As aminoacil tRNA sintetases (AaRSs) são enzimas essenciais na síntese de proteínas assegurando a correta relação entre os aminoácidos e seus tRNA cognatos. O genoma mitocondrial dos tripanossomatídeos perdeu os genes codificantes dos tRNAs, assim os tRNA mitocondriais são codificados no núcleo e importados do citoplasma. O código genético do kinetoplasto desvia do código genético pela utilização do códon de terminação UGA para a decodificação do códon do triptofano. Um único gene codificando o tRNATrp(CCA) observado no genoma de Leismania é responsável pela incorporação do aminoácido triptofano durante a síntese proteíca na mitocôndria. Para decodificar os dois códons do Trp (UGA e UGG) a base na posição 34 do tRNATrp(CCA) passa por um evento de editoração, convertendo o ribunuclotídeo C34 em U34, produzindo o tRNATrp(UCA) capaz de decodificar o códon UGA. Nesse trabalho foram caracterizadas duas triptofanil tRNA sintetases de Leishmania major. De acordo com experimentos de ?western blotting? e análises ?in silico? das seqüências de aminoácidos, uma enzima tem localização citoplasmática (LmTrpRS1) enquanto a outra mitocondrial (LmTrpRS2). Os mRNAs dos dois genes foram definidos por experimentos de 5? e 3? RT-PCR. As duas enzimas foram clonadas em diversos vetores de expressão procariotos e eucariotos. A LmTrpRS1 foi obtida somente na fração insolúvel, já a LmTrpRS2 foi obtida na fração solúvel quando clonada no vetor de expressão pET28a. Esta porém mostrou-se instável precipitando rapidamente após sua purificação. Os ensaios enzimáticos realizados com a mesma mostraram que ela é capaz de reconhecer os tRNAsTrp editado e não editado. Modelagem molecular por homologia com as duas proteínas foi realizada usando a proteína citoplasmática humana como molde, para estudar a interação entre a proteína e o tRNATrp. Xylella fastidiosa é um bactéria gram negativa limitada ao xilema, responsável por um grande número de doenças economicamente importantes, como a doença de Pierces em videiras, Clorose variegata do Citrus (CVC) e a doença da requeima das folhas em outras plantas incluindo, amendoeira, ameixeira, louro, amoreira e café. Em todos os casos a X. fastidiosa afeta o xylema da planta causando redução na produção de frutos. Nesse trabalho nós mostramos a estrutura da Xylellaína, uma cisteíno protease desse patógeno. A estrutura foi resolvida por dispersão anômala a um único comprimento de onda, utilizando cristais de xylellaína selenometionina substituídos. A estrutura da Xylellaína foi refinada até 1,65 Å de resolução, mostrando enovelamento similar às proteínas da família da papaína, porém algumas características interessantes como uma região N-terminal composta por 38 aminoácidos cobrindo o sulco ativo da enzima, um intrigante ribonucleotídeo encontrado fora do sítio ativo da enzima e um ?loop? semelhante ao ?loop? de oclusão presente na catepsina B. / The aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs) are essential enzymes in protein synthesis that ensure the correct match between amino acids and their cognate tRNAs. The mitochondrial (kinetoplast) genome of trypanossomatids lacks tRNA genes, and therefore nucleus-encoded tRNAs are imported from the cytoplasm, the kinetoplast genetic code deviates from the universal code in that UGA instead of UGG encodes for tryptophan. A single nucleus-encoded tRNATrp(CCA) is responsible for Trp insertion during organellar protein synthesis. To decode both Trp codons (UGA and UGG), tRNATrp(CCA) undergoes a single C to U editing event at position 34 of the anticodon yielding to versions of the tRNA in the mitochondria with anticodon CCA and UCA, permitting UGA decoding. This work have characterized two Leishmania major tryptophanyl-tRNA synthetase, acording western blotting experiments and ?in silico? sequence analisis one of cytoplasmatic localization (LmTrpRS1) and another from mitochondria localization (LmTrpRS2). The mature mRNA transcripts for both genes were defined by 5? and 3? RT-PCR. Both enzymes were cloned into several expressions vectors. LmTrpRs1 was obtained as an insoluble protein and LmTrpRs2 expressed into the soluble fraction in pET28a expression system. LmTrpRS2 protein, however, is unstable precipitating shortly after purification. The enzymatic assay showed that this enzyme is able to recognize both tRNATrp. Molecular modeling for LmTrpRS1 and LmTrpRS2 were constructed using the cytoplasmatic human tryptophanyl tRNA synthetase as a model, to study the interaction between proteins and tRNATrp. Xylella fastidiosa is a xylem-limited, gram-negative bacteria responsible for a large number of economically important plant diseases, such as Pierces disease in grapevines, citrus variegated chlorosis (CVC) in sweet oranges and leaf scorch diseases in other plants, including almond, plum, oleander, mulberry and coffee. In all cases, X. fastidiosa infects the plant xylem and impairs fruit production. Here, we report the crystal structure of xylellain, a cystein protease from X. fastidiosa. The structure was solved by single-wavelength anomalous dispersion (SAD) using seleno-methionine containing xylellain crystals. The final structure of Xylellaína was refined against the best native data set (1.65 Å) showing R/Rfree= 17/21. Xylellain shares fold similar to Papain like Family, but contains some interesting features, like a 38 N-terminal tail covering the active site cleft; one intriguing ribonucleotide found outside the active site and one loop that resemble the ocluding loop from cathepsin B.

Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, limitada ao xilema das plantas e o agente causador de diversas doenças em importantes plantações como citros, videiras, mirta, amêndoa, arbustos e café. Em citros, X. fastidiosa causa a Clorose Variegada dos Citros (CVC) ou “amarelinho”. Nove enzimas (GumB, C, D, E, F, H, J, K e M) estão envolvidas nas etapas biossintéticas de um polissacarídeo extracelular (EPS), chamado de goma fastidiana, um dos mecanismos envolvidos na patogênese da bactéria. Essas enzimas catalisam reações de adição de açúcares, polimerização e exportação do EPS através da membrana da bactéria. No presente trabalho, ferramentas de bioinformática foram utilizadas para o estudo e entendimento da biossíntese da goma fastidiana. As nove enzimas foram estudadas quanto ao seu conteúdo de estrutura secundária, análise de hidrofobicidade e das regiões transmembrânicas, classificação quanto as suas funções. A construção de modelos estruturais para as enzimas Gums através de comparação por homologia seqüencial mostrou ser um processo impossível, devido a falta de moléculas homólogas com estruturas tridimensionais conhecidas. Por outro lado, métodos de reconhecimento de enovelamento mostraram bons resultados e comparações entre as estruturas secundárias das enzimas Gums foram calculadas com a utilização dos programas GenThreader e THREADER 3.3. Modelos tridimensionais para as enzimas GumB, GumK, GumM, GumJ e GumC foram construídos com o programa MODELLER 6.0a e validados com o programa Procheck e VERIFY 3D. Para construção do modelo da GumH (enzima que catalisa a adição da GDP-manose em um lipídio carreador poliprenol), o GenThreader encontrou similaridades quando comparada a MurG (E.coli), 2-epimerase (E. coli), GtfB (Amycolatopsis orientalis) e beta-GT de fago T4. Todos os modelos são bastante semelhantes e compostos por dois domínios (alfa/beta), ambos similares ao motivo de ligação de nucleotídeos Rossmann fold e separados por uma fenda profunda, que, provavelmente, forma o sítio de ligação da GDP-manose. Estudos da interação entre proteína e substrato foram obtidos com a utilização do programa FLO. O alinhamento seqüencial da GumH com outras onze glicosiltransferases mostrou regiões bastante conservadas, incluindo o motivo EX7E presente no sítio de ligação do substrato na proteína. Considerações a respeito das interações do substrato GDP-manose com a enzima GumH e do mecanismo da reação foram feitas. Essas análises enfatizam o modelo obtido para a GumH, que representa a primeira estrutura proposta para as enzimas envolvidas na síntese da goma fastidiana. / Xylella fastidiosa is a xylem-dwelling, insect-transmitted gamma-protobacterium that causes pathogenicity in citrus plants and many others important crops such as grapevine, periwinkle, almond, oleander and coffee. In citrus plants, X. fastidiosa causes citrus variegated chlorosis (CVC) or “amarelinho”. Nine enzymes (GumB, C, D, E, F, H, J, K and M) are involved in the biosynthetic pathway of an exopolysaccharide (EPS) called fastidian gum which could be involved in the pathogenicity of the bacterium. These enzymes catalyses sugars addition reactions, polymerization and discharge of the EPS through the bacteria’s membrane. We have used bioinformatic tools to study these enzymes and to understand the gum biosynthesis. The nine enzymes were studied regarding to its secondary structure content, analysis of hidrophobicity and transmembrane regions, and yet function classification. The construction of structural models using sequential homology was shown to be impossible, due to the necessity of homologues molecules whose three-dimensional structures are known. On the other hand, pairwises comparisons of secondary structures showed good results and were realized with GenThreader and THREADER 3.3 programs. Three-dimensional structures to GumB, GumK, GumM, GumJ and GumC enzymes were constructed using MODELLER 6.0a and validated with Procheck and VERIFY 3D programs. To construct the model of GumH (enzyme that catalyse the addiction of a GDP-mannose on a polyprenol phosphate carrier), GenThreader found folding similarities when compared to MurG and UDP-Acetylglucosamine 2-Epimerase (from E. coli), GtfB (from Amycolatopsis orientalis) and beta-GT (from T4 phage). The models are very similar consisting of two alpha/beta open sheet domains, both alike in topology to the Rossmann nucleotide-binding folds, and separated by a deep cleft which probably forms the GDP-mannose binding site. Studies of the interaction between enzyme and docked substrate were carried out using the FLO program. The sequence alignment between GumH and another eleven glycosiltransferases showed several preserved regions including the EX7E motif present on the substrate binding site. The interactions between enzyme-GDP-mannose substrate and the mechanism of the reaction were studied. These analyses emphasize the three-dimensional model constructed for GumH that represents the first structural information for enzymes involved in fastidian gum synthesis.

O gênero Xylella é composto de uma única espécie, Xylella fastidiosa, bactéria Gram-negativa, não flagelada, que coloniza o xilema de uma diversidade de plantas cultivadas e silvestres em várias partes do mundo. Em algumas dessas plantas, a bactéria é considerada agente causal de doenças, como a Clorose Variegada do Citros em laranjeiras, a Doença de Pierce das videiras e escaldadura da folha de cafeeiro. Onze diferentes cepas de X. fastidiosa, isoladas de distintos hospedeiros, já tiveram seus genomas sequenciados, entre essas, as cepas 9a5c, isolada de laranjeira, e Temecula 1, isolada de videira. Análises desses genomas indicam uma razoável variabilidade entre suas respectivas sequências e evidenciam vários genes associados a mecanismos de virulência e patogenicidade desta bactéria. No presente trabalho descrevemos o sequenciamento, a montagem e a anotação dos genomas das cepas U24d e Fb7, isoladas de laranjeiras, e da cepa 3124 isolada de cafeeiro, os quais apresentam, respectivamente 2.681.334 pb, 2.733.974 pb e 2.748.594 pb. Destas, apenas a cepa U24d apresenta um plasmídeo, o qual é idêntico ao pXF51 previamente identificado na cepa 9a5c. O genoma da cepa U24d é praticamente colinear ao genoma da cepa 9a5c enquanto que os genomas das cepas Fb7 e 3124 apresentaram maior colinearidade com a cepa Temecula1. Entre as diversas alterações encontradas nas análises comparativas destes genomas, destacamos a inserção no gene pilQ verificada no genoma da cepa U24d. Essa mutação causa ausência do pilus do tipo IV com consequente deficiência na motilidade twitching, sendo que plantas infectadas com a cepa U24d apresentam sintomas localizados restritos ao ponto de inoculação. Na cepa Fb7, detectamos a ausência de formação de biofilme no cultivo in vitro possivelmente devido ausência da expressão dos transcritos de mrkD e pspA, que codificam respectivamente adesina do pilus curto e adesina similar à hemaglutinina. Postulamos que estes genes não são expressos em decorrência de um defeito na via de sinalização de DSF (Fator de Sinalização Difusível) reflexo de uma mutação em rpfC no genoma de Fb7. Assim como as demais cepas de X. fastidiosa, também os genomas de U24d, Fb7 e 3124 apresentaram elevado conteúdo de Elementos Genéticos Móveis (EGM), que aparecem em maior número nas cepas sul-americanas. Os estudos do pangenoma de X. fastidiosa mostraram que essa espécie tem um genoma aberto e grande parte dos genes de EGMs correspondem a genes acessórios. A grande quantidade de EGMs em X. fastidiosa pode estar relacionada a falta do sistema CRISPR/cas completo, um provável resultado de eventos de erosão do genoma desta espécie. A inferência filogenética por MSLA mostrou uma clara distinção dos grupos de cepas da América do Norte em relação às do Sul, sugerindo a ocorrência de mais eventos de recombinações genéticas nas cepas sul-americanas, provavelmente pela falta de isolamento geográfico. Assim, é possível que as cepas norte e sul-americanas sofreram divergência alopátrica e simpátrica, respectivamente. / The genus Xylella consists of a single species, Xylella fastidiosa, a Gram-negative and non-flagellated bacterium that colonizes the xylem of a diversity of cultivated and wild plants in several parts of the world. In some of these plants, this bacterium is considered causal agent of diseases such as the Citrus Variegated Cholorosis in orange trees, Pierce\'s Disease of grapevines and coffee leaf scald. Eleven different strains of X. fastidiosa isolated from different hosts had their genomes sequenced, including 9a5c and Temecula1 strains, respectively isolated from orange tree and grapevine. Analyses of these genomes indicate a reasonable variability in their sequences and showed several genes associated with pathogenicity and virulence mechanisms of this bacterium. In this work we describe the genome sequencing, assembly and annotation of the strains U24d and Fb7, isolated from orange trees, and 3124 isolated from coffee, which have, respectively, 2,681,334 bp, 2,733,974 bp and 2,748,594 bp. Of these, only strain U24d has a plasmid, identical to pXF51 from strain 9a5c. The genome of U24d strain is almost collinear to the genome of strain 9a5c while the genomes of strains Fb7 and 3124 had higher collinearity to Temecula1 strain. Among many changes found in the comparative analysis of these genomes, we highlight an on insertion in pilQ gene that was found in U24d strain genome. This mutation causes lack of type IV pilus with a consequent deficiency in twitching motility. Moreover orange trees infected with U24d strain showed localized symptoms near to the inoculation point. We verified that Fb7 strain does not form biofilm in vitro possibly due to the absence of expression of mrkD and pspA transcripts, which encode, respectively, a short pilus adhesin and a hemagglutinin-like adhesin. We postulate that these genes are not expressed due to a defect in the signaling pathway of DSF (Diffusible Signal Factor) reflecting a mutation on rpfC in the Fb7 genome. Similarly to other X. fastidiosa strains, the genomes of U24d, Fb7 and 3124 also showed high content of mobile genetic elements (MGE), which appear in larger numbers in South American strains. Pan genome studies of X. fastidiosa showed that this species has a open genome and that most of MGE genes correspond to accessory genes. The large number of MGE in X. fastidiosa may be related to the lack of a complete system CRISPR/cas, likely a result of erosion events of the genome of this species. The phylogenetic reconstruction by MLSA showed a clear distinction between groups of strains from North and South America, suggesting the occurrence of more recombination events in South American strains, probably due to lack of geographical isolation. Thus it is possible that North and South American strains underwent allopatric and sympatric divergence, respectively.

Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa, do subgrupo das Gama-Proteobactérias, não-flagelada, que coloniza o xilema de diversas plantas cultivadas e silvestres, podendo ser causadora de doenças. Sua disseminação é feita por insetos conhecidos como cigarrinhas. Genomas de cepas de X. fastidiosa isoladas de distintos hospedeiros já foram sequenciados completa ou parcialmente: 9a5c de citros; Temecula-1 e GB514 de videira; Dixon, M12 e M23 de amendoeira; Ann-1 de espirradeira e EB92-1, isolada de sabugueiro e utilizada como bio-controle para Doença de Pierce de videiras. Estudos de genômica comparativa associados a abordagens de genômica funcional e de genética molecular têm possibilitado o estudo detalhado de mecanismos potencialmente relevantes tanto para a colonização de plantas e insetos por este fitopatógeno como para o desenvolvimento de sintomas associados a doenças específicas em seus respectivos hospedeiros vegetais. Exceto o genoma de 9a5c, todos os demais genomas conhecidos são de cepas isoladas na América do Norte. Neste trabalho descrevemos o pirossequenciamento dos genomas da cepa J1a12, que exibe fenótipo não-virulento em citros, e das cepas Pr8x e Hib4, isoladas, respectivamente, de ameixeira e hibisco. A cepa J1a12 possui além de seu cromossomo principal de 2.788.789 pb dois plasmídeos, pXF51 e pXF27, respectivamente de 51.180 pb e 27.268 pb. pXF51 já foi descrito também na cepa de citros 9a5c e pXF27 tem similaridade com outros plasmídeos de cepas de X. fastidiosa norte-americanas isoladas de amoreira e videira. A cepa Pr8x possui além de seu cromossomo principal de 2.666.242 pb um plasmídeo, pXF39, de 39.580 pb, o qual contém a maioria das CDS presentes no pXF51. A cepa Hib4, isolada de hibisco, tem o maior cromossomo (2.813.297 pb) e também o maior plasmídeo (pXF64 com 64.251 pb) já descritos para X. fastidiosa. pXF64 apresenta extensa similaridade com o plasmídeo pBVIE04 de Burkholderia vietnamensis cepa G4, sendo descrito pela primeira vez em cepas de X. fastidiosa. Análises comparativas destes genomas possibilitaram a identificação de alterações que podem ser correlacionadas com os fenótipos exibidos por estas cepas, além da variedade e diversidade de regiões relacionadas a bacteriófagos e de plasmídeos que co-existem nas diferentes cepas deste fitopatógeno. / Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacteria, of the Gamma-proteobacterium subgroup, non-flagellated that colonizes the xylem of several cultivated and wild plants, where may cause disease. The bacterium is spread by insects known as sharpshooters. Genomes of X. fastidiosa strains isolated from different hosts have been completely or partially sequenced: 9a5c from citrus; Temecula-1 and GB514 from grapevine; Dixon, M12 and M23 from almond tree; Ann-1 from oleander and EB92-1, isolated from elderberry and used as bio-control for Pierce\'s disease of grapevines. Comparative genomics studies associated with approaches from functional genomics and molecular genetics have allowed a detailed study of mechanisms potentially relevant to the colonization of plants and insects by this pathogen as well as to the development of symptoms associated with specific diseases in their respective host plants. Except for 9a5c, all other known genomes are from strains isolated in North America. Here we describe the pyrosequencing of the genomes of strain J1a12, which displays non-virulent phenotype in citrus and of Pr8x and Hib4 strains isolated, respectively, from plum and hibiscus. J1a12 has a main chromosome of 2,788,789 bp and two plasmids, pXF51 and pXF27, respectively of 51,180 bp and 27,268 bp. pXF51 has been described also in the citrus strain 9a5c and pXF27 has similarity with other plasmids found in North American strains isolated from mulberry tree and grapevine. The strain Pr8x has a main chromosome of 2,666,242 bp and one plasmid, pXF39, of 39,580 bp which present similarities with pXF51. Hib4, the strain isolated from hibiscus, has the largest chromosome (2,813,297 bp) and the largest plasmid (pXF64 with 64,251 bp) described for X. fastidiosa. pXF64 shows extensive similarity with the plasmid pBVIE04 of Burkholderia vietnamensis G4 strain and is described for the first time in X. fastidiosa. Comparative analyzes of these genomes have identified several differences that may be correlated with the phenotypes displayed by these strains, in addition to the variety and diversity of regions related to bacteriophages and plasmids that co-exist in different strains of this pathogen.

Orientadores: José Camilo Novello, Ione Salgado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T05:39:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fontanesi_KarinaKleinfelder_M.pdf: 2853236 bytes, checksum: 30ce9c486d1739927e3bd38f96e22015 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O sistema citrícola no Brasil representa um setor de grande importância econômica. O Estado de São Paulo é o principal produtor de citros, fazendo do país o maior exportador de suco de laranja concentrado congelado. Apesar do Brasil ocupar uma posição de destaque no cenário mundial de citricultura, o país não consegue aumentar a sua produtividade devido à ocorrência simultânea de pragas e doenças, sendo que a clorose variegada dos citros (CVC) se mostra como uma das mais limitantes sobre esta produção. Ela é causada pela bactéria Xylella fastidiosa, que é capaz de infectar todas as variedades de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), embora a tangerina Poncan (Citrus reticulata Blanco) seja considerada tolerante à sua infecção. Apesar de muitos estudos já tenham sidos realizados a fim de se compreender melhor os mecanismos da sua patogenicidade, questões ainda permanecem em aberto acerca dos mecanismos que controlam o seu processo de infecção e o desenvolvimento da doença. Desse modo, foi realizado um estudo comparativo do proteoma das folhas de laranja Pêra e de tangerina Poncan após 30 dias da inoculação com a X. fastidiosa e o dos obtidos de folhas não infectadas, empregando a técnica de eletroforese bidimensional (2DE) e espectrometria de massas (MS). Foram confeccionados mapas 2DE com o intuito de se verificar proteínas diferencialmente expressas que por ventura poderiam estar relacionadas aos mecanismos de defesa e resistência da planta. Entre as proteínas (spots) de laranja Pêra, separadas por eletroforese bidimensional, 60 spots foram considerados como estatisticamente relevantes, apresentando alteração de intensidade. Entre as proteínas de tangerina Poncan analisadas na mesma condição, 38 foram consideradas como estatisticamente relevantes. Confeccionou-se para a planta tangerina Poncan géis de poliacrilamida utilizando IPG com gradiente de pH linear de 4-7, visto que houve um grande número de proteína diferencialmente expressas nesta faixa. Como resultado, foram obtidos 45 spots com diferença de expressão. A identificação dessas proteínas foi feita por meio do seqüenciamento por espectrometria de massas através do sistema LC ESI-MS/MS ou MALDI-Q-TOF. O seqüenciamento por MS possibilitou a aquisição da seqüência de aminoácidos de 49,7% dos spots. Dentre eles, 76% dos spots foram identificados, enquanto que 24% não apresentaram homologia com nenhuma base de dados. Entre as proteínas identificadas quatro foram representadas por mais de um spot, podendo indicar a ocorrência de eventos provenientes do splicing alternativo, modificações pós-traducionais, variações alélicas de uma mesma proteína ou degradação da amostra. As proteínas identificadas foram relacionadas com a produção de energia, com o metabolismo primário, com mecanismo de defesa, proteínas de microrganismos e proteínas desconhecidas. Laranja Pêra apresentou uma diminuição da expressão de proteínas relacionadas à fotossíntese, o que coincide com os primeiros efeitos sentidos pelas plantas colonizadas pela bactéria. Em contrapartida, tangerina Poncan apresentou um aumento de expressão de proteínas relacionadas à resposta de defesa contra esse patógeno. / Abstract: The citrus system in Brazil represents one of the most important economic sectors. The State of São Paulo is the main producer of citrus, settling the country as the biggest exporter of concentrated freezing orange juice. Besides holding the outstanding position in the worldwide citrus culture scene, the country cannot raise its productivity due to simultaneous occurrence of plagues and diseases, being the citrus variegated chlorosis (CVC) one of the most limiting diseases affecting the citrus production. This disease is caused by bacterium Xylella fastidiosa, that which is able to infect all sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) varieties, however ponkan (Citrus reticulate Blanco) was considered resistant to it. Although, many studies have already been done in order to understand, in a better way, the mechanism of its pathogenicity, there are still queries about the mechanisms which control the process of its infection and the development of the disease. In this manner, we did a comparative proteomics study of leaves from sweet orange and ponkan after 30 days of the inoculation with X. fastidiosa versus leaves not infected with this bacterium (healthy plants), using two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and mass spectrometry techniques. Comparative 2DE maps were done with the aim to verify differentially expressed proteins related with defense mechanism and the plant resistance. Among the proteins (spots) extracted from sweet orange, separated by two-dimensional gel electrophoresis, 60 spots were considered with statistical significance, showing intensity alteration. On the other hand, among the proteins (spots) extracted from ponkan and analyzed in the same condition, 38 spots were considered with statistical significance. Gels using linear pH gradient ranging from 4 to 7 were prepared for ponkan gels using, because there were a larger number of differentially expressed proteins in this area. As a result, we obtained 45 spots with difference in its expression. The identification of these proteins was done by sequencing using mass spectrometry like LC ESI-MS/MS or MALDI-Q-TOF. 143 spots were analyzed by mass spectrometry and were obtained amino acid sequence from 71 (49,7%) of the spots. Between them, 54 (76%) were identified, while 17 (24%) presented no homology in the database used. Overall, 4 proteins appeared as multiple spots and accounted for most of the protein found in the group. This observation may reflect post-translation modification, alternative splicing events, isozyme variation, allelic variation of the same protein, but also protein degradation. The identified proteins play a role in energy, primary metabolism, defense mechanism, unknown proteins and microorganism proteins. The sweet orange presented a decrease in expression of photosynthesis related protein, indicating a possible lower photosynthetic activity resulting from early effects of the bacterial colonization in affected plants. On the other hand, ponkan showed an increase in defense-related proteins response against this pathogen. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Ricardo Aparício / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pelloso_AlexandreCesar_M.pdf: 8109350 bytes, checksum: fc162ef3c04f105331de4e0c0bb979f3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Após o sequenciamento do genoma da Xylella fastidiosa, linhagem 9a5c houve um grande aumento de informações relacionadas a este organismo. Porém grande parte das proteínas desta bactéria ainda não apresentam funções preditas. No presente estudo, objetivou-se a caracterização inicial de três proteínas deste micro-organismo, a saber: XfCysB (orf Xf0683), XfLysRL (orf Xf1448) e XfycjZ (orf Xf1480). Essas proteínas apresentam alta similaridade com membros da família de reguladores transcricionais do tipo LysR (LTTR). Os LTTR constituem a família de reguladores mais comuns em procariotos e apresentam funções diversas tais como regulação de genes envolvidos no metabolismo, divisão celular, quorum sense, virulência, resposta ao estresse oxidativo, entre outras. Dentre as proteínas em estudo, a única proteína que possui predição dentro da família LysR é a XfCysB, cujas proteínas homólogas, já caracterizadas, estão envolvidas na regulação do operon cys, o qual está envolvido na biossíntese de cisteína. Após a clonagem das proteínas, a caracterização estrutural foi feita por Cromatografia de Exclusão por Peso Molecular, em que foi possível observar o estado oligomérico da proteína; Dicroísmo Circular para verificar se a proteína apresenta estrutura secundária estruturada e SAXS (Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos) ,apenas para a proteína XfLysRL, para a determinação do envelope da proteína em solução. A caracterização funcional foi feita pela análise da expressão das proteínas durante as diferentes fases de formação do biofilme (5, 10, 15, 20 e 30 dias de crescimento) de X. fastidiosa por Western blot utilizando anticorpos específicos para cada proteína em estudo. Com os resultados obtidos pode-se estimar que a massa molecular da proteína XfLysRL é de 50 kDa quando em solução, indicando que a XfLysRL encontra-se na forma dimérica, uma vez que a massa molecular do monômero é de 23,7 kDa. Possui também a estrutura secundária estruturada, sendo estável de 4°C a 44 ° C. Foi possível verificar também que a proteína está monodispersa quando em solução, é estruturalmente globular e pôde-se produzir, com os dados obtidos, um primeiro modelo para a estrutura da proteína. Já a proteína XfCysB teve a sua massa estimada em 45,3 kDa quando em solução e de 195,1 kDa quando na presença do seu co-indutor específico, além de apresentar uma estrutura secundária estruturada. Em relação à proteína XfycjZ pôde-se observar que esta quando em solução possui uma massa molecular estimada em 174,8 kDa demonstrando que sua forma oligomérica é de tetrâmero. Os estudos funcionais indicam que as três proteínas são expressas durante a formação do biofilme de X. fastidiosa, ou seja, estão presentes nos 6 tempos analisados. Deste modo, o estudo detalhado das presentes proteínas torna-se importante devido a sua presença na formação do biofilme de X. fastidiosa, um dos mecanismos de patogenicidade da bactéria. Outro fator importante é a utilização dos resultados da caracterização estrutural na elucidação do papel desempenhado pelas proteínas, visto que a estrutura protéica está diretamente envolvida com sua função / Abstract: After sequencing the genome of Xylella fastidiosa, strain 9a5c, there was a large increase in information related to this organism, but most of the proteins produced by these bacteria do not have predicted functions. In this study, the objective was the initial characterization of three proteins of this organism, namely XfCysB (orf Xf0683) XfLysRL (orf Xf1448) and XfycjZ (orf Xf1480). These proteins show high similarity to members of the family of LysR-type transcriptional regulators (LTTR). The LTTR family of regulators is the most common in prokaryotes and has diverse functions such as regulation of genes involved in metabolism, cell division, quorum sense, virulence, oxidative stress response, among others. Among the proteins under study, the only protein that has more specific prediction of classification within the family is the LysR XfCysB, which already characterized homologous proteins are involved in the regulation of cys operon, which is involved in the biosynthesis of cysteine. After cloning the protein, structural characterization was performed using the techniques of Exclusion Chromatography for Molecular Weight that shows the oligomeric state of the protein; circular dichroism to determine if protein has folded and stable secondary structure and SAXS (X-Ray Scattering at Small Angle) for the determination of protein structure in solution. Functional characterization was performed by analyzing the expression of proteins during different stages of biofilm formation (5, 10, 15, 20 and 30 days of growth) of X. fastidiosa by producing antibodies specific for each protein under study and performance of Western blot using total protein extract of the antibody produced against biofilm. With results obtained it was possible to estimate that the molecular weight of protein was 50 kDa XfLysRL in solution, indicating that the XfLysRL is in dimeric form, since the molecular weight of the monomer is 23.7 kDa. It also has a stable secondary structure folded and supporting a rise in temperature to 44° C. It was also verified that the protein is monodisperse in solution, is structurally globular and could be produced, with the data obtained, a first model for the structure of the protein. The protein XfCysB had its mass estimated at 45.3 kDa in solution and 195.1 kDa in the presence of its coinducer specific, besides presents a folded secondary structure. Regarding the protein XfycjZ was observed that when this solution has a molecular mass of 174.8 kDa demonstrating that it's oligomeric form is a tetramer. Functional studies indicate that the three proteins were expressed during the biofilm formation of X. fastidiosa, follows that they are present in 6 times analyzed. Thus, the detailed study of these proteins is important because their presence in biofilm formation of X. fastidiosa, one of the mechanisms of pathogenicity of the bacteria. Another important factor is the use of results in the structural elucidation of the role of proteins because the protein structure is directly involved in its function / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Linhagens mutantes foram obtidas para os fatores sigma <font face=\"symbol\">sE (RpoE) e <font face=\"symbol\">sN (RpoN) da bactéria Xylella fastidiosa. O mutante rpoE mostrou-se sensível a etanol e a choque térmico. Análises de microarranjo de DNA, de RT-PCR quantitativo e mapeamento de sítios de início de transcrição permitiram definir o regulon <font face=\"symbol\">sE em resposta ao choque térmico. Verificou-se co-transcrição entre os genes que codificam para <font face=\"symbol\">sE, seu anti-sigma e uma protease, e <font face=\"symbol\">sE não se mostrou auto-regulado, mas regulou o gene do anti-sigma. Análises similares às acima indicaram que o gene pilA, codificando a pilina da fímbria tipo IV, é positivamente regulado por <font face=\"symbol\">sN, enquanto o operon codificando proteínas da fímbria tipo I é regulado negativamente, explicando a maior formação de biofilme e auto-agregação no mutante rpoN. O perfil temporal de expressão da linhagem selvagem J1a12 em carência de nitrogênio foi determinado, além de genes induzidos por carência de nitrogênio via <font face=\"symbol\">sN. Assim, <font face=\"symbol\">sN regula genes de fímbrias e de resposta à carência de nitrogênio em Xylella fastidiosa. / Mutant strains were obtained for the sigma factors <font face=\"symbol\">sE (RpoE) and <font face=\"symbol\">sN (RpoN) in Xylella fastidiosa. The rpoE mutant showed to be sensitive to ethanol and heat shock. Microarray and quantitative RT-PCR analyses and determination of transcription start sites permitted to define the <font face=\"symbol\">sE regulon under heat shock. Co-transcription of the genes encoding <font face=\"symbol\">sE , its anti-sigma factor and a protease was observed, and <font face=\"symbol\">sE did not present auto-regulation, but it regulated the gene encoding the anti-sigma. Similar analyses indicated that the pilA gene, encoding the pilin of the type IV fimbriae, is positively regulated by <font face=\"symbol\">sN, while the operon encoding proteins of the type I fimbriae is negatively regulated, what explains the increased biofilm formation and auto-aggregation in the rpoN strain. Temporal expression profile of wild type strain J1a12 under nitrogen starvation was determined, as well as genes induced by nitrogen starvation via <font face=\"symbol\">sN. Thus, <font face=\"symbol\">sN regulates genes encoding fimbriae and genes for nitrogen starvation response in Xylella fastidiosa.

O objetivo principal do presente estudo foi avaliar a diversidade bacteriana endofítica cultivável associada a plantas de Citrus sinensis (L.) Osbeck sintomáticas e assintomáticas para a doença Greening, com destaque para Methylobacterium spp. Simultaneamente, como objetivo secundário, foi realizado o estudo da comunidade bacteriana endofítica de Methylobacterium spp. presente em plantas de laranja doce com e sem sintomas da Clorose Variegada dos Citros (CVC). Assim, em período chuvoso (novembro de 2008 e fevereiro de 2009) e seco (maio de 2009) foram amostradas dez plantas sadias e dez plantas doentes (Greening e/ou CVC), em dois municípios citrícolas da região central do estado de São Paulo. A confirmação da presença e/ou ausência dos fitopatógenos Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, agentes causadores do Greening e, também, de Xylella fastidiosa, agente causador da CVC foram realizadas para todas as amostras pela técnica PCR a partir da utilização de iniciadores específicos para os respectivos fitopatógenos. Em relação à comunidade bacteriana estudada, foi realizado o isolamento e posterior quantificação do número de unidades formadoras de colônia (UFCs) totais e de Methylobacterium, caracterizadas pela presença de coloração rósea. A análise do sequenciamento parcial da região do gene 16S DNAr e agrupamentos filogenéticos dos isolados amostrados foram as metodologias adotadas para a geração dos resultados. Os resultados revelaram que a quantidade de Methylobacterium spp. isoladas em plantas sintomáticas para as doenças Greening e CVC foi expressivamente superior em relação as plantas sadias, destacando-se as espécies M. fujisawaense e M. radiotolerans, que foram os filotipos mais encontrados nas referidas amostras. As amostras vegetais coletadas em período seco, também, apresentaram maior presença da comunidade metilotrófica. A observação dos resultados da comunidade endofítica cultivável total associada a plantas sintomáticas e assintomáticas para Greening, mostrou que não houve diferenças relevantes quanto as UFCs encontradas nas plantas doentes e sadias. Foram encontradas as classes: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria e Firmicutes e os gêneros mais frequentes foram Brevundimonas, Alcaligenes e Pantoea. Em relação às características adaptativas de Methylobacterium spp. quanto a situações de estresses, foram verificadas in vitro a produção da enzima ácido aminociclopropano-1-carboxilato deaminase (ACCd) e tolerância aos metais pesados cádmio e chumbo. Dos 62 isolados avaliados, 63% foram capazes de utilizar a molécula de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) como fonte de nitrogênio para seu desenvolvimento. Os testes para tolerância ao metais pesados revelaram que apenas 3 isolados foram capazes de crescer em meio CHOI suplementado com sulfato de cádmio nas concentrações de 2,5 e 5,0 mM. Somente dois isolados se mostraram tolerantes ao chumbo, presente no meio CHOI suplementado com nitrato de chumbo nas concentrações 2,5 mM. Já em 5 mM, apenas um isolado foi capaz de se desenvolver. Os resultados, apresentados mostram a importância de Methylobacterium spp., sobre a comunidade endofítica cultivável de citros em dois diferentes patossistema avaliados, uma vez que em ambos foi observada uma maior quantidade de isolados do gênero em plantas doentes, sugerido uma associação com os respectivos fitopatógenos. A produção de ACCd por Methylobacterium está relacionada entre outros fatores, a interrupção da rota de síntese do etileno, composto relacionado ao estresse vegetal. Assim, a grande quantidade de Methylobacterium em plantas doentes e a produção de ACCd pelas mesmas, possivelmente, estão relacionadas ao favorecimento do patógeno mediante a redução da capacidade de resposta da planta / The aiming of this study was the evaluation of the diversity of endophytic culturable bacterial community associated with Huanglongbing (HLB) symptomatic and no-symptomatic Citrus sinensis (L.) Osbeck plants, highlighting the Methylobacterium spp. Simultaneously, it was evaluated the endophytic Methylobacterium community in sweetie orange with and without Citrus Variegated Chlorosis (CVC) symptoms. Thus, it was sampled ten healthy and no-health plants with HLB and CVC symptoms in raining (November 2008 and February are 2009) and dryed (may 2009) seasons in two provinces at São Paulo State. The presence or absence of the plant-pathogens Candidatus Liberibacter americanus, Ca. L. asiaticus e Ca. L africanus, HLB agents and Xylella fastidiosa, CVC agent, was confirmed using specific primer by PCR for all plant samples. The bacterial communities was accessed by isolation and posteriori quantification of colony forming unit (CFU) to total and Methylobacterium group that was identified according its pink coloration. To the identification and phylogenetic clusterization of the isolates was partially sequenced the 16S DNAr gene. The results showed a higher amount of isolated Methylobacterium spp. from symptomatic plants to HLB and CVC than healthy plant. M. fujisawaense and M. radiotolerans were present in these samples. The plants sampled in dryed season showed a high amount of methilotrific isolates. It was not observed a significant difference of the amount of total bacteria isolated from HLB symptomatic and no-symptomatic plants The identified classes was: Actinobacteria, Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria and Firmicutes. Brevundimonas, Alcaligenes and Pantoea were the most frequent genera. It was verified the acid aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACCd) production and the lead and cadmium tolerance as the adaptative characteristic of Methylobacterium to stress conditions. 63% of the 62 evaluated isolates were able to use the aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) as nitrogen source. Just 3 isolates were able to grow in supplemented CHOI media at 2.5 e 5.0 mM of sulphate of cadmium. Two isolates showed lead tolerance in the same media supplemented with nitrate of lead at 2.5 mM and just one at 5.0mM.The results showed the importance of Methylobacterium spp. to citrus culturable endophytic community in two pathossystem. In both the amount of methylotrofic isolates was higher in symptomatic plants, suggesting its association with the plant-pathogens. The Methylobacterium ACCd production has a relationship with the breaking of ethylen route. This compound is associated with vegetal stress. For this reason the high amount of Methylobacterium from symptomatic plants and the ACCd production probably is correlated with the disease development under the reduction of plant response capacity

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T07:11:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_WillianEduardoLino_M.pdf: 4114093 bytes, checksum: f064932e99a8077c41524b40c01c7dbe (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A citricultura brasileira representa um setor comercial muito rico, porém a produtividade brasileira é baixa, sobretudo em razão de pragas e doenças, como a Clorose Variegada do Citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa que afeta todas as variedades de laranja doce (Citrus sinensis). O melhoramento genético de citros é um desafio em virtude da baixíssima variabilidade genética e do grande avanço de pragas e doenças. Uma alternativa para acelerar a obtenção de plantas resistentes a doenças seria a obtenção de plantas transgênicas. A seleção de genes candidatos em citros seria uma excelente estratégia, não fossem dificuldades para transformação genética como escapes, enraizamento, enxertia e longo ciclo da cultura. A solução para acelerar o conhecimento do potencial do gene em conferir resistência ao patógeno seria então o uso de hospedeiros alternativos como Nicotiana tabacum e Arabidopsis thaliana, pois possuem grande informação genética, protocolos simples de transformação e ciclo de vida curto. Devido à identificação prévia por transcritoma de genes possivelmente associados à resistência de Citrus reticulata a X. fastidiosa, torna-se necessário o estudo da função desses genes para aplicação por transgenia visando resistência em C. sinensis. Assim, o objetivo do trabalho foi utilizar plantas modelo (tabaco e Arabidopsis) para estudo funcional desses genes potenciais. Nossos resultados indicaram que Arabidopsis é moderadamente resistente à infecção por X. fastidiosa, uma vez que a bactéria não consegue colonizá-la eficientemente. Utilizando plantas mutantes de Arabidopsis para os genes candidatos RPS5, RAP2.2, MOA2.2, PseudoNBS, ERF73, RD22 e ATJ2 (homólogos aos diferencialmente expressos em C. reticulata sob infecção) verificou-se que dois deles, RPS5 e RAP2.2, estão envolvidos na resistência à bactéria, pois na ausência deles a bactéria colonizou mais eficientemente o hospedeiro, e portanto, são bons candidatos para superexpressão em C. sinensis visando resistência à CVC. RPS5 codifica uma proteína do tipo CC-NBS-LRR, comumente responsável pelo reconhecimento de moléculas dos patógenos e desencadeando vias de sinalização, enquanto o gene RAP2.2 codifica um fator de transcrição relacionado à uma via de sinalização mediada por etileno, de forma a desencadear respostas contra a infecção. Em relação a tabaco foi estudado a colonização da bactéria visando estabelecer um bioensaio quantitativo. Nesse sentido, foi elaborada e validada uma escala diagramática para correta aferição da severidade da doença nas folhas. Também foi estabelecida uma correlação entre níveis de severidade e população bacteriana, permitindo estimar a população bacteriana na folha a partir da análise de severidade. Um bioensaio mais rápido foi estabelecido para avaliação do gene soyBiPD, candidato à conferir resistência a X. fastidiosa. Entretanto, nossos resultados demonstram que esse gene não confere resistência à esse patógeno na planta modelo, não sendo, portanto, candidato para transformar C. sinensis visando resistência a CVC. Num curto período de tempo, oito genes candidatos foram avaliados e dois apresentaram resultados promissores (RPS5 e RAP2.2), sendo selecionados para transformação em C. sinensis visando tolerância a CVC. Isso comprova a importância de plantas modelo no estudo e seleção de genes promissores e a consequente redução de custos, trabalho e tempo para obter respostas acerca da potencialidade dos genes / Abstract: The Brazilian citrus agribusiness is a very important commodity; nevertheless Brazilian citrus productivity is low, mainly due to pests and diseases that affect the culture. The Citrus Variegated Chlorosis (CVC), caused by the bacterium Xylella fastidiosa is one of the most important diseases, since it affects all varieties of sweet oranges. Citrus breeding programs could be used to solve this problem however the breeding is a challenging due to the very low genetic variability and the breakthrough of pests and diseases. An alternative to accelerate the obtaining of resistant plants to diseases could be through of transgenic plants. The selection of candidate genes in citrus would be an excellent strategy, if there were not difficulties in genetic transformation. The solution to accelerate the knowledge of gene to confer pathogen resistance is the use of alternative hosts such as the Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana. Both hosts have great genetic information, simple protocol of transformation and short life cycle. Due to the prior identification by transcriptome of genes possibly associated with resistance of C. reticulata to X. fastidiosa become necessary to study the function of these genes. Thus, the goal of this study was to use model plants (Arabidopsis and tobacco) for functional study of potential genes to confer X. fastidiosa resistance and use them in C. sinensis in a transgenic approach. Our results indicated that Arabidopsis is moderately resistant to infection by X. fastidiosa, since bacteria cannot colonize it efficiently. Using mutant plants to the candidate genes RPS5, RAP2.2, MOA2.2, PseudoNBS, ERF73, RD22 and ATJ2 (homologous to the differentially expressed in C. reticulata under infection) it was found that RPS5 and RAP2.2 are probably involved in resistance to this bacterium, since the mutants were more susceptible to X. fastidiosa, therefore they are good candidates for overexpression in C. sinensis aiming CVC resistance. The RPS5 gene encodes a protein of the CC-NBS-LRR type commonly responsible for the recognition of molecules of pathogens and triggering signaling pathways, while RAP2.2 gene encodes a transcription factor related to the signaling pathway mediated by ethylene, triggering responses against infection. Regarding tobacco we study the colonization of bacteria to establish a quantitative bioassay. In this sense, was developed and validated a diagrammatic scale for accurate measurement of disease severity in the leaves. A correlation between levels of severity and bacterial population, allowing estimation of the bacterial population in plant from the analysis of severity, was also established. A faster bioassay was established for evaluation of soyBiPD gene, candidate to confer resistance to X. fastidiosa. However, our results demonstrate that this gene does not confer resistance in the plant model, and therefore would not be used to transform C. sinensis. In a short time, eight candidate genes were evaluated and two of them showed promising results (RPS5 and RAP2.2). These results demonstrate the importance of model plants in accelerate the knowledge of candidate genes and consequent the reduction of costs, labor and time to obtain responses about the potentiality of genes to confer pathogen resistance / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T17:07:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Niza_Barbara_M.pdf: 2368175 bytes, checksum: 2c97ffad74e7a3e1c33ae99c78818b99 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A citricultura brasileira é um importante setor para a economia do país, contribuindo com superávits comerciais e geração de empregos, entretanto, o setor passa por uma grave crise econômica em decorrência do alto custo de produção e do baixo valor pago pela caixa de laranja no Brasil. O principal motivo do alto custo de produção é a alta incidência de pragas e doenças que atingem essa cultura. Dentre as doenças, a Clorose Variegada do Citros (CVC) causada pela bactéria Xylella fastidiosa e transmitida a seus hospedeiros por cigarrinhas vetoras, é a que até hoje causou mais danos à citricultura brasileira. O mecanismo de patogenicidade da X. fastidiosa permanece não conclusivo porém a hipótese mais aceita está relacionada à facilidade da bactéria em colonizar o hospedeiro, ou seja, em se movimentar e multiplicar dentro dos vasos do xilema da planta infectada, seguido da formação do biofilme. O conhecimento da doença bem como das interações planta-patógeno e vetor-patógeno estão muito avançados para a doença de Pierce (PD), doença causada pela X. fastidiosa em videiras nos Estados Unidos. Esse avanço no conhecimento para PD ocorreu principalmente devido à obtenção de estirpes geneticamente modificadas da bactéria, permitindo a execução de estudos funcionais e de colonização. A implementação da aquisição de X. fastidiosa em sistema de dieta artificial para estudos com o vetor também foi de grande contribuição para esse avanço, uma vez que esse sistema elimina a utilização de plantas fonte para aquisição da bactéria. Em citros, sabe-se que existem fontes de resistência natural à CVC como tangerinas, tangors, limas e limões, entretanto, todas as variedades de laranja doce plantadas no Brasil são suscetíveis a essa doença. Sabe-se também que há uma resposta genética diferente entre um genótipo resistente e o suscetível quando inoculados com X. fastidiosa, porém, não se conhece como se dá a colonização in planta, e se existe uma correlação entre a resposta genética da planta e o comportamento da bactéria. Buscando melhorar o entendimento dos fatores envolvidos no patossistema CVC este trabalho teve como objetivo a obtenção de uma estirpe patogênica de X. fastidiosa de citros transformada com a proteína verde fluorescente (GFP) afim de avaliar sua colonização in planta em genótipos parentais e híbridos de citros, resistentes e suscetíveis, além da implementação da aquisição de X. fastidiosa por cigarrinhas vetores por meio do sistema de dieta artificial. A obtenção do transformante de X. fastidiosa expressando GFP permitiu o acompanhamento da colonização da bactéria nos vasos do xilema de plantas suscetíveis e resistentes e a avaliação mostrou uma colonização diferenciada entre caule e pecíolo. Também foi verificado um padrão diferencial de colonização dos caules de genótipos suscetíveis em relação aos resistentes, no qual a bactéria parece não capaz de se mover em genótipos resistentes, permanecendo aprisionada no xilema primário dessas plantas, sugerindo um possível mecanismo de resistência. A implementação da aquisição de células bacterianas em sistema de dieta artificial foi estabelecida com sucesso para vetor e estirpe de X. fastidiosa em citros, abrindo perspectivas para vários estudos na área de interação vetor-patógeno e transmissão da CVC / Abstract: The citrus agribusiness is an important segment for the country economy, contributing to employment and trade surpluses, however, it is passing through an economic crisis on behalf of the high cost of production and the low price paid by the orange box in Brazil. The main reason for the high cost of production is the high incidence of pests and diseases affecting this crop. Among the diseases, the Citrus Variegated Chlorosis (CVC) is caused by the bacterium Xylella fastidiosa and transmitted to its hosts by sharpshooters, and it is the disease that more damage have been causing to the citrus agribusiness in Brazil. The X. fastidiosa pathogenicity mechanism still not clear but the currently accept hypothesis is related to its facility to colonize the host, in other words, on move and multiply within the xylem vessels of an infected host, followed by the biofilm formation. The knowledge about the disease and the interactions between plant-pathogen and vector-pathogen are advanced for the Pierce disease, which is caused by X. fastidiosa on grapes in the United States. This occurs mainly on behalf of bacterial mutant¿s obtainment, allowing functional and colonization studies, besides the artificial diet system establishment for insect vectors studies, once this system eliminates the use of source plant acquisition, a limiting factor for X. fastidiosa acquisition since its colonization in host plants is random. In citrus, is known that natural resistant sources against CVC exists like tangerine, tangors, limes and lemons, while all the sweet orange varieties grown in Brazil are susceptible. Also, was verified a different genetic response between a resistant and a susceptible genotype when inoculated with X. fastidiosa, although, the colonization process in planta still unkown as well as if there is a correlation between the plant genetic response and the bacterial behavior. In order to better understand the factors involved in the CVC pathosystem, this work had the goal of obtain a pathogenic X. fastidiosa strain from citrus transformed with the green fluorescent protein (GFP) to evaluate its colonization in planta on parent and hybrid citrus genotypes, resistant and susceptible, besides de X. fastidiosa artificial acquisition by the insect vector using the artificial diet system. Was obtained a X. fastidiosa strain transformed with the GFP which allowed the bacterial colonization monitoring within the xylem vessels of resistant and susceptible plants and this evaluation showed a differential colonization of stems and petioles. Was also verified a different stem colonization pattern between resistant and susceptible genotypes on which the bacteria seems to be not able to move in resistant ones, staying contained into the primary xylem of these plants, suggesting a possible mechanism of resistance. The bacterial cells acquisition on artificial diet system was successfully established using a citrus insect vector and bacterial strain, opening perspectives for various studies on vector-pathogen interaction and transmission of CVC / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular