Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema de plantas economicamente importantes, sendo responsável por diversas patogenias como a doença de Pierce em videiras e a clorose variegada dos citros (CVC). Plantas, ao serem infectadas por patógenos, dispõem de um maquinário de defesa que inclui a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Peróxidos de lipídios podem ser formados pelo ataque de ROS à membrana bacteriana ou pela ação de lipoxigenases. O sistema da AhpR (alquil hidroperóxido redutase) foi inicialmente caracterizado como o principal responsável pela defesa contra hidroperóxidos orgânicos em bactéria. Recentemente, foi descrito um gene em muitas bactérias patógenas no qual a sua deleção conferia a célula uma maior susceptibilidade a hidroperóxidos orgânicos, mas não a H2O2 ou a geradores de superóxido (Mongkolsuk et al., 1998 e Ochsner et al., 2001). Por esta razão, este gene foi denominado ohr (organic hydroperoxide resistance gene). O objetivo desse trabalho foi caracterizar funcionalmente a proteína ohr de X. fastidiosa. Inicialmente, demonstramos que ohr possui atividade peroxidase dependente de tiól sendo que sua capacidade de reagir com hidroperóxidos é devida á presença de um par de cisteínas conservadas em seu sítio ativo. Também mostramos que ohr possui um enovelamento alfa/beta único, não observado nas estruturas de outras peroxidases dependentes de tiól como peroxirredoxinas e glutationa peroxidases. Análises do sítio ativo de ohr mostraram que seus prováveis substratos são moléculas hidrofóbicas e alongadas. Corroborando esta hipótese, demonstramos que enzimas lipoiladas, classicamente relacionadas com o metabolismo intermediário, interagem física e funcionalmente com ohr, enquanto que os sistemas tiorredoxina e glutationa, classicamente relacionados a tióis peroxidases, não sustentam a atividade peroxidásica de ohr. Este resultado representa a primeira descrição de uma peroxidase que é diretamente reduzida por grupos lipóicos de enzimas. Também fornecemos evidências que indicam que ohr atua na redução de hidroperóxidos derivados de ácidos graxos insaturados. De fato, análise cinética de estado estacionário por bi substrato mostra que ohr decompõem hidroperóxidos orgânicos com alta eficiência (kcat/KM ~ 106M-1.s1) através de um mecanismo ping-pong, sendo aproximadamente dez mil vezes mais eficiente do que na presença de H2O2. Esses dados em conjunto mostram que ohr é central na resposta bacteriana contra o estresse induzido por hidroperóxidos orgânicos, mas não por H2O2 e define uma nova classe de enzimas antioxidantes com propriedade únicas: peroxidases dependentes de grupos lipóicos. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a via de regulação gênica de ohr em Xylella fastidiosa. Na maioria dos organismos, ohr é regulada por uma proteína repressora denominada ohrR (Sukchawalit et al., 2001), mas em algumas bactérias foi descrito que a expressão de ohr era regulada positivamente por um fator sigma alternativo (σE) de função extra citoplasmática (Gourion et al., 2008). Nossos resultados mostraram que ohr de X. fastidiosa não está sob controle de nenhuma dessas proteínas, sendo provavelmente expressa constitutivamente. Análises por northern blot não mostraram alterações nos níveis de ohr em células submetidas a estresse oxidativo ou etanólico. Esses resultados, ainda que preliminares, indicam que possivelmente o controle da expressão gênica de ohr em X. fastidiosa é distinto daqueles descritos até o momento na literatura para outras bactérias. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium, which colonizes the xylem from economically important plants, being responsible for several diseases such as Pierce disease (PD) in gravepines and citrus variegated clorosis (CVC). Plants, when infected by pathogens, are able to defend themselves through several mechanisms which include the generation of reactive oxygen species (ROS). Lipid hydroperoxides can be generated from the attack of ROS to the bacterial membrane or by the action of lipoxygenases. The alkyl hydroperoxide reductase system (AhpR) was initially characterized as the main responsible for the detoxification of organic hydroperoxides in bacteria. Recently, it was also characterized another gene in many pathogenic bacteria, whose deletion renders cells susceptibility to organic hydroperoxide treatments but not by H2O2 or by superoxide generators (Mongkolsuk et al., 1998 and Ochsner et al., 2001). For this reason, it was named ohr (organic hydroperoxide resistance gene). The goal of this work was to functionally characterize ohr, the product of ohr gene from Xylella fastidiosa. Initially, we demonstrated that ohr possesses Cys-based thiol-dependent peroxidase activity. Later, we showed that ohr possesses a unique alpha/beta fold not observed in the structures of other thiol peroxidases such as peroxiredoxins and glutathione peroxidases. Analyses of ohr active site showed that its likely substrates are elongated and hydrophobic molecules. Furthermore, we showed that lipoylated enzymes, classically related with the intermediary metabolism, interacts physically and functionally with ohr while classical thiol-dependent pathways, such as thioredoxin and glutathione, failed to support ohr activity. This finding represents the first evidence of a peroxidase that is directly reduced by lipoyl groups of enzymes. Also, we obtained evidences indicating that ohr acts in the detoxification of peroxides derived from unsaturated fatty acids. In fact, steady-state kinetics using bi-substrate analysis showed that ohr decomposes organic peroxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1 through a ping-pong mechanism, at least ten thousand times more efficiently than hydrogen peroxide (H2O2). All these results together shows that ohr is central in the response of bacteria to the stress induced by organic hydroperoxides but not by H2O2 and defines a new class of antioxidant enzymes with unique properties such as lipoyl-dependent peroxidase activity. Another goal of this work was to study the regulation of ohr expression in Xylella fastidiosa. ohr expression is regulated in most bacteria by a repressor protein named ohrR (Sukchawalit et al., 2001) but, in some bacteria, ohr expression is positively regulated by an alternative sigma factor (σE) with extracitoplasmatic function (Gourion et al., 2008). Our results showed that ohr from X. fastidiosa was not under the control of none of these regulators, probably being constitutively expressed. Through northern blot analysis, we did not observed any changes in ohr levels in cells submitted to oxidative or ethanolic stress. These results, indicates that ohr expression probably differs from that previously described on literature for other bacteria.

Xylella fastidiosa é o agente etiológico de diversas doenças em plantas, incluindo a Clorose Variegada dos Citros (CVC), uma séria ameaça à indústria citrícola. Os níveis de transcritos sob diferentes disponibilidades de ferro foram medidos com microarranjos de DNA representando 2608 (91,6%) sequências codificadoras (CDS) da cepa 9a5c de X. fastidiosa. Na presença de 100 uM pirofosfato férrico, 218 e 256 CDS foram consideradas como reguladas positiva e negativamente, respectivamente. Quando tratada com o quelante de ferro 2,2\'-dipiridil, 193 CDS foram consideradas como reguladas positivamente e 216 negativamente. A expressão diferencial de um subconjunto de 44 CDS foi também avaliada por RT-qPCR, que mostrou uma correlação de Pearson de 0,77 com os resultados dos microarranjos. As CDS diferencialmente expressas nas variações de concentração de ferro participam em diversas funções celulares. Muitas CDS envolvidas com funções regulatórias, patogenicidade e estrutura celular foram moduladas em ambas as condições testadas, sugerindo que grandes mudanças na arquitetura celular e metabolismo ocorrem quando células de X. fastidiosa são expostas a variações extremas na concentração de ferro. Interessantemente, as CDS moduladas incluem as de síntese e secreção de bacteriocinas similares à colicina tipo V e funções ligadas a formação de pilus e fímbria. Nós também investigamos a contribuição do regulador transcricional Fur no stimulon do ferro em X. fastidiosa. Para tal, as regiões promotoras do genoma da cepa 9a5c foram varridas em busca de Fur boxes putativas. Nossas análises identificaram que regiões promotoras de 49 CDS contem elementos com características de Fur boxes. A funcionalidade de pelo menos uma das Fur boxes identificadas foi confirmada através de ensaios de alteração de mobilidade eletroforética que demonstraram sua interação específica com a proteína recombinante Fur de X. fastidiosa. Entretanto, nem todos os genes cuja expressão é modulada por alterações na concentração de ferro, são diretamente regulados por Fur, apoiando a hipótese de que Fur não é o único responsável pela modulação do stimulon de ferro em X. fastidiosa. Em conjunto, nossos dados apresentam novas evidências da relação entre a disponibilidade de ferro e a regulação de determinantes de patogenicidade e virulência em X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the etiologic agent of a wide range of plant diseases including citrus variegated chlorosis (CVC), a major threat to citrus industry. Transcript levels in different iron availabilities were assessed with DNA microarrays representing 2608 (91.6%) coding sequences (CDS) of X. fastidiosa CVC strain 9a5c. In the presence of 100 uM of ferric pyrophosphate, 218 and 256 CDS were considered as up- and down-regulated, respectively. When treated with the iron chelator 2,2\'-dipyridyl, 193 CDS were considered as up-regulated and 216 as down-regulated. Differential expression for a subset of 44 CDS was further evaluated by RT-qPCR that showed a Pearson correlation of 0.77 with array results. The CDS differentially expressed upon the iron concentration shift participate in diverse cellular functions. Many CDS involved with regulatory functions, pathogenicity and cell structure, were modulated in both conditions tested suggesting that major changes in cell architecture and metabolism occur when X. fastidiosa cells are exposed to extreme variations in iron concentration. Interestingly, the modulated CDS include those related to colicin V-like bacteriocin synthesis and secretion and to pili/fimbriae functions. We also investigated the contribution of the ferric uptake regulator Fur to the iron stimulon of X. fastidiosa. Thus, the promoter regions of strain 9a5c genome were screened for putative Fur boxes. Our analyses identified Fur boxes-like elements in promoter regions of 49 CDS. The functionality of at least one Fur box was confirmed by electrophoretic mobility shift assays which demonstrated its interaction with X. fastidiosa recombinant Fur. However, not all genes that appeared to be modulated by iron concentration shift are directly regulated by Fur. This supports the hypothesis that Fur is not solely responsible for the modulation of the iron stimulon of X. fastidiosa. Taken together, our data present novel evidence for iron regulation of pathogenicity and virulence determinants in X. fastidiosa.

As flavoproteinas AhpF (Alquil Hidroperoxido Redutase subunidade F) e TrxR (Tiorredoxina Redutase) sao membros da familia piridina dissulfeto redutase e possuem atividade dissulfeto redutase as custas de NAD(P)H. A proteina TrxR e responsavel pela reducao de Tiorredoxina (Trx) que participa do ciclo catalitico de grande parte das enzimas da familia peroxirredoxina, alem de outras enzimas. AhpF e dedicada a reducao de AhpC, (Alquil Hidroperoxido Redutase subunidade C) uma peroxirredoxina exclusiva de bacterias, AhpC e AhpF juntas formam sistema AhpR (Alquil Hidroperoxido Redutase). AhpF possui dois dominios, Trx-like (N-terminal) e TrxR-like (C-terminal); sendo que a ultima possui alta similaridade de estrutura e sequencia a TrxR. De forma interessante AhpF possui atividade NADH-oxidase formadora de H2O2, enquanto TrxR nao possui. Provavelmente pequenas mudancas na sua estrutura contribuem para essa diferenca. A atividade NADH-oxidase esta presente em algumas flavoproteinas e esta geralmente centrada no anel de isoaloxazina do cofator FAD. Este anel quando no estado radicalar e chamado de semiquinona. A semiquinona pode estar protonada ou desprotonada, sendo que a ultima forma e relacionada com atividades oxidase e oxigenase de maneira geral, mas ainda nao existem regras claras a respeito da reatividade de flavoproteinas com o oxigenio. Para elucidar quais poderiam ser essas diferencas, nos clonamos os genes para as proteinas TrxR, AhpC e AhpF da bacteria fitopatogenica Xylella fastidiosa e os expressamos em Escherichia coli. Reconstituimos com sucesso o sistema AhpR in vitro, medindo o consumo de H2O2 na presenca de AhpC, AhpF e NADH atraves de eletrodos especificos para peroxido. Da mesma forma caracterizamos a atividade NADH-oxidase de AhpF medindo o consumo de oxigenio e a producao de peroxido de hidrogenio. Alem disso, demonstramos que a atividade NAD(P)H-oxidase e ausente em TrxR atraves de ensaios de consumo de NADH. A expressao de somente o dominio C-terminal de AhpF manteve a atividade NADH-oxidase como na proteina selvagem, levando a crer que sao diferencas no motivo TrxR-like que disparam a atividade NADH-oxidase. Analisando a sobreposicao de estruturas tridimensionais de AhpF e TrxR disponiveis no PDB em conjunto com o alinhamento de sequencia de aminoacidos destas proteinas em diferentes organismos, identificamos tres possiveis candidatos que poderiam estar envolvidos na atividade NADH-oxidase. Atraves de mutacao sitio dirigida, identificamos que a retirada do residuo de histidina entre o motivo CXXC de AhpF fez o mutante AhpF H347T apresentar metade da atividade especifica NADHoxidase. Da mesma forma a mutacao reversa em TrxR, adicionando o residuo de histidina no motivo CXXC levou a TrxR T142H apresentar uma atividade especifica significativamente maior que a TrxR selvagem. Os dados em conjunto sugerem que o residuo de histidina por sua natureza polar e relevante para a desprotonacao do anel de izoaloxazina do FAD, e a sua consequente reatividade com o oxigenio, sendo um fator importante para a atividade NADH-oxidase presente em AhpF / The flavoproteins AhpF (Alkylhydroperoxide reductase subunit F) and TrxR (Thioredoxin Reductase) are members of the nucleotide pyridine disulfide oxidoreductase family and possess disulfide reductase activity at the expense of NAD(P)H. The TrxR protein is responsible for the reduction of thioredoxin (Trx), which is used in the catalytic cycle of most peroxiredoxins, among other enzymes. AhpF is dedicated to reducing the bacterial peroxiredoxin AhpC, and together they form the AhpR system (Alkylhydroperoxide reductase system). AhpF has two domains, Trx-like (N-terminal) and TrxR-like (C-terminal); the latter has high of similarity to TrxR. Intriguingly, AhpF has an H2O2-forming NAD(P)H-dependent oxidase activity, while TrxR does not. Slight changes in the structures of these two enzymes probably account for this phenomenon. The NADH-oxidase activity is present in some flavoproteins and is generally centered in the isoalloxazine ring of the FAD cofactor. This ring in its radical state is called a semiquinone, which can be protonated or deprotonated. The deprotonated form is related to oxidase and oxygenase activities, but there are no clear rules as to the reactivity of flavoproteins and molecular oxygen. In order to elucidate these differences, we have cloned genes which code the proteins TrxR, AhpC and AhpF of the phytopathogenic bacteria Xylella fastidiosa and have expressed them in Escherichia coli. We have successfully reconstituted the AhpR system in vitro, measuring the H2O2 decrease in the presence of AhpC, AhpF and NADH, by using specific electrodes. We have similarly characterized the NADH-oxidase activity of AhpF by measuring the decrease in the levels of oxygen and the production of hydrogen peroxide. Furthermore, through assays measuring the consumption of NADH, we have demonstrated that the NAD(P)H-oxidase activity is non-existent in TrxR. The expression of only the C-terminal domain of AhpF showed NADH-oxidase activity similar to the wild-type protein, which indicated that the NADH-oxidase activity occurs due to differences in the TrxR-like motif. By analyzing the superposition of the threedimensional structures of AhpF and TrxR, as well as the alignment of their amino acid sequence in different organisms, we identified three possible candidates which could be involved in NADH-oxidase activity. Through site-directed mutation, we found that the removal of the histidine residue within the CXXC motif of AhpF caused the mutant AhpF H347T to present half of the NADH-oxidase specific activity, when compared to the wild-type protein. Likewise, the reverse mutation in TrxR, adding the histidine residue to the CXXC motif, caused TrxR T142H to have a significantly higher specific activity when compared to the wild-type TrxR. The data suggests that, because of its polar nature, the histidine residue is relevant to the deprotonation of the isoalloxazine ring of FAD and its reactivity to oxygen, and, therefore, is an important factor to the NADHoxidase activity of AhpF

Orientador: Mônica Alonso Cotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-09-02T14:12:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Munar_DuberMarcelMurillo_D.pdf: 4529701 bytes, checksum: 857481ff034498f82f42ab7dc98536b3 (MD5) Previous issue date: 2017 / Resumo: Neste trabalho estudamos características físico-químicas nos diferentes estágios de formação de biofilmes, principalmente no estágio inicial da adesão de bactérias planctônicas em superfícies. Usamos como modelo a bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa, que vive exclusivamente no xilema de diversas plantas lenhosas e é transmitido por diferentes insetos da ordem Hemíptera. As amostras analisadas neste estudo foram todas cultivadas sobre superfícies inorgânicas e após diferentes tempos de cultivo foram lavadas e secas antes de serem analisadas. Para estudar o processo integral de formação de biofilmes, examinamos amostras cultivadas sobre superfícies de vidro e Silício recoberto com ouro, em um meio de cultura complexo, chamado Periwinkle wilt. Através de técnicas como citoquímica, imunomarcação, microscopia e espectroscopia, analisamos os elementos produzidos pelas bactérias ou presentes na membrana celular durante cada estágio da formação de biofilmes. Conseguimos identificar espaço-temporalmente a aparição de pili, vesículas e três tipos diferentes de sustâncias poliméricas extracelulares, assim como algumas moléculas específicas que compõem estes elementos. Posteriormente, focalizamos nossos esforços no processo de adesão inicial em superfícies. Estudaram-se os três principais componentes envolvidos neste processo: adesinas, meio líquido e superfície. Primeiramente, se analisaram amostras de bactérias aderidas em superfícies de Silício. Nestas amostras aplicamos diferentes reagentes com a finalidade de investigar que tipo de ligação química está presente na interface adesina-superfície. Determinou-se que uma das ligações presentes nesta interface é a ligação glicosídica e que provavelmente está relacionada com as moléculas de lipopolissacarídeo localizadas na membrana bacteriana. A complexidade do meio de cultura fez que o estudo dos seus componentes fosse o elemento mais complicado de analisar. Inicialmente, deveram-se procurar as condições mínimas nas quais as bactérias sobrevivem, porém não conseguem aderir em superfícies. Assim, um meio de cultura complexo e definido, chamado Xylella fastidiosa Medium, foi modificado eliminando as componentes não relacionadas diretamente com a adesão bacteriana. Logo, adicionamos sistematicamente diferentes tipos de moléculas e/ou íons no meio de cultura simplificado identificando as condições que favorecem o processo de adesão. Encontramos uma dependência da adesão bacteriana com o pH do meio e a presença de cátions bivalentes com baixa energia de ionização. Como último parâmetro, estudamos a participação da superfície neste processo. Neste caso, além das superfícies de Silício, também usamos superfícies de Fosfeto de Índio para estudar o processo de adesão como função do pH do meio de cultura. A adesão nestas superfícies só apresentou diferenças significativas em um intervalo específico de pH. Analisando o conjunto de evidências obtidas em nossos experimentos, conseguiu-se formular um modelo que descreve este fenômeno tendo em conta todos os parâmetros estudados. Descreve-se o processo de adesão como a interação entre concentrações de duas espécies de moléculas diferentes alusivas à adesina e à superfície. Sugerimos que o processo de adesão pode ser tratado como um mecanismo puramente físico-químico e não biológico, razão pela qual nosso modelo poderia ser em teoria extrapolado a qualquer tipo de superfície e qualquer tipo de bactéria / Abstract: In this work we study physico-chemical characteristics in the different stages of biofilm formation, particularly in the early stages of adhesion of planktonic bacteria to surfaces. We use as model the phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa, which lives exclusively in the xylem of several woody plants and is transmitted by different insects of the order Hemiptera. The samples analyzed in this study were all grown on inorganic surfaces and after different culture times were washed and dried before being analyzed. To study the entire biofilm formation process, we examined samples grown on glass and silicon covered with gold surfaces in a complex culture medium called Periwinkle wilt. Through techniques such as cytochemistry, immunostaining, microscopy and spectroscopy, we analyze the elements produced by the bacteria or present in the cell membrane during each stage of biofilm formation. We have been able to identify space-temporally the appearance of pili, vesicles and three different types of extracellular polymeric substances, as well as some specific molecules that compose these elements. Subsequently, we focused our efforts on the initial cell binding process on surfaces. The three main components that intervene in this process were studied: adhesins, liquid medium and surface. First, samples of bacteria adhered to silicon surfaces were analyzed. In these samples, we applied different reagents to investigate the type of chemical bond present at the adhesin-surface interface. It has been determined that one of the bonds present at this interface is the glycosidic bond, which is probably related to the lipopolysaccharide molecules located in the bacterial membrane. The complexity of the culture medium made the study of its components the most complicated element to analyze. Initially, it was necessary to look for the minimum conditions in which the bacteria survive, but they cannot adhere to surfaces. Thus, a complex and defined culture medium, called Xylella fastidiosa Medium, was modified eliminating components not directly related to bacterial adhesion. Then, we systematically add different types of molecules and / or ions in the simplified culture medium, identifying the conditions that favor the adhesion process. We found a dependence of bacterial adhesion with the pH of the medium and the presence of bivalent cations with low ionization energy. As a final parameter, we studied the participation of the surface in this process. In this case, in addition to the Silicon surfaces, we also used Indium Phosphide surfaces to study the adhesion process as a function of the pH of the culture medium. Adhesion on these surfaces only showed significant differences over a specific pH range. Analyzing the set of evidences obtained in our experiments, we were able to formulate a model that describes this phenomenon taking into account all the parameters studied. The adhesion process is described as the interaction between concentrations of two different species of molecules alluding to adhesin and to the surface. We suggest that the adhesion process can be treated as a purely physico-chemical and non-biological mechanism, so that our model could in theory be extrapolated to any type of surface and any type of bacteria / Doutorado / Física / Doutor em Ciências / 1060584 / 2010/51748-7 / 479486/2012-3 / CAPES / FAPESP / CNPQ

A citricultura paulista pode ser considerada uma das mais competitivas e importantes atividades agroindustriais do Brasil, gerando aproximadamente 400 mil empregos e adicionando anualmente U$ 1,4 bilhões ao país. Entretanto ainda apresenta uma produtividade inferior àquela encontrada na Flórida, principalmente devido a deficiências nutricionais e hídricas e a doenças que há diversos anos atingem às lavouras. Nos últimos dez anos a clorose variegada dos citros (CVC), conhecida popularmente como a doença do amarelinho, apresenta-se como o principal problema, sendo a bactéria gram-negativa Xylella fastidiosa seu agente causal. Em vista da importância do cultivo da laranja no país, o projeto \"Genoma Xylella fastidiosa\" foi proposto, visando o seqüenciamento total do genoma deste fitopatógeno bem como o treinamento de pessoal capacitado na utilização das modernas técnicas de biologia molecular. Segmentos de DNA provenientes de 7 cosmídeos e diversos clones provenientes de bibliotecas de \"shotgun\" genômico foram seqüenciados em nosso laboratório, totalizando 271.220 pb do genoma da bactéria. Em seguida foi feita a anotação das orfs preditas por programa GLIMMER, sendo que em nosso laboratório foram anotadas aproximadamente 290 ORFs. Seqüenciamentos diretamente do genoma e de clones das bibliotecas de RDA foram também realizados, complementando as metodologias de primer walking e construção de bibliotecas de fago utilizadas em outros laboratórios do projeto para o fechamento de \"gaps\". Todos os resultados obtidos em nosso laboratório, somados às contribuições de todos os grupos do projeto, serão base para a melhor compreensão dos mecanismos utilizados pela bactéria, podendo favorecer o desenvolvimento de novas estratégias para o combate desta praga. / The São Paulo\'s citriculture can be considered one of the most competitive and important agroindustrial activity from Brazil. It provides aproximately 400,000 jobs and adds US$ 1,4000,000,000 for the country\'s economy. This activity, however, still shows less productivity than the one from Florida, mainly due to nutritional and hydric deficiencies and plagues that are already present for a long time. In the last ten years, the citrus variegated chlorosis (CVC), also known as little yellow disease, constitutes the main problem for the orange farmers. This disease is caused by gram-negative bacterium Xylella fastidiosa. Due to the importance of the orange cultive in the country, the project called Xylella fastidiosa\'s Genome was proposed. The main goals of this project are to sequence the entire genome of this phytopathogen and the trainning of specialized people in the use of modern techniques of molecular biology. DNA fragments cloned in 7 cosrnids and also form genomic shotgun libraries were sequenced in our laboratory. A total of 271,220 bp of bacteria genome were obtained. The next step was the annotation of the open reading frames (ORFs). This was made using the GLIMMER computer program which generates, in our laboratory, aproximately 290 ORFs. Direct sequencing of the genome and clones of RDA libraries were also done for obtaining nucleotide sequences form gaps. These methodologies complement the primer walking and phage library construction used by other laboratories included in the project. All results, obtained either by our laboratory or the other groups from the project, will be used for a better understanding of the mechanisms used by the bacteria, Altogether, they can be favor the development of new strategies in the plague combact.

Orientadores: Beatriz Gomes Guimarães, Jose Antonio Brum / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-09-27T18:06:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rinaldi_FabioCupri_D.pdf: 8466921 bytes, checksum: 8a88bf7cf4ccef10efbca8ec0412db74 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As oxidoredutases de pontes dissulfeto da família DsbA são responsáveis pela catálise da formação de pontes dissulfeto em proteínas secretadas para o periplasma, participando do processo de enovelamento de fatores de virulência de diversos organismos. É a proteína com maior potencial de oxidação atualmente caracterizada e tal propriedade é associada às interações eletrostáticas envolvendo resíduos de seu sítio ativo, que apresenta um arranjo Cys-Pro-His-Cys altamente conservado. A bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa possui dois genes adjacentes que codificam duas oxidoredutases pertencentes à família das DsbAs (XfDbsA e XfDbsA2). Embora a XfDbsA conserve o arranjo CPHC, a XfDbsA2 possui a substituição do resíduo histidina, descrito como essencial à atividade da enzima, por alanina (CPAC). Visando a caracterização estrutural e funcional destas proteínas, a estrutura cristalográfica da XfDsbA foi determinada a 1,9 Å de resolução e um modelo por homologia da XfDsbA2 foi construído. Além disso os potenciais de oxidação das enzimas foram determinados por medidas de fluorescência. A estrutura da XfDsbA revelou a presença de um peptídeo ligado próximo a região do sítio ativo em um dos monômeros mostrando, pela primeira vez em uma estrutura a alta resolução, o provável modo de interação da DsbA com um substrato. Os ensaios funcionais revelaram que as DsbAs de X. fastidiosa apresentam potenciais redox similares e ligeiramente superiores ao da homóloga de Escherichia coli. Embora trabalhos sobre a importância do arranjo CPHC têm associado o alto potencial redox das DsbAs à presença do resíduo histidina no sítio ativo, os resultados obtidos para a XfDsbA2 mostraram que a substituição do resíduo de histidina por alanina não afeta seu potencial redox. A análise das interações envolvendo resíduos do sítio ativo mostrou diferenças importantes entre XfDsbA, XfDsbA2 e suas homólogas de E. coli e Vibrio cholerae. Ensaios funcionais com mutantes foram realizados em busca da identificação dos resíduos que possam compensar a ausência da histidina em XfDsbA2. Os resultados obtidos fornecem novas informações sobre o mecanismo molecular dessa família de enzimas / Abstract: Disulfide oxidoreductase DsbA catalyzes disulfide-bond formation in proteins secreted to the periplasm and has been related to the folding process of virulence factors in many organisms. It is the most oxidizing of the thioredoxin-like proteins and DsbA redox power is understood in terms of the electrostatic interactions involving the active site motif CPHC. The plant pathogen Xylella fastidiosa has two chromosomal genes encoding two oxidoreductases belonging to the DsbA family and, in one of them, the canonical motif CPHC is replaced by CPAC. Aiming at the structural and functional characterization of X. fastidiosa DsbAs, the crystal structure of XfDsbA was solved at 1.9 Å resolution and the XfDsbA2 homology model was calculated. We also determined the redox potential of both enzymes by means of fluorescence experiments. The crystal structure of the XfDsbA revealed an electron density corresponding to an 8-mer peptide interacting with the hydrophobic groove on the surface of the monomer C next to the active site. This modeled peptide shows at first time in a high-resolution crystal structure the probable mode of interaction between DsbA and a substrate. Furthermore, the results presented in this work surprisingly show that, despite the absence of the active site histidine in XfDsbA2, both proteins have similar redox potentials. In addition, the structure of XfDsbA revealed critical differences in the interactions involving the active site residues. Biochemical assays with XfDsbA mutants were performed in order to investigate the residues which may be responsible for compensate for the lack of the conserved histidine in XfDsbA2. The results presented contribute to the understanding of DsbA molecular mechanism / Doutorado / Física da Matéria Condensada / Doutor em Ciências

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-25Bitstream added on 2014-06-13T19:43:43Z : No. of bitstreams: 1 federicirodriguez_mt_dr_jabo.pdf: 2411830 bytes, checksum: 75b14273eb9f16da6c18c46ba363a68d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Foi construído um microarranjo com as 2600 ORFs identificadas no projeto de sequenciamento da bactéria Xylella fastidiosa estirpe 9a5c, e utilizado para analisar diferenças na expressão gênica global da bactéria dentro de uma laranja doce suscetível (Pera) e uma tolerante (cultivar Navelina ISA 315). Foram achados mais genes diferencialmente expressos envolvidos na degradação, reguladores, componentes de membrana, adesinas tipo fímbrias, transportadores, elementos genéticos móveis e genes de patogenicidade na variedade sintomática. Assim, na cultivar Navelina ISA 315, foram diferencialmente expressos mais genes relacionados com a resposta ao estresse, seja detoxificação de espécies reativas do oxigênio ou proteínas chaperonas, assim como uma adesina do tipo hemaglutinina. Isso sugere diferenças na agregação celular e composição do biofilme assim como um maior estresse da bactéria na cultivar tolerante, provocado pelas próprias defesas da planta ou por microrganismos endofíticos que estão competindo com a X. fastidiosa. A técnica de microarranjos foi validada pela RT-qPCR, e apresentou-se como uma ferramenta poderosa na análise das mudanças na expressão gênica da bactéria X. fastidiosa em plantas de laranja doce in vivo, apresentando uma visão mais real da natureza do que os sistemas in vitro, que não a conseguem imitar completamente. Foram levantadas neste trabalho algumas hipóteses sobre os mecanismos de patogenicidade mas no entanto, mais pesquisas ainda são necessárias para lograr melhor compreensão dos mecanismos de patogenicidade e das interações patógeno-hospedeiro / A DNA microarray was constructed containing 2600 ORFs identified by the Genome sequencing project of Xylella fastidiosa 9a5c strain, and used to check global gene expression differences in the bacteria within a susceptible and a tolerant sweet orange plant, the variety Pera and the cultivar Navelina ISA 315, respectively. More genes related to degradation, regulation, membrane components, fimbrial adhesins, transport, genetic mobile elements and patogenicity genes were differentially expressed in Pera variety. On the other hand, in the cultivar Navelina ISA 315, more genes related to stress response, detoxification of oxygen reactive species or other substances, “heat shock” proteins, as well as an adhesin of the hemagglutinin type, suggesting differences in cellular aggregation and biofilm composition, as well as a higher estress of the bacteria in tolerant cultivar, produced either by plant defenses or by endophitic microorganisms which are competing with X. fastidiosa. This “handmade” DNA microchip was validated by RT-qPCR, and has revealed as a powerful technique for the analysis of global changes in gene expression of X. fastidiosa in sweet orange plants in vivo, generating a more real image of what is happening in nature than in vitro systems which would never reproduce nature conditions exactly. Some hypotheses were raised in this study about patogenicity mechanisms, therefore, more research is still necessary to achieve a better understanding of pathogenicity mechanisms and host-pathogen interactions

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-09Bitstream added on 2014-06-13T19:54:05Z : No. of bitstreams: 1 fadel_al_me_jabo.pdf: 837131 bytes, checksum: 825bfeac5264a418f61216e798a3e84c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A clorose variegada dos citros causada pela bactéria Xylella fastidosa é uma das doenças bacterianas de maior importância para a citricultura brasileira. Artificialmente o agente causal da CVC pode ser transmitido por enxertia de borbulhas contaminadas, encostia de mudas infectadas e pela própria solução bacteriana através de perfurações do ramo. Já a transmissão natural ocorre por enxertia de raízes entre plantas contaminadas e por cigarrinhas das famílias Cicadellidae e Cercopidae, hoje a forma mais frequente de disseminação da X. fastidiosa . Seu manejo esta baseado em três medidas: uso de mudas sadias, poda e eliminação de plantas sintomáticas, e controle químico do vetor, que muitas vezes podem não ser eficientes. Não há descrito na literatura informações suficientes sobre cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck.) tolerantes ou promissoras que possam ser utilizadas em estudos relacionados à resistência varietal, porém, estudos prévios tem apontado certa tolerância da cultivar Navelina ISA 315 à CVC. Com bases nestas informações buscou-se neste estudo quantificar o nível de tolerância da Navelina ISA 315 a CVC através da observação visual de sintomas típicos em nível de campo e casa de vegetação, presença e quantificação da X. fastidiosa via PCR e PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). Os resultados obtidos confirmaram as informações preliminares de que a cultivar Navelina ISA 315 apresenta tolerância a CVC, seja pela quase ausência de sintomas e pela baixa população do patógeno observado nesta cultivar. Portanto, até o momento, a cultivar Navelina ISA 315 parece ser uma cultivar de laranja doce com tolerância satisfatória a clorose variegada dos citros / Citrus variegated chlorosis (CVC) caused by the bacterium Xylella fastidiosa, is a bacterial disease of great importance to the Brazilian citrus industry. Causal agents for CVC can be artificially transmitted through contaminated bud grafting, approach grafting with infected nursery trees, and by injecting a bacterial solution into perforations on the branch. Natural transmission of the disease occurs with grafts from roots between infected plants and by leafhoppers of the families, Cicadellidae and Cercopidae, today the most common form of X. fastidiosa dissemination. CVC management is based on three measures: the use of healthy nursery trees, pruning and removing symptomatic plants, and chemical control of the vector, which can often be inefficient. There is little information about tolerant, or likewise promising, varieties of sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) that could be used in studies related to host resistance. However, previous studies have indicated some tolerance to CVC in the Navelina ISA 315 cultivar. Based on such information, this study has sought to quantify the tolerance level that Navelina ISA 315 has to CVC through visual observation of typical symptoms in the field, in conjunction with the presence and quantification of X. fastidiosa by PCR and quantitative real time PCR (RT-qPCR). The results confirmed preliminary information that Navelina ISA 315 is tolerant to CVC, based on its near absence of symptoms and the low population of pathogen observed in this cultivar

As flavoproteinas AhpF (Alquil Hidroperoxido Redutase subunidade F) e TrxR (Tiorredoxina Redutase) sao membros da familia piridina dissulfeto redutase e possuem atividade dissulfeto redutase as custas de NAD(P)H. A proteina TrxR e responsavel pela reducao de Tiorredoxina (Trx) que participa do ciclo catalitico de grande parte das enzimas da familia peroxirredoxina, alem de outras enzimas. AhpF e dedicada a reducao de AhpC, (Alquil Hidroperoxido Redutase subunidade C) uma peroxirredoxina exclusiva de bacterias, AhpC e AhpF juntas formam sistema AhpR (Alquil Hidroperoxido Redutase). AhpF possui dois dominios, Trx-like (N-terminal) e TrxR-like (C-terminal); sendo que a ultima possui alta similaridade de estrutura e sequencia a TrxR. De forma interessante AhpF possui atividade NADH-oxidase formadora de H2O2, enquanto TrxR nao possui. Provavelmente pequenas mudancas na sua estrutura contribuem para essa diferenca. A atividade NADH-oxidase esta presente em algumas flavoproteinas e esta geralmente centrada no anel de isoaloxazina do cofator FAD. Este anel quando no estado radicalar e chamado de semiquinona. A semiquinona pode estar protonada ou desprotonada, sendo que a ultima forma e relacionada com atividades oxidase e oxigenase de maneira geral, mas ainda nao existem regras claras a respeito da reatividade de flavoproteinas com o oxigenio. Para elucidar quais poderiam ser essas diferencas, nos clonamos os genes para as proteinas TrxR, AhpC e AhpF da bacteria fitopatogenica Xylella fastidiosa e os expressamos em Escherichia coli. Reconstituimos com sucesso o sistema AhpR in vitro, medindo o consumo de H2O2 na presenca de AhpC, AhpF e NADH atraves de eletrodos especificos para peroxido. Da mesma forma caracterizamos a atividade NADH-oxidase de AhpF medindo o consumo de oxigenio e a producao de peroxido de hidrogenio. Alem disso, demonstramos que a atividade NAD(P)H-oxidase e ausente em TrxR atraves de ensaios de consumo de NADH. A expressao de somente o dominio C-terminal de AhpF manteve a atividade NADH-oxidase como na proteina selvagem, levando a crer que sao diferencas no motivo TrxR-like que disparam a atividade NADH-oxidase. Analisando a sobreposicao de estruturas tridimensionais de AhpF e TrxR disponiveis no PDB em conjunto com o alinhamento de sequencia de aminoacidos destas proteinas em diferentes organismos, identificamos tres possiveis candidatos que poderiam estar envolvidos na atividade NADH-oxidase. Atraves de mutacao sitio dirigida, identificamos que a retirada do residuo de histidina entre o motivo CXXC de AhpF fez o mutante AhpF H347T apresentar metade da atividade especifica NADHoxidase. Da mesma forma a mutacao reversa em TrxR, adicionando o residuo de histidina no motivo CXXC levou a TrxR T142H apresentar uma atividade especifica significativamente maior que a TrxR selvagem. Os dados em conjunto sugerem que o residuo de histidina por sua natureza polar e relevante para a desprotonacao do anel de izoaloxazina do FAD, e a sua consequente reatividade com o oxigenio, sendo um fator importante para a atividade NADH-oxidase presente em AhpF / The flavoproteins AhpF (Alkylhydroperoxide reductase subunit F) and TrxR (Thioredoxin Reductase) are members of the nucleotide pyridine disulfide oxidoreductase family and possess disulfide reductase activity at the expense of NAD(P)H. The TrxR protein is responsible for the reduction of thioredoxin (Trx), which is used in the catalytic cycle of most peroxiredoxins, among other enzymes. AhpF is dedicated to reducing the bacterial peroxiredoxin AhpC, and together they form the AhpR system (Alkylhydroperoxide reductase system). AhpF has two domains, Trx-like (N-terminal) and TrxR-like (C-terminal); the latter has high of similarity to TrxR. Intriguingly, AhpF has an H2O2-forming NAD(P)H-dependent oxidase activity, while TrxR does not. Slight changes in the structures of these two enzymes probably account for this phenomenon. The NADH-oxidase activity is present in some flavoproteins and is generally centered in the isoalloxazine ring of the FAD cofactor. This ring in its radical state is called a semiquinone, which can be protonated or deprotonated. The deprotonated form is related to oxidase and oxygenase activities, but there are no clear rules as to the reactivity of flavoproteins and molecular oxygen. In order to elucidate these differences, we have cloned genes which code the proteins TrxR, AhpC and AhpF of the phytopathogenic bacteria Xylella fastidiosa and have expressed them in Escherichia coli. We have successfully reconstituted the AhpR system in vitro, measuring the H2O2 decrease in the presence of AhpC, AhpF and NADH, by using specific electrodes. We have similarly characterized the NADH-oxidase activity of AhpF by measuring the decrease in the levels of oxygen and the production of hydrogen peroxide. Furthermore, through assays measuring the consumption of NADH, we have demonstrated that the NAD(P)H-oxidase activity is non-existent in TrxR. The expression of only the C-terminal domain of AhpF showed NADH-oxidase activity similar to the wild-type protein, which indicated that the NADH-oxidase activity occurs due to differences in the TrxR-like motif. By analyzing the superposition of the threedimensional structures of AhpF and TrxR, as well as the alignment of their amino acid sequence in different organisms, we identified three possible candidates which could be involved in NADH-oxidase activity. Through site-directed mutation, we found that the removal of the histidine residue within the CXXC motif of AhpF caused the mutant AhpF H347T to present half of the NADH-oxidase specific activity, when compared to the wild-type protein. Likewise, the reverse mutation in TrxR, adding the histidine residue to the CXXC motif, caused TrxR T142H to have a significantly higher specific activity when compared to the wild-type TrxR. The data suggests that, because of its polar nature, the histidine residue is relevant to the deprotonation of the isoalloxazine ring of FAD and its reactivity to oxygen, and, therefore, is an important factor to the NADHoxidase activity of AhpF

Xylella fastidiosa é uma bactéria gram-negativa, colonizadora do xilema de plantas economicamente importantes, sendo responsável por diversas patogenias como a doença de Pierce em videiras e a clorose variegada dos citros (CVC). Plantas, ao serem infectadas por patógenos, dispõem de um maquinário de defesa que inclui a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Peróxidos de lipídios podem ser formados pelo ataque de ROS à membrana bacteriana ou pela ação de lipoxigenases. O sistema da AhpR (alquil hidroperóxido redutase) foi inicialmente caracterizado como o principal responsável pela defesa contra hidroperóxidos orgânicos em bactéria. Recentemente, foi descrito um gene em muitas bactérias patógenas no qual a sua deleção conferia a célula uma maior susceptibilidade a hidroperóxidos orgânicos, mas não a H2O2 ou a geradores de superóxido (Mongkolsuk et al., 1998 e Ochsner et al., 2001). Por esta razão, este gene foi denominado ohr (organic hydroperoxide resistance gene). O objetivo desse trabalho foi caracterizar funcionalmente a proteína ohr de X. fastidiosa. Inicialmente, demonstramos que ohr possui atividade peroxidase dependente de tiól sendo que sua capacidade de reagir com hidroperóxidos é devida á presença de um par de cisteínas conservadas em seu sítio ativo. Também mostramos que ohr possui um enovelamento alfa/beta único, não observado nas estruturas de outras peroxidases dependentes de tiól como peroxirredoxinas e glutationa peroxidases. Análises do sítio ativo de ohr mostraram que seus prováveis substratos são moléculas hidrofóbicas e alongadas. Corroborando esta hipótese, demonstramos que enzimas lipoiladas, classicamente relacionadas com o metabolismo intermediário, interagem física e funcionalmente com ohr, enquanto que os sistemas tiorredoxina e glutationa, classicamente relacionados a tióis peroxidases, não sustentam a atividade peroxidásica de ohr. Este resultado representa a primeira descrição de uma peroxidase que é diretamente reduzida por grupos lipóicos de enzimas. Também fornecemos evidências que indicam que ohr atua na redução de hidroperóxidos derivados de ácidos graxos insaturados. De fato, análise cinética de estado estacionário por bi substrato mostra que ohr decompõem hidroperóxidos orgânicos com alta eficiência (kcat/KM ~ 106M-1.s1) através de um mecanismo ping-pong, sendo aproximadamente dez mil vezes mais eficiente do que na presença de H2O2. Esses dados em conjunto mostram que ohr é central na resposta bacteriana contra o estresse induzido por hidroperóxidos orgânicos, mas não por H2O2 e define uma nova classe de enzimas antioxidantes com propriedade únicas: peroxidases dependentes de grupos lipóicos. Outro objetivo desse trabalho foi estudar a via de regulação gênica de ohr em Xylella fastidiosa. Na maioria dos organismos, ohr é regulada por uma proteína repressora denominada ohrR (Sukchawalit et al., 2001), mas em algumas bactérias foi descrito que a expressão de ohr era regulada positivamente por um fator sigma alternativo (σE) de função extra citoplasmática (Gourion et al., 2008). Nossos resultados mostraram que ohr de X. fastidiosa não está sob controle de nenhuma dessas proteínas, sendo provavelmente expressa constitutivamente. Análises por northern blot não mostraram alterações nos níveis de ohr em células submetidas a estresse oxidativo ou etanólico. Esses resultados, ainda que preliminares, indicam que possivelmente o controle da expressão gênica de ohr em X. fastidiosa é distinto daqueles descritos até o momento na literatura para outras bactérias. / Xylella fastidiosa is a gram-negative bacterium, which colonizes the xylem from economically important plants, being responsible for several diseases such as Pierce disease (PD) in gravepines and citrus variegated clorosis (CVC). Plants, when infected by pathogens, are able to defend themselves through several mechanisms which include the generation of reactive oxygen species (ROS). Lipid hydroperoxides can be generated from the attack of ROS to the bacterial membrane or by the action of lipoxygenases. The alkyl hydroperoxide reductase system (AhpR) was initially characterized as the main responsible for the detoxification of organic hydroperoxides in bacteria. Recently, it was also characterized another gene in many pathogenic bacteria, whose deletion renders cells susceptibility to organic hydroperoxide treatments but not by H2O2 or by superoxide generators (Mongkolsuk et al., 1998 and Ochsner et al., 2001). For this reason, it was named ohr (organic hydroperoxide resistance gene). The goal of this work was to functionally characterize ohr, the product of ohr gene from Xylella fastidiosa. Initially, we demonstrated that ohr possesses Cys-based thiol-dependent peroxidase activity. Later, we showed that ohr possesses a unique alpha/beta fold not observed in the structures of other thiol peroxidases such as peroxiredoxins and glutathione peroxidases. Analyses of ohr active site showed that its likely substrates are elongated and hydrophobic molecules. Furthermore, we showed that lipoylated enzymes, classically related with the intermediary metabolism, interacts physically and functionally with ohr while classical thiol-dependent pathways, such as thioredoxin and glutathione, failed to support ohr activity. This finding represents the first evidence of a peroxidase that is directly reduced by lipoyl groups of enzymes. Also, we obtained evidences indicating that ohr acts in the detoxification of peroxides derived from unsaturated fatty acids. In fact, steady-state kinetics using bi-substrate analysis showed that ohr decomposes organic peroxides with high efficiency (kcat/KM ~ 106 M-1.s-1 through a ping-pong mechanism, at least ten thousand times more efficiently than hydrogen peroxide (H2O2). All these results together shows that ohr is central in the response of bacteria to the stress induced by organic hydroperoxides but not by H2O2 and defines a new class of antioxidant enzymes with unique properties such as lipoyl-dependent peroxidase activity. Another goal of this work was to study the regulation of ohr expression in Xylella fastidiosa. ohr expression is regulated in most bacteria by a repressor protein named ohrR (Sukchawalit et al., 2001) but, in some bacteria, ohr expression is positively regulated by an alternative sigma factor (σE) with extracitoplasmatic function (Gourion et al., 2008). Our results showed that ohr from X. fastidiosa was not under the control of none of these regulators, probably being constitutively expressed. Through northern blot analysis, we did not observed any changes in ohr levels in cells submitted to oxidative or ethanolic stress. These results, indicates that ohr expression probably differs from that previously described on literature for other bacteria.