%. In extractive fermentation enzyme produced presented partition coefficient K = 1.39 and enzyme recovery 65.08%. The studied strain was effective for enzyme production and biotechnological potential to use in animal feed. / Queratinases são enzimas proteolíticas que tem como substrato um grupo de proteínas fibrosas e insolúveis denominadas queratinas. Alguns micro-organismos como fungos excretam queratinases capazes de hidrolisar as ligações peptídicas presentes na queratina, principal componente das penas de aves. Diante do contexto, o presente trabalho teve como objetivo selecionar um micro-organismo produtor de queratinases, bem como desenvolver um processo integrado de produção, extração e purificação da queratinase por fermentação extrativa em sistema de duas fases aquosas (SDFA), preparados com polietileno glicol (PEG) e sais citrato. A linhagem Aspergillus sp SIS 11 foi a melhor produtora de queratinases (7,65 U/mL), nas quais as melhores condições para produção da enzima apresentavam 0,5% de pena e pH 9,0. As melhores condições de extração das enzimas em SDFA foram obtidas com 20% de PEG com massa molar 400 (g/mol), pH 8,0, 20% (m/m) de citrato de sódio, promovendo assim aumento da pureza de 7,41, coeficiente de partição de 0,74 e recuperação de 503,6%. Na fermentação extrativa a enzima produzida apresentou coeficiente de partição K =1,39 e recuperação de 65,08%. A linhagem estudada mostrou-se eficaz para a produção da enzima e potencial biotecnológico para aplicação em ração animal.

Os fungos dermatófitos são caracterizados pela capacidade de invadir os tecidos queratinizados, usando queratina como principal fonte de nutrientes. Ao invadirem os tecidos hospedeiros eles causam um tipo de micose chamada de dermatofitose. Dentre os dermatófitos, a espécie Trichophyton rubrum é o causador mais comum de tinea pedis, tinea unguium, tinea cruris e tinea corporis, sendo considerado um fungo antropofílico e cosmopolita. Entretanto, o conhecimento da interação deste patógeno com o hospedeiro é escasso. Devido à importância clínica de T. rubrum, este trabalho analisou a composição de aminoácidos de proteínas queratinas oriundas de Homo sapiens e Bos taurus e a expressão de genes envolvidos na degradação de queratina, metabolismo e controle do ciclo celular. O perfil de expressão dos genes sub3 e sub5 que codificam para queratinases, mad2 e mad2B que codificam proteínas envolvidas no controle da mitose, e os genes idh1 (subunidade regulatória da isocitrato desidrogenase - NAD+), idh2 (subunidade catalítica da isocitrato desidrogenase - NAD+), idhp (isocitrato desidrogenase - NADP+), icl (isocitrato liase) e meicl (metilisocitrato liase), que codificam proteínas envolvidas em vias metabólicas, foi analisado após o cultivo de T. rubrum em meios contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina. A atividade queratinolítica foi avaliada após o cultivo de T. rubrum nesses meios e também em unha humana. Além disto, o efeito do antifúngico terbinafina na atividade queratinolítica e na expressão dos genes sub3 e sub5 foi analisado em meios contendo unha humana ou queratina. Após o cultivo de T. rubrum a atividade das enzimas IDH e IDHP componentes do ciclo de Krebs, ICL do ciclo do glioxilato e MeICL do ciclo do metilcitrato também foram avaliadas. Essas análises revelaram que a variação da fonte nutricional, do pH do meio de cultivo, e a presença/ausência do fator de transcrição PacC, proporcionam às diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1) uma modulação diferenciada do acúmulo de transcritos dos genes, bem como da atividade queratinolítica e atividade das enzimas IDH, IDHP, ICL e MeICL. Outro fenômeno verificado foi que o antifúngico terbinafina afeta o acúmulo de transcritos dos genes sub3 e sub5, e a atividade queratinolítica de acordo com a fonte nutricional e a linhagem de T. rubrum. Além disso, em condições de estresse por pH alcalino a enzima IDHP é preferencialmente requisitada para manutenção do ciclo de Krebs, sendo que a linhagem mutante pacC-1 requisita em maior proporção as vias anapleróticas do que a linhagem selvagem H6. É importante enfatizar que a enzima ICL de T. rubrum possui atividade enzimática regulada por fosforilação, sendo sua atividade reduzida por esta modificação pós traducional. A identificação deste mecanismo de regulação da ICL por fosforilação e as análises dos transcritos de icl sugerem que em T. rubrum a regulação do fluxo de carbono no ciclo do glioxilato ocorra tanto em nível transcricional como pós-traducional. Os resultados obtidos possibilitaram ainda propor o primeiro modelo para T. rubrum que relaciona vias metabólicas, amparado por dados experimentais obtidos após o cultivo deste dermatófito em queratina. / Dermatophytes are fungi characterized by the ability to invade keratinized tissues using keratin as a major source of nutrients. When they invade host tissues they cause a type of ringworm called dermatophytosis. Among the dermatophytes, the species Trichophyton rubrum is the most common cause of tinea pedis, tinea unguium, tinea cruris, and tinea corporis, being considered an anthropophilic and cosmopolitan fungus. However, the knowledge of the interaction of this pathogen with the host is scarce. Due to the clinical importance of T. rubrum, this study analyzed the amino acid composition of keratin proteins derived from Homo sapiens and Bos taurus, and the expression of genes involved in keratin degradation, metabolism, and cell cycle control. The expression profile of the sub3 and sub5 genes, encoding keratinases, mad2 and mad2B, encoding proteins involved in the control of mitosis, and the genes idh1 (regulatory subunit of NAD+ -isocitrate dehydrogenase), idh2 (catalytic subunit of NAD+ -isocitrate dehydrogenase), idhp (NADP+ - isocitrate dehydrogenase), icl (isocitrate lyase), and meicl (metilisocitrate lyase), which encode proteins involved in metabolic pathways, was analyzed after cultivation of T. rubrum in media containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin. The keratinolytic activity was evaluated after cultivation of T. rubrum in these media and also in human nail. Furthermore, the effect of the antifungal agent terbinafine in keratinase activity and sub3 and sub5 gene expression was analyzed in media containing human nail or keratin. After culturing T. rubrum the enzyme activity of IDH and IDHP, components of the Krebs cycle, ICL of the glyoxylate cycle, and MeICL of the metilcitrato cycle were also evaluated. These analyses revealed that the variation in the nutritional source, the pH of the medium, and the presence/absence of the transcription factor PacC, provide to the different T. rubrum strains used in this study (CBS, H6 and pacC-1) differential modulation of transcripts accumulation of the genes, as well as keratinolytic activity and enzymatic activities of IDH, IDHP, ICL and MeICL. Another phenomenon observed was that the antifungal terbinafine affects the accumulation of transcripts of the genes sub3, sub5, and the keratinolytic activity according to nutritional source and T. rubrum strain. In addition, in stress conditions by alkaline pH the IDHP enzyme is preferably required for maintenance of the Krebs cycle, and the mutant pacC-1 requests the anaplerotic pathways in greater proportion than the wild type strain H6. It is important to emphasize that T. rubrum ICL enzyme has its enzymatic activity regulated by phosphorylation, being reduced by this post translational modification. The identification of this regulation mechanism by phosphorylation of ICL and icl transcripts analysis suggest that in T. rubrum the carbon flux regulation in the glyoxylate cycle occurs at both transcriptional and post-translational levels. The results also made possible the proposition of the first model for T. rubrum correlating metabolic pathways, supported by experimental data obtained after cultivation of this dermatophyte in keratin.

Os fungos dermatófitos são caracterizados pela capacidade de invadir os tecidos queratinizados, usando queratina como principal fonte de nutrientes. Ao invadirem os tecidos hospedeiros eles causam um tipo de micose chamada de dermatofitose. Dentre os dermatófitos, a espécie Trichophyton rubrum é o causador mais comum de tinea pedis, tinea unguium, tinea cruris e tinea corporis, sendo considerado um fungo antropofílico e cosmopolita. Entretanto, o conhecimento da interação deste patógeno com o hospedeiro é escasso. Devido à importância clínica de T. rubrum, este trabalho analisou a composição de aminoácidos de proteínas queratinas oriundas de Homo sapiens e Bos taurus e a expressão de genes envolvidos na degradação de queratina, metabolismo e controle do ciclo celular. O perfil de expressão dos genes sub3 e sub5 que codificam para queratinases, mad2 e mad2B que codificam proteínas envolvidas no controle da mitose, e os genes idh1 (subunidade regulatória da isocitrato desidrogenase - NAD+), idh2 (subunidade catalítica da isocitrato desidrogenase - NAD+), idhp (isocitrato desidrogenase - NADP+), icl (isocitrato liase) e meicl (metilisocitrato liase), que codificam proteínas envolvidas em vias metabólicas, foi analisado após o cultivo de T. rubrum em meios contendo glicose, glicina, glicose com glicina, ou queratina. A atividade queratinolítica foi avaliada após o cultivo de T. rubrum nesses meios e também em unha humana. Além disto, o efeito do antifúngico terbinafina na atividade queratinolítica e na expressão dos genes sub3 e sub5 foi analisado em meios contendo unha humana ou queratina. Após o cultivo de T. rubrum a atividade das enzimas IDH e IDHP componentes do ciclo de Krebs, ICL do ciclo do glioxilato e MeICL do ciclo do metilcitrato também foram avaliadas. Essas análises revelaram que a variação da fonte nutricional, do pH do meio de cultivo, e a presença/ausência do fator de transcrição PacC, proporcionam às diferentes linhagens de T. rubrum utilizadas neste trabalho (CBS, H6 e pacC-1) uma modulação diferenciada do acúmulo de transcritos dos genes, bem como da atividade queratinolítica e atividade das enzimas IDH, IDHP, ICL e MeICL. Outro fenômeno verificado foi que o antifúngico terbinafina afeta o acúmulo de transcritos dos genes sub3 e sub5, e a atividade queratinolítica de acordo com a fonte nutricional e a linhagem de T. rubrum. Além disso, em condições de estresse por pH alcalino a enzima IDHP é preferencialmente requisitada para manutenção do ciclo de Krebs, sendo que a linhagem mutante pacC-1 requisita em maior proporção as vias anapleróticas do que a linhagem selvagem H6. É importante enfatizar que a enzima ICL de T. rubrum possui atividade enzimática regulada por fosforilação, sendo sua atividade reduzida por esta modificação pós traducional. A identificação deste mecanismo de regulação da ICL por fosforilação e as análises dos transcritos de icl sugerem que em T. rubrum a regulação do fluxo de carbono no ciclo do glioxilato ocorra tanto em nível transcricional como pós-traducional. Os resultados obtidos possibilitaram ainda propor o primeiro modelo para T. rubrum que relaciona vias metabólicas, amparado por dados experimentais obtidos após o cultivo deste dermatófito em queratina. / Dermatophytes are fungi characterized by the ability to invade keratinized tissues using keratin as a major source of nutrients. When they invade host tissues they cause a type of ringworm called dermatophytosis. Among the dermatophytes, the species Trichophyton rubrum is the most common cause of tinea pedis, tinea unguium, tinea cruris, and tinea corporis, being considered an anthropophilic and cosmopolitan fungus. However, the knowledge of the interaction of this pathogen with the host is scarce. Due to the clinical importance of T. rubrum, this study analyzed the amino acid composition of keratin proteins derived from Homo sapiens and Bos taurus, and the expression of genes involved in keratin degradation, metabolism, and cell cycle control. The expression profile of the sub3 and sub5 genes, encoding keratinases, mad2 and mad2B, encoding proteins involved in the control of mitosis, and the genes idh1 (regulatory subunit of NAD+ -isocitrate dehydrogenase), idh2 (catalytic subunit of NAD+ -isocitrate dehydrogenase), idhp (NADP+ - isocitrate dehydrogenase), icl (isocitrate lyase), and meicl (metilisocitrate lyase), which encode proteins involved in metabolic pathways, was analyzed after cultivation of T. rubrum in media containing glucose, glycine, glucose and glycine, or keratin. The keratinolytic activity was evaluated after cultivation of T. rubrum in these media and also in human nail. Furthermore, the effect of the antifungal agent terbinafine in keratinase activity and sub3 and sub5 gene expression was analyzed in media containing human nail or keratin. After culturing T. rubrum the enzyme activity of IDH and IDHP, components of the Krebs cycle, ICL of the glyoxylate cycle, and MeICL of the metilcitrato cycle were also evaluated. These analyses revealed that the variation in the nutritional source, the pH of the medium, and the presence/absence of the transcription factor PacC, provide to the different T. rubrum strains used in this study (CBS, H6 and pacC-1) differential modulation of transcripts accumulation of the genes, as well as keratinolytic activity and enzymatic activities of IDH, IDHP, ICL and MeICL. Another phenomenon observed was that the antifungal terbinafine affects the accumulation of transcripts of the genes sub3, sub5, and the keratinolytic activity according to nutritional source and T. rubrum strain. In addition, in stress conditions by alkaline pH the IDHP enzyme is preferably required for maintenance of the Krebs cycle, and the mutant pacC-1 requests the anaplerotic pathways in greater proportion than the wild type strain H6. It is important to emphasize that T. rubrum ICL enzyme has its enzymatic activity regulated by phosphorylation, being reduced by this post translational modification. The identification of this regulation mechanism by phosphorylation of ICL and icl transcripts analysis suggest that in T. rubrum the carbon flux regulation in the glyoxylate cycle occurs at both transcriptional and post-translational levels. The results also made possible the proposition of the first model for T. rubrum correlating metabolic pathways, supported by experimental data obtained after cultivation of this dermatophyte in keratin.