Orientador: Mônica Alonso Cotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-19T11:07:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MurilloMunar_DuberMarcel_M.pdf: 2543124 bytes, checksum: 3cf9b797cba5e450d6c025e609885768 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Este trabalho tem como finalidade mostrar a importância dos diferentes modos da Microscopia de Varredura por Ponta de Prova (SPM) numa abordagem complementar para o estudo de dois diferentes sistemas biológicos. O processo de formação de biofilmes da bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa (Xf) foi o primeiro sistema abordado neste trabalho. Neste caso nosso objetivo é levantar informações que possam complementar o modelo mais aceito atualmente e corroborar os resultados obtidos anteriormente em nosso grupo. As amostras foram preparadas sobre substratos de silício recoberto com ouro e cultivadas durante tempos de crescimento de 7, 14 e 21 dias. O principal modo utilizado foi a Microscopia de Força Atômica por Kelvin Probe por modulação de amplitude (AM-KPFM) que fornece o potencial de superfície com resolução nanométrica. Imagens por KPFM foram adquiridas simultaneamente com as de topografia e fase obtidas por Microscopia de Força Atômica no modo não-contato (NC-AFM). Os resultados obtidos revelaram um processo de recobrimento gradual das bactérias por um filme de substância polimérica extracelular (EPS), concordando com os modelos propostos na literatura, porém ainda não comprovados. Imagens adquiridas por microscopia óptica (MO) mostram um desenvolvimento mais lento dos biofilmes (BF) em comparação aos resultados de G. S. Lorite para BF sobre substratos de silício obtidos anteriormente em nosso grupo. Isto está de acordo com a preferência das bactérias por superfícies com potenciais mais altos. Um resultado original está na observação de protuberâncias encontradas nas extremidades das bactérias, que mostram sinal elétrico diferenciado do resto da célula. Acreditamos que estas estruturas estão relacionadas ao processo de reprodução, pois aparecem tanto em bactérias isoladas como nas que estão no BF para todos os tempos de crescimento. O segundo sistema estudado foi a formação de estrutura quadrúplex-G de DNA. As amostras de DNA foram preparadas sobre mica e medidas no modo NC-AFM. Embora o DNA seja um sistema muito estudado em AFM, o protocolo de preparação das amostras muda segundo o tipo de estrutura que se queira visualizar. Assim, a maior parte do trabalho neste caso consistiu em desenvolver este protocolo de preparação que permitisse a visualização por AFM das estruturas de interesse. Usando concentrações altas de DNA (5ng/µL) as imagens apresentaram estruturas auto-organizadas que impedem a visualizaçã da estrutura quadrúlex·G. Para concentraçõs menores que 0,5ng/µL conseguimos visualizar moléulas isoladas, mas ainda assim as moléulas nã ficaram num estado relaxado. Um resultado interessante foi encontrado nas imagens de fase de moléulas isoladas (com concentraçã de DNA de 0,1ng/µL) onde se observam diferençs estruturais no interior das moléulas, possivelmente devido àformaçã da estrutura quadrúlex-G. Estas diferençs de fase representam um resultado original e mostram a importâcia da complementaridade dos modos AFM na observaçã de fenôenos biolóicos / Abstract: The aim of this work is to show the importance of different modes of Scanning Probe Microscopy (SPM) in a complementary approach to the study of two different biological systems. The process of biofilm formation of the phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa (Xf) was the first system discussed in this work. In this case our goal is to gather information that complements the currently most accepted model and corroborates the results obtained previously in our group. The samples were prepared on silicon substrates coated with gold and cultivated during 7, 14 and 21 days. The main results were obtained using Kelvin Probe Atomic Force Microscopy with amplitude modulation (AM-KPFM) which provides the surface potential with a nanometric resolution. Images were acquired by KPFM simultaneously with topography and phase images obtained by Atomic Force Microscopy in non-contact mode (NC-AFM). The results revealed a process of gradual coating of the bacteria by a film of extracellular polymeric substance (EPS), in agreement with the models proposed in the literature, but not yet proven. Images acquired by optical microscopy (OM) show a slower development of the biofilms (BF) compared to the results of G. S. Lorite for BF on silicon substrates obtained previously in our group. This result agrees with the preference of the bacteria for surfaces with large potentials. An original result is the observation of lumps found at the extremities of the bacteria, which show electrical signal different from the rest of the cell. We believe that these structures are related to the reproduction process as they appear both in isolated bacteria and those on BF for all growth times. The second system studied was the formation of G-quadruplex structure of DNA. DNA samples were prepared on mica and measured in the NC-AFM mode. Although DNA is a well studied system in AFM, the sample preparation protocol changes depending on the type of structure to be viewed. Thus, most of the work described here was to develop the preparation protocol that allows the visualization of the structures of interest by AFM. Using high concentrations of DNA (5ng/µL) the images showed self-organized structures that prevent visualization of G-quadruplex structure. For concentrations less than 0.5 ng/mL we got isolated molecules, but still the molecules were not in a relaxed state. An interesting result was found in the phase images of isolated molecules (with DNA concentration of 0.1 ng/mL) where structural differences are observed within the molecules, possibly due to the formation of G-quadruplex structure. These phase differences represent an original result and show the importance of the complementarity of AFM modes in the observation of biological phenomena / Mestrado / Mestre em Física

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Ricardo Aparício / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T00:47:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_CleltonAparecidodos_D.pdf: 17722787 bytes, checksum: bfe46a8c0582a66be16a3f8b35fc9ada (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Xylella fastidiosa é uma bactéria responsável por inúmeras doenças de plantas em culturas economicamente importantes ao redor do mundo, incluindo a clorose variegada dos citros. Após a infecção de seu hospedeiro, as células de X. fastidiosa é apta a formarem uma estrutura de biofilme que bloqueia os vasos xilemáticos, levando a uma condição de estresse hídrico na planta hospedeira e desencadeando o desenvolvimento da doença. Tendo como estímulo a relevância econômica da citricultura para o Brasil e, visando reduzir os prejuízos provocados pelos problemas fitossanitários que acometem esta cultura, foi realizado um consórcio de pesquisa com o intuito de se conhecer completamente o genoma da linhagem 9a5c de X. fastidiosa. Inúmeras proteínas associadas com patogenicidade, adaptação e sobrevivência bacteriana foram identificadas, incluindo XfDsbC (proteína disulfeto isomerase), Xf5'-Nt (5'-nucelotidase), XfTolB (proteína de translocação B) e XfPal (lipoproteína associada ao peptidoglicano) que foram caracterizadas neste estudo. Empregando ferramentas de caracterização de proteínas, aspectos funcionais e estruturais destas quatro proteínas alvos foram avaliados. Dentre os resultados destaca-se a imunodetecção de XfDsbC, Xf5'-Nt, XfTolB e XfPal durante as diferentes fases de formação e desenvolvimento do biofilme de X. fastidiosa, que é tido como o principal mecanismo de patogenicidade deste fitopatógeno, confirmando a predição inicial de tais proteínas como associadas à patogenicidade bacteriana. Adicionalmente, resultados funcionais e estruturais revelaram detalhes finos do papel biológico desempenhado por cada uma das proteínas estudadas. Juntos, os resultados apresentados neste trabalho contribuem para o melhor entendimento de patogenicidade bacteriana, especialmente com respeito ao fitopatógeno X. fastidiosa / Abstract: Xylella fastidiosa is a plant pathogen bacterium responsible for numerous economically important crops diseases around the world, including the citrus variegated chlorosis. Following the host infection, the X. fastidiosa cells are able to form a biofilm structure which block the xylem vessels, leading to a hydric stress condition in the host plant and triggers the disease development. Given the economic relevance of citriculture for Brazil and in order to reduce the damage caused by phytosanitary problems that affect the citrus production, a research consortium was established with the aim to elucidate the complete genome sequence of the X. fastidiosa 9a5c strain. Numerous proteins associated with bacterial pathogenicity, adaptation and survival have been identified, including XfDsbC (protein disulfide isomerase), Xf5'-Nt (5'-nucleotidase), XfTolB (protein translocation B) and XfPal (peptidoglycan-associated lipoprotein) which were characterized in this study. Using tools for protein characterization, structural and functional aspects of these four protein targets were evaluated. Among the results, we highlight the immunodetection of XfDsbC, Xf5'-Nt, XfTolB and XfPal during the different stages of X. fastidiosa biofilm formation and development which is considered the primary mechanism of pathogenicity of this pathogen. These findings, confirming the initial prediction that relates such proteins as associated with bacterial pathogenicity. Additionally, structural and functional results revealed accurate details of the biological role played by each protein studied. Taken together, the findings presented in this study contribute to a better understanding of bacterial pathogenesis, especially with regard to the plant pathogen X. fastidiosa / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O fitopatógeno Xylella fastidiosa coloniza o lúmen dos vasos do xilema de seus hospedeiros e o aparelho bucal do inseto-vetor. É responsável por doenças de extrema gravidade em videira, laranjeira, e oliveira, entre outras plantas de relevância econômica. Há evidência de especificidade entre cepas de X. fastidiosa e as diferentes espécies de plantas que colonizam, mas as bases moleculares desta interação são desconhecidas. O objetivo central deste trabalho foi elucidar o repertório completo de genes expressos e/ou diferencialmente expressos por diferentes cepas X. fastidiosa em meios e tempos de cultivo distintos e relacionar as respostas transcricionais a mecanismos de virulência, patogenicidade e especificidade ao hospedeiro. Foram sequenciados, analisados e comparados os transcritomas de cepas de laranjeiras (9a5c, J1a12, U24d e Fb7), de cafeeiro (3124), de hibisco (Hib4), ameixeira (Pr8x) e de videira (Temecula1), no início e fim da fase a exponencial de crescimento populacional em meio rico PWG e em meio mínimo PIM6, que mimetiza a seiva do xilema. Foi observado que a maioria dos genes de X. fastidiosa é expressa, ainda que, dependendo da cepa e da condição experimental, 40-80% dos transcritos sejam pouco abundantes. Por outro lado, foi verificado um conjunto de transcritos muito abundantes, uma parte deles comuns a todas as cepas, e que incluem os ncRNAs 6S e RNAse P, além de transcritos de microcinas, proteases, lipases, proteínas de resposta a estresse e proteínas de função desconhecida. Além da definição de perfis transcricionais, foram descritas as regiões 5\' e 3\' não-traduzidas dos transcritos. As estruturas de 545 e 386 operons expressos, respectivamente pelas cepas 9a5c e Temecula1, também foram mapeadas, e pela primeira vez foi obtido o perfil de sRNAs expressos por X. fastidiosa. As análises de expressão diferencial entre transcritomas das duas fases de crescimento no mesmo meio indicam que o estresse gerado pela limitação nutricional do meio PIM6 exigiu mudanças mais drásticas na expressão gênica do que no meio PWG. Foi também observado que diferentes cepas respondem de maneiras distintas a uma mesma condição, indicando que genes ortólogos são regulados de formas diferentes. Além disso, a transcritômica comparativa revelou diferenças relevantes na regulação gênica de cepas de hospedeiros vegetais distintos que podem estar relacionadas à especificidade ao hospedeiro. Por fim, as análises dos transcritomas evidenciaram vários genes candidatos que poderão ser futuramente investigados quanto ao seu papel na biologia e na virulência de X. fastidiosa. / The phytopathogenXylella fastidiosa colonizes the lumen of xylem vessels from its hosts and the mouth apparatus of the insect-vector. It is responsible for severe diseases in grapevine, orange and olive trees, among other plants of economic relevance. There is evidence for specificity between X. fastidiosa strains and the different plant species they colonize, but the molecular bases of this interaction are unknown. The main objective of this work was elucidate the complete repertoire of expressed and/or differentially expressed genes by different X. fastidiosa strains in distinct media and growth times and associate transcriptional responses to virulence mechanisms, pathogenicity and host specificity. Transcriptomes of orange strains (9a5c, J1a12, U24d and Fb7), coffee (3124), hibiscus (Hib4), plum (Pr8x) and grapevine (Temecula1), were sequenced, analyzed and compared from cells at the beginning and end stages of exponential growth phase in rich medium PWG and in minimum medium PIM6, which mimics xylem sap. It was observed that the majority of X. fastidiosa genes is expressed, although, depending of the strain and experimental condition, 40-80% of transcripts are less abundant. On the other hand, it was verified a set of more abundant transcripts, some of them shared by all strains, including 6S and RNAse P ncRNAs as well as transcripts for microcins, proteases, lipases, stress response proteins and proteins of unknown function. Besides the definition of transcriptional profiles, 5\' and 3\' untranslated regions of transcripts were described. The structure of 545 and 386 expressed operons, respectively for 9a5c and Temecula1 strains, were also mapped, and for the first time the expressed profile of sRNAs in X. fastidiosa was obtained. The differential expression analyzes between transcriptomes of two growth phases in the same medium indicate that the stress generated by nutritional limitation of PIM6 medium required more drastic changes in gene expression than PWG medium. It was also observed that different strains respond in distinct manners to a same condition, indicating that orthologous genes are regulated in different ways. Moreover, comparative transcriptomics revealed relevant differences in gene regulation of strain of distinct plant hosts that can be related to host specificity. Lastly, transcriptomic analyzes pointed to several gene candidates that could be further investigated for their roles in X. fastidiosa biology and virulence.

Linhagens mutantes foram obtidas para os fatores sigma <font face=\"symbol\">sE (RpoE) e <font face=\"symbol\">sN (RpoN) da bactéria Xylella fastidiosa. O mutante rpoE mostrou-se sensível a etanol e a choque térmico. Análises de microarranjo de DNA, de RT-PCR quantitativo e mapeamento de sítios de início de transcrição permitiram definir o regulon <font face=\"symbol\">sE em resposta ao choque térmico. Verificou-se co-transcrição entre os genes que codificam para <font face=\"symbol\">sE, seu anti-sigma e uma protease, e <font face=\"symbol\">sE não se mostrou auto-regulado, mas regulou o gene do anti-sigma. Análises similares às acima indicaram que o gene pilA, codificando a pilina da fímbria tipo IV, é positivamente regulado por <font face=\"symbol\">sN, enquanto o operon codificando proteínas da fímbria tipo I é regulado negativamente, explicando a maior formação de biofilme e auto-agregação no mutante rpoN. O perfil temporal de expressão da linhagem selvagem J1a12 em carência de nitrogênio foi determinado, além de genes induzidos por carência de nitrogênio via <font face=\"symbol\">sN. Assim, <font face=\"symbol\">sN regula genes de fímbrias e de resposta à carência de nitrogênio em Xylella fastidiosa. / Mutant strains were obtained for the sigma factors <font face=\"symbol\">sE (RpoE) and <font face=\"symbol\">sN (RpoN) in Xylella fastidiosa. The rpoE mutant showed to be sensitive to ethanol and heat shock. Microarray and quantitative RT-PCR analyses and determination of transcription start sites permitted to define the <font face=\"symbol\">sE regulon under heat shock. Co-transcription of the genes encoding <font face=\"symbol\">sE , its anti-sigma factor and a protease was observed, and <font face=\"symbol\">sE did not present auto-regulation, but it regulated the gene encoding the anti-sigma. Similar analyses indicated that the pilA gene, encoding the pilin of the type IV fimbriae, is positively regulated by <font face=\"symbol\">sN, while the operon encoding proteins of the type I fimbriae is negatively regulated, what explains the increased biofilm formation and auto-aggregation in the rpoN strain. Temporal expression profile of wild type strain J1a12 under nitrogen starvation was determined, as well as genes induced by nitrogen starvation via <font face=\"symbol\">sN. Thus, <font face=\"symbol\">sN regulates genes encoding fimbriae and genes for nitrogen starvation response in Xylella fastidiosa.

O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a diversidade bacteriana endofítica cultivável associada a plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck sintomáticas e assintomáticas para a doença Greening, com destaque para Methylobacterium spp. Simultaneamente, como objetivo secundário, foi realizado o estudo da comunidade bacteriana endofítica de Methylobacterium spp. presente em plantas de laranja doce com e sem sintomas da Clorose Variegada dos Citros (CVC). Assim, em período chuvoso (novembro de 2008 e fevereiro de 2009) e seco (maio de 2009) foram amostradas dez plantas sadias e dez plantas doentes (Greening e/ou CVC), em dois municípios citrícolas da região central do estado de São Paulo. A confirmação da presença e/ou ausência dos fitopatógenos Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, agentes causadores do Greening e, também, de Xylella fastidiosa, agente causador da CVC foram realizadas para todas as amostras pela técnica PCR a partir da utilização de iniciadores específicos para os respectivos fitopatógenos. Em relação à comunidade bacteriana estudada, foi realizado o isolamento e posterior quantificação do número de unidades formadoras de colônia (UFCs) totais e de Methylobacterium, caracterizadas pela presença de coloração rósea. A análise do sequenciamento parcial da região do gene 16S DNAr e agrupamentos filogenéticos dos isolados amostrados foram as metodologias adotadas para a geração dos resultados. Os resultados revelaram que a quantidade de Methylobacterium spp. isoladas em plantas sintomáticas para as doenças Greening e CVC foi expressivamente superior em relação as plantas sadias, destacando-se as espécies M. fujisawaense e M. radiotolerans, que foram os filotipos mais encontrados nas referidas amostras. As amostras vegetais coletadas em período seco, também, apresentaram maior presença da comunidade metilotrófica. A observação dos resultados da comunidade endofítica cultivável total associada a plantas sintomáticas e assintomáticas para Greening, mostrou que não houve diferenças relevantes quanto as UFCs encontradas nas plantas doentes e sadias. Foram encontradas as classes: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria e Firmicutes e os gêneros mais frequentes foram Brevundimonas, Alcaligenes e Pantoea. Em relação às características adaptativas de Methylobacterium spp. quanto a situações de estresses, foram verificadas in vitro a produção da enzima ácido aminociclopropano-1-carboxilato deaminase (ACCd) e tolerância aos metais pesados cádmio e chumbo. Dos 62 isolados avaliados, 63% foram capazes de utilizar a molécula de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) como fonte de nitrogênio para seu desenvolvimento. Os testes para tolerância ao metais pesados revelaram que apenas 3 isolados foram capazes de crescer em meio CHOI suplementado com sulfato de cádmio nas concentrações de 2,5 e 5,0 mM. Somente dois isolados se mostraram tolerantes ao chumbo, presente no meio CHOI suplementado com nitrato de chumbo nas concentrações 2,5 mM. Já em 5 mM, apenas um isolado foi capaz de se desenvolver. Os resultados, apresentados mostram a importância de Methylobacterium spp., sobre a comunidade endofítica cultivável de citros em dois diferentes patossistema avaliados, uma vez que em ambos foi observada uma maior quantidade de isolados do gênero em plantas doentes, sugerido uma associação com os respectivos fitopatógenos. A produção de ACCd por Methylobacterium está relacionada entre outros fatores, a interrupção da rota de síntese do etileno, composto relacionado ao estresse vegetal. Assim, a grande quantidade de Methylobacterium em plantas doentes e a produção de ACCd pelas mesmas, possivelmente, estão relacionadas ao favorecimento do patógeno mediante a redução da capacidade de resposta da planta / The aiming of this study was the evaluation of the diversity of endophytic culturable bacterial community associated with Huanglongbing (HLB) symptomatic and no-symptomatic Citrus sinensis (L.) Osbeck plants, highlighting the Methylobacterium spp. Simultaneously, it was evaluated the endophytic Methylobacterium community in sweetie orange with and without Citrus Variegated Chlorosis (CVC) symptoms. Thus, it was sampled ten healthy and no-health plants with HLB and CVC symptoms in raining (November 2008 and February are 2009) and dryed (may 2009) seasons in two provinces at São Paulo State. The presence or absence of the plant-pathogens Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, HLB agents and Xylella fastidiosa, CVC agent, was confirmed using specific primer by PCR for all plant samples. The bacterial communities was accessed by isolation and posteriori quantification of colony forming unit (CFU) to total and Methylobacterium group that was identified according its pink coloration. To the identification and phylogenetic clusterization of the isolates was partially sequenced the 16S DNAr gene. The results showed a higher amount of isolated Methylobacterium spp. from symptomatic plants to HLB and CVC than healthy plant. M. fujisawaense and M. radiotolerans were present in these samples. The plants sampled in dryed season showed a high amount of methilotrific isolates. It was not observed a significant difference of the amount of total bacteria isolated from HLB symptomatic and no-symptomatic plants The identified classes was: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria and Firmicutes. Brevundimonas, Alcaligenes and Pantoea were the most frequent genera. It was verified the acid aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACCd) production and the lead and cadmium tolerance as the adaptative characteristic of Methylobacterium to stress conditions. 63% of the 62 evaluated isolates were able to use the aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) as nitrogen source. Just 3 isolates were able to grow in supplemented CHOI media at 2.5 e 5.0 mM of sulphate of cadmium. Two isolates showed lead tolerance in the same media supplemented with nitrate of lead at 2.5 mM and just one at 5.0mM.The results showed the importance of Methylobacterium spp. to citrus culturable endophytic community in two pathossystem. In both the amount of methylotrofic isolates was higher in symptomatic plants, suggesting its association with the plant-pathogens. The Methylobacterium ACCd production has a relationship with the breaking of ethylen route. This compound is associated with vegetal stress. For this reason the high amount of Methylobacterium from symptomatic plants and the ACCd production probably is correlated with the disease development under the reduction of plant response capacity

A bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa é o agente etiológico da Clorose Variegada dos Citros (CVC), que causa perdas anuais estimadas em US$ 100 milhões no Brasil. Durante o processo infeccioso, a geração extracelular de espécies ativas de oxigênio é um dos principais mecanismos de defesa da planta contra o patógeno. Em contrapartida, para se defender do estresse oxidativo imposto pelo hospedeiro, os fitopatógenos possuem mecanismos de defesa que incluem enzimas antioxidantes, como as peroxirredoxinas, alquil hidroperóxido redutase subunidade C (AhpC) e proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp). As peroxirredoxinas são proteínas que utilizam suas cisteínas ativas para catalisar a redução de hidroperóxidos. Por análise proteômica, os produtos dos genes ahpc e bcp foram identificados no extrato celular protéico de X. fastidiosa (Smolka e col., 2003). Com o intuito de caracterizar funcional e estruturalmente as proteínas AhpC e Bcp de X. fastidiosa, clonamos e expressamos seus respectivos genes em Escherichia coli e purificamos as proteínas por cromatografia de afinidade a níquel. As proteínas recombinantes apresentaram atividade dependente de tiól de redução de peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos orgânicos. A atividade peroxidase da AhpC e Bcp são dependentes, respectivamente, de alquil hidroperóxido redutase subunidade F (AhpF) e do sistema tiorredoxina. Paradoxalmente, a flavoproteína AhpF possui atividade NAD(P)H oxidase, que resulta na produção de peróxido de hidrogênio. As constantes de segunda ordem da reação das proteínas com peróxido de hidrogênio (da ordem de 107 M-1.s-1), determinadas pelo ensaio de cinética competitiva com peroxidase de raiz forte, indicam que ambas possuem atividades peroxidase equivalentes às apresentadas por glutationa peroxidases dependentes de selênio e catalases, ao contrário do descrito na literatura. Por SDS-PAGE não-redutor e pela quantificação de cisteínas livres por DTNB, verificamos que as proteínas possuem mecanismos catalíticos distintos: AhpC é uma 2-Cys Prx típica (com formação de ponte dissulfeto intermolecular), enquanto Bcp é uma 2-Cys Prx atípica (com formação de ponte dissulfeto intramolecular). Para AhpC, a atividade catalítica envolve as cisteínas conservadas (Cys-47 e Cys-165), em contraste, apenas através de estudos de mutação sítio-dirigida e espectrometria de massas conseguimos identificar os resíduos de cisteínas envolvidos na atividade catalítica da Bcp (Cys-47 e Cys-83). A caracterização estrutural de AhpC por cromatografia de exclusão molecular e espalhamento dinâmico de luz mostram que a proteína nativa é um decâmero estável, independentemente do estado de oxidação de suas cisteínas. A caracterização da estrutura cristalográfica de Bcp C47S, inédita para 2-Cys Prx atípicas que possuem as cisteínas ativas separadas por 35 aminoácidos, indica que a proteína possui o enovelamento característico das peroxirredoxinas e que as cisteínas ativas estão localizadas a uma distância média de 12,4 Å. Baseado em dicroísmo circular, apresentamos dados que indicam que a aproximação das cisteínas deve envolver um significativo rearranjo estrutural, que provavelmente se inicia com a formação do intermediário ácido sulfênico na cisteína peroxidásica (Cys-47). Assim, conseguimos elucidar o papel catalítico dessas proteínas, bem como identificar seus sistemas redutores, obtendo informações que podem ser relevantes para o entendimento do mecanismo da patogenicidade da X. fastidiosa. Os resultados apresentados neste trabalho podem contribuir para o desenvolvimento de novas técnicas de controle de praga para a doença CVC em citrus e outras que envolvam a bactéria X. fastidiosa. / The phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa is the etiological agent of Citrus Variegated Chlorosis (CVC) that causes losses of about 100 millions dollars per year in Brazil. During infection, reactive oxygen species play a central role in plant pathogen defense. To survive under oxidative stress imposed by the host, microorganisms express antioxidant proteins, including the peroxiredoxins alkyl hydroperoxide reductase subunit C (AhpC) and bacterioferritin comigratory protein (Bcp). Peroxiredoxins are peroxidases, which rely on an activated cysteine residue to catalyze the reduction of hydroperoxides. By proteome analysis, Smolka et al. (2003) identified the products of ahpc and bcp genes present in whole cell extract of X. fastidiosa. To characterize the function and structure of AhpC and Bcp protein, their genes were cloned in Escherichia coli and the corresponding proteins purified by nickel affinity chromatography. Recombinant proteins presented thiol-dependent peroxidase activity against hydrogen peroxide and organic hydroperoxides. AhpC and Bcp peroxidase activities are dependent on alkyl hydroperoxide reductase subunit F (AhpF), and on thioredoxin system, respectively. Paradoxically, AhpF flavoenzyme possesses hydrogen peroxide-forming oxidase activity. Contrary to classical assumptions, competitive kinetics employing horseradish peroxidase assays showed that the second-order rate constants of AhpC and Bcp reaction with hydrogen peroxide are in the order of 107 M-1.s-1, as fast as the activity of selenium-dependent glutathione peroxidases and catalases. Non-reducing SDS-PAGE and cysteine quantification using DTNB indicated different peroxidasic mechanisms: AhpC is a typical 2-Cys peroxiredoxin (with intermolecular disulfide bond formation), while Bcp is an atypical 2-Cys peroxiredoxin (with intramolecular disulfide bond formation). In contrast to the well-conserved AhpC cysteines responsible for the peroxidase activity (Cys-47 and Cys-165), only through site-specific mutagenesis and mass spectrometry we could identified the cysteine residues involved in the Bcp peroxidase activity (Cys-47 and Cys-83). Structural characterization by size exclusion chromatography and dynamic light scattering revealed that AhpC native protein forms stable and redox state independent decamers. The crystal structure of Bcp C47S, the first 2-Cys Prx with a 35-residue between the active cysteines ever characterized, shows that protein contains the common fold of peroxiredoxins and that active cysteines lies ~12.4 Å away one from the other. Based on circular dichroism, we presented data indicating that disulfide bond formation may require significant conformational changes, which probably is triggered by the peroxidatic cysteine oxidation to sulfenic acid. In conclusion, we elucidated the catalytic mechanisms and reduction systems of AhpC and Bcp proteins that may help to understand the pathogenicity mechanism of X. fastidiosa. These results can contribute to the development of plague control methods against X. fastidiosa.

Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, do subgrupo das Gama-Proteobactérias, não-flagelada, que coloniza o xilema de diversas plantas cultivadas e silvestres, podendo ser causadora de doenças. Sua disseminação é feita por insetos conhecidos como cigarrinhas. Genomas de cepas de X. fastidiosa isoladas de distintos hospedeiros já foram sequenciados completa ou parcialmente: 9a5c de citros; Temecula-1 e GB514 de videira; Dixon, M12 e M23 de amendoeira; Ann-1 de espirradeira e EB92-1, isolada de sabugueiro e utilizada como bio-controle para Doença de Pierce de videiras. Estudos de genômica comparativa associados a abordagens de genômica funcional e de genética molecular têm possibilitado o estudo detalhado de mecanismos potencialmente relevantes tanto para a colonização de plantas e insetos por este fitopatógeno como para o desenvolvimento de sintomas associados a doenças específicas em seus respectivos hospedeiros vegetais. Exceto o genoma de 9a5c, todos os demais genomas conhecidos são de cepas isoladas na América do Norte. Neste trabalho descrevemos o pirossequenciamento dos genomas da cepa J1a12, que exibe fenótipo não-virulento em citros, e das cepas Pr8x e Hib4, isoladas, respectivamente, de ameixeira e hibisco. A cepa J1a12 possui além de seu cromossomo principal de 2.788.789 pb dois plasmídeos, pXF51 e pXF27, respectivamente de 51.180 pb e 27.268 pb. pXF51 já foi descrito também na cepa de citros 9a5c e pXF27 tem similaridade com outros plasmídeos de cepas de X. fastidiosa norte-americanas isoladas de amoreira e videira. A cepa Pr8x possui além de seu cromossomo principal de 2.666.242 pb um plasmídeo, pXF39, de 39.580 pb, o qual contém a maioria das CDS presentes no pXF51. A cepa Hib4, isolada de hibisco, tem o maior cromossomo (2.813.297 pb) e também o maior plasmídeo (pXF64 com 64.251 pb) já descritos para X. fastidiosa. pXF64 apresenta extensa similaridade com o plasmídeo pBVIE04 de Burkholderia vietnamensis cepa G4, sendo descrito pela primeira vez em cepas de X. fastidiosa. Análises comparativas destes genomas possibilitaram a identificação de alterações que podem ser correlacionadas com os fenótipos exibidos por estas cepas, além da variedade e diversidade de regiões relacionadas a bacteriófagos e de plasmídeos que co-existem nas diferentes cepas deste fitopatógeno. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacteria, of the Gamma-proteobacterium subgroup, non-flagellated that colonizes the xylem of several cultivated and wild plants, where may cause disease. The bacterium is spread by insects known as sharpshooters. Genomes of X. fastidiosa strains isolated from different hosts have been completely or partially sequenced: 9a5c from citrus; Temecula-1 and GB514 from grapevine; Dixon, M12 and M23 from almond tree; Ann-1 from oleander and EB92-1, isolated from elderberry and used as bio-control for Pierce\'s disease of grapevines. Comparative genomics studies associated with approaches from functional genomics and molecular genetics have allowed a detailed study of mechanisms potentially relevant to the colonization of plants and insects by this pathogen as well as to the development of symptoms associated with specific diseases in their respective host plants. Except for 9a5c, all other known genomes are from strains isolated in North America. Here we describe the pyrosequencing of the genomes of strain J1a12, which displays non-virulent phenotype in citrus and of Pr8x and Hib4 strains isolated, respectively, from plum and hibiscus. J1a12 has a main chromosome of 2,788,789 bp and two plasmids, pXF51 and pXF27, respectively of 51,180 bp and 27,268 bp. pXF51 has been described also in the citrus strain 9a5c and pXF27 has similarity with other plasmids found in North American strains isolated from mulberry tree and grapevine. The strain Pr8x has a main chromosome of 2,666,242 bp and one plasmid, pXF39, of 39,580 bp which present similarities with pXF51. Hib4, the strain isolated from hibiscus, has the largest chromosome (2,813,297 bp) and the largest plasmid (pXF64 with 64,251 bp) described for X. fastidiosa. pXF64 shows extensive similarity with the plasmid pBVIE04 of Burkholderia vietnamensis G4 strain and is described for the first time in X. fastidiosa. Comparative analyzes of these genomes have identified several differences that may be correlated with the phenotypes displayed by these strains, in addition to the variety and diversity of regions related to bacteriophages and plasmids that co-exist in different strains of this pathogen.

O gênero Xylella é composto de uma única espécie, Xylella fastidiosa, bactéria Gram-negativa, não flagelada, que coloniza o xilema de uma diversidade de plantas cultivadas e silvestres em várias partes do mundo. Em algumas dessas plantas, a bactéria é considerada agente causal de doenças, como a Clorose Variegada do Citros em laranjeiras, a Doença de Pierce das videiras e escaldadura da folha de cafeeiro. Onze diferentes cepas de X. fastidiosa, isoladas de distintos hospedeiros, já tiveram seus genomas sequenciados, entre essas, as cepas 9a5c, isolada de laranjeira, e Temecula 1, isolada de videira. Análises desses genomas indicam uma razoável variabilidade entre suas respectivas sequências e evidenciam vários genes associados a mecanismos de virulência e patogenicidade desta bactéria. No presente trabalho descrevemos o sequenciamento, a montagem e a anotação dos genomas das cepas U24d e Fb7, isoladas de laranjeiras, e da cepa 3124 isolada de cafeeiro, os quais apresentam, respectivamente 2.681.334 pb, 2.733.974 pb e 2.748.594 pb. Destas, apenas a cepa U24d apresenta um plasmídeo, o qual é idêntico ao pXF51 previamente identificado na cepa 9a5c. O genoma da cepa U24d é praticamente colinear ao genoma da cepa 9a5c enquanto que os genomas das cepas Fb7 e 3124 apresentaram maior colinearidade com a cepa Temecula1. Entre as diversas alterações encontradas nas análises comparativas destes genomas, destacamos a inserção no gene pilQ verificada no genoma da cepa U24d. Essa mutação causa ausência do pilus do tipo IV com consequente deficiência na motilidade twitching, sendo que plantas infectadas com a cepa U24d apresentam sintomas localizados restritos ao ponto de inoculação. Na cepa Fb7, detectamos a ausência de formação de biofilme no cultivo in vitro possivelmente devido ausência da expressão dos transcritos de mrkD e pspA, que codificam respectivamente adesina do pilus curto e adesina similar à hemaglutinina. Postulamos que estes genes não são expressos em decorrência de um defeito na via de sinalização de DSF (Fator de Sinalização Difusível) reflexo de uma mutação em rpfC no genoma de Fb7. Assim como as demais cepas de X. fastidiosa, também os genomas de U24d, Fb7 e 3124 apresentaram elevado conteúdo de Elementos Genéticos Móveis (EGM), que aparecem em maior número nas cepas sul-americanas. Os estudos do pangenoma de X. fastidiosa mostraram que essa espécie tem um genoma aberto e grande parte dos genes de EGMs correspondem a genes acessórios. A grande quantidade de EGMs em X. fastidiosa pode estar relacionada a falta do sistema CRISPR/cas completo, um provável resultado de eventos de erosão do genoma desta espécie. A inferência filogenética por MSLA mostrou uma clara distinção dos grupos de cepas da América do Norte em relação às do Sul, sugerindo a ocorrência de mais eventos de recombinações genéticas nas cepas sul-americanas, provavelmente pela falta de isolamento geográfico. Assim, é possível que as cepas norte e sul-americanas sofreram divergência alopátrica e simpátrica, respectivamente. / The genus Xylella consists of a single species, Xylella fastidiosa, a Gram-negative and non-flagellated bacterium that colonizes the xylem of a diversity of cultivated and wild plants in several parts of the world. In some of these plants, this bacterium is considered causal agent of diseases such as the Citrus Variegated Cholorosis in orange trees, Pierce\'s Disease of grapevines and coffee leaf scald. Eleven different strains of X. fastidiosa isolated from different hosts had their genomes sequenced, including 9a5c and Temecula1 strains, respectively isolated from orange tree and grapevine. Analyses of these genomes indicate a reasonable variability in their sequences and showed several genes associated with pathogenicity and virulence mechanisms of this bacterium. In this work we describe the genome sequencing, assembly and annotation of the strains U24d and Fb7, isolated from orange trees, and 3124 isolated from coffee, which have, respectively, 2,681,334 bp, 2,733,974 bp and 2,748,594 bp. Of these, only strain U24d has a plasmid, identical to pXF51 from strain 9a5c. The genome of U24d strain is almost collinear to the genome of strain 9a5c while the genomes of strains Fb7 and 3124 had higher collinearity to Temecula1 strain. Among many changes found in the comparative analysis of these genomes, we highlight an on insertion in pilQ gene that was found in U24d strain genome. This mutation causes lack of type IV pilus with a consequent deficiency in twitching motility. Moreover orange trees infected with U24d strain showed localized symptoms near to the inoculation point. We verified that Fb7 strain does not form biofilm in vitro possibly due to the absence of expression of mrkD and pspA transcripts, which encode, respectively, a short pilus adhesin and a hemagglutinin-like adhesin. We postulate that these genes are not expressed due to a defect in the signaling pathway of DSF (Diffusible Signal Factor) reflecting a mutation on rpfC in the Fb7 genome. Similarly to other X. fastidiosa strains, the genomes of U24d, Fb7 and 3124 also showed high content of mobile genetic elements (MGE), which appear in larger numbers in South American strains. Pan genome studies of X. fastidiosa showed that this species has a open genome and that most of MGE genes correspond to accessory genes. The large number of MGE in X. fastidiosa may be related to the lack of a complete system CRISPR/cas, likely a result of erosion events of the genome of this species. The phylogenetic reconstruction by MLSA showed a clear distinction between groups of strains from North and South America, suggesting the occurrence of more recombination events in South American strains, probably due to lack of geographical isolation. Thus it is possible that North and South American strains underwent allopatric and sympatric divergence, respectively.

As aminoacil tRNA sintetases (AaRSs) são enzimas essenciais na síntese de proteínas assegurando a correta relação entre os aminoácidos e seus tRNA cognatos. O genoma mitocondrial dos tripanossomatídeos perdeu os genes codificantes dos tRNAs, assim os tRNA mitocondriais são codificados no núcleo e importados do citoplasma. O código genético do kinetoplasto desvia do código genético pela utilização do códon de terminação UGA para a decodificação do códon do triptofano. Um único gene codificando o tRNATrp(CCA) observado no genoma de Leismania é responsável pela incorporação do aminoácido triptofano durante a síntese proteíca na mitocôndria. Para decodificar os dois códons do Trp (UGA e UGG) a base na posição 34 do tRNATrp(CCA) passa por um evento de editoração, convertendo o ribunuclotídeo C34 em U34, produzindo o tRNATrp(UCA) capaz de decodificar o códon UGA. Nesse trabalho foram caracterizadas duas triptofanil tRNA sintetases de Leishmania major. De acordo com experimentos de ?western blotting? e análises ?in silico? das seqüências de aminoácidos, uma enzima tem localização citoplasmática (LmTrpRS1) enquanto a outra mitocondrial (LmTrpRS2). Os mRNAs dos dois genes foram definidos por experimentos de 5? e 3? RT-PCR. As duas enzimas foram clonadas em diversos vetores de expressão procariotos e eucariotos. A LmTrpRS1 foi obtida somente na fração insolúvel, já a LmTrpRS2 foi obtida na fração solúvel quando clonada no vetor de expressão pET28a. Esta porém mostrou-se instável precipitando rapidamente após sua purificação. Os ensaios enzimáticos realizados com a mesma mostraram que ela é capaz de reconhecer os tRNAsTrp editado e não editado. Modelagem molecular por homologia com as duas proteínas foi realizada usando a proteína citoplasmática humana como molde, para estudar a interação entre a proteína e o tRNATrp. Xylella fastidiosa é um bactéria gram negativa limitada ao xilema, responsável por um grande número de doenças economicamente importantes, como a doença de Pierces em videiras, Clorose variegata do Citrus (CVC) e a doença da requeima das folhas em outras plantas incluindo, amendoeira, ameixeira, louro, amoreira e café. Em todos os casos a X. fastidiosa afeta o xylema da planta causando redução na produção de frutos. Nesse trabalho nós mostramos a estrutura da Xylellaína, uma cisteíno protease desse patógeno. A estrutura foi resolvida por dispersão anômala a um único comprimento de onda, utilizando cristais de xylellaína selenometionina substituídos. A estrutura da Xylellaína foi refinada até 1,65 Å de resolução, mostrando enovelamento similar às proteínas da família da papaína, porém algumas características interessantes como uma região N-terminal composta por 38 aminoácidos cobrindo o sulco ativo da enzima, um intrigante ribonucleotídeo encontrado fora do sítio ativo da enzima e um ?loop? semelhante ao ?loop? de oclusão presente na catepsina B. / The aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs) are essential enzymes in protein synthesis that ensure the correct match between amino acids and their cognate tRNAs. The mitochondrial (kinetoplast) genome of trypanossomatids lacks tRNA genes, and therefore nucleus-encoded tRNAs are imported from the cytoplasm, the kinetoplast genetic code deviates from the universal code in that UGA instead of UGG encodes for tryptophan. A single nucleus-encoded tRNATrp(CCA) is responsible for Trp insertion during organellar protein synthesis. To decode both Trp codons (UGA and UGG), tRNATrp(CCA) undergoes a single C to U editing event at position 34 of the anticodon yielding to versions of the tRNA in the mitochondria with anticodon CCA and UCA, permitting UGA decoding. This work have characterized two Leishmania major tryptophanyl-tRNA synthetase, acording western blotting experiments and ?in silico? sequence analisis one of cytoplasmatic localization (LmTrpRS1) and another from mitochondria localization (LmTrpRS2). The mature mRNA transcripts for both genes were defined by 5? and 3? RT-PCR. Both enzymes were cloned into several expressions vectors. LmTrpRs1 was obtained as an insoluble protein and LmTrpRs2 expressed into the soluble fraction in pET28a expression system. LmTrpRS2 protein, however, is unstable precipitating shortly after purification. The enzymatic assay showed that this enzyme is able to recognize both tRNATrp. Molecular modeling for LmTrpRS1 and LmTrpRS2 were constructed using the cytoplasmatic human tryptophanyl tRNA synthetase as a model, to study the interaction between proteins and tRNATrp. Xylella fastidiosa is a xylem-limited, gram-negative bacteria responsible for a large number of economically important plant diseases, such as Pierces disease in grapevines, citrus variegated chlorosis (CVC) in sweet oranges and leaf scorch diseases in other plants, including almond, plum, oleander, mulberry and coffee. In all cases, X. fastidiosa infects the plant xylem and impairs fruit production. Here, we report the crystal structure of xylellain, a cystein protease from X. fastidiosa. The structure was solved by single-wavelength anomalous dispersion (SAD) using seleno-methionine containing xylellain crystals. The final structure of Xylellaína was refined against the best native data set (1.65 Å) showing R/Rfree= 17/21. Xylellain shares fold similar to Papain like Family, but contains some interesting features, like a 38 N-terminal tail covering the active site cleft; one intriguing ribonucleotide found outside the active site and one loop that resemble the ocluding loop from cathepsin B.

Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, limitada ao xilema das plantas e o agente causador de diversas doenças em importantes plantações como citros, videiras, mirta, amêndoa, arbustos e café. Em citros, X. fastidiosa causa a Clorose Variegada dos Citros (CVC) ou “amarelinho". Nove enzimas (GumB, C, D, E, F, H, J, K e M) estão envolvidas nas etapas biossintéticas de um polissacarídeo extracelular (EPS), chamado de goma fastidiana, um dos mecanismos envolvidos na patogênese da bactéria. Essas enzimas catalisam reações de adição de açúcares, polimerização e exportação do EPS através da membrana da bactéria. No presente trabalho, ferramentas de bioinformática foram utilizadas para o estudo e entendimento da biossíntese da goma fastidiana. As nove enzimas foram estudadas quanto ao seu conteúdo de estrutura secundária, análise de hidrofobicidade e das regiões transmembrânicas, classificação quanto as suas funções. A construção de modelos estruturais para as enzimas Gums através de comparação por homologia seqüencial mostrou ser um processo impossível, devido a falta de moléculas homólogas com estruturas tridimensionais conhecidas. Por outro lado, métodos de reconhecimento de enovelamento mostraram bons resultados e comparações entre as estruturas secundárias das enzimas Gums foram calculadas com a utilização dos programas GenThreader e THREADER 3.3. Modelos tridimensionais para as enzimas GumB, GumK, GumM, GumJ e GumC foram construídos com o programa MODELLER 6.0a e validados com o programa Procheck e VERIFY 3D. Para construção do modelo da GumH (enzima que catalisa a adição da GDP-manose em um lipídio carreador poliprenol), o GenThreader encontrou similaridades quando comparada a MurG (E.coli), 2-epimerase (E. coli), GtfB (Amycolatopsis orientalis) e beta-GT de fago T4. Todos os modelos são bastante semelhantes e compostos por dois domínios (alfa/beta), ambos similares ao motivo de ligação de nucleotídeos Rossmann fold e separados por uma fenda profunda, que, provavelmente, forma o sítio de ligação da GDP-manose. Estudos da interação entre proteína e substrato foram obtidos com a utilização do programa FLO. O alinhamento seqüencial da GumH com outras onze glicosiltransferases mostrou regiões bastante conservadas, incluindo o motivo EX7E presente no sítio de ligação do substrato na proteína. Considerações a respeito das interações do substrato GDP-manose com a enzima GumH e do mecanismo da reação foram feitas. Essas análises enfatizam o modelo obtido para a GumH, que representa a primeira estrutura proposta para as enzimas envolvidas na síntese da goma fastidiana. / Xylella fastidiosa is a xylem-dwelling, insect-transmitted gamma-protobacterium that causes pathogenicity in citrus plants and many others important crops such as grapevine, periwinkle, almond, oleander and coffee. In citrus plants, X. fastidiosa causes citrus variegated chlorosis (CVC) or “amarelinho". Nine enzymes (GumB, C, D, E, F, H, J, K and M) are involved in the biosynthetic pathway of an exopolysaccharide (EPS) called fastidian gum which could be involved in the pathogenicity of the bacterium. These enzymes catalyses sugars addition reactions, polymerization and discharge of the EPS through the bacteria’s membrane. We have used bioinformatic tools to study these enzymes and to understand the gum biosynthesis. The nine enzymes were studied regarding to its secondary structure content, analysis of hidrophobicity and transmembrane regions, and yet function classification. The construction of structural models using sequential homology was shown to be impossible, due to the necessity of homologues molecules whose three-dimensional structures are known. On the other hand, pairwises comparisons of secondary structures showed good results and were realized with GenThreader and THREADER 3.3 programs. Three-dimensional structures to GumB, GumK, GumM, GumJ and GumC enzymes were constructed using MODELLER 6.0a and validated with Procheck and VERIFY 3D programs. To construct the model of GumH (enzyme that catalyse the addiction of a GDP-mannose on a polyprenol phosphate carrier), GenThreader found folding similarities when compared to MurG and UDP-Acetylglucosamine 2-Epimerase (from E. coli), GtfB (from Amycolatopsis orientalis) and beta-GT (from T4 phage). The models are very similar consisting of two alpha/beta open sheet domains, both alike in topology to the Rossmann nucleotide-binding folds, and separated by a deep cleft which probably forms the GDP-mannose binding site. Studies of the interaction between enzyme and docked substrate were carried out using the FLO program. The sequence alignment between GumH and another eleven glycosiltransferases showed several preserved regions including the EX7E motif present on the substrate binding site. The interactions between enzyme-GDP-mannose substrate and the mechanism of the reaction were studied. These analyses emphasize the three-dimensional model constructed for GumH that represents the first structural information for enzymes involved in fastidian gum synthesis.