Xylella fastidiosa é o agente etiológico de diversas doenças em plantas, incluindo a Clorose Variegada dos Citros (CVC), uma séria ameaça à indústria citrícola. Os níveis de transcritos sob diferentes disponibilidades de ferro foram medidos com microarranjos de DNA representando 2608 (91,6%) sequências codificadoras (CDS) da cepa 9a5c de X. fastidiosa. Na presença de 100 uM pirofosfato férrico, 218 e 256 CDS foram consideradas como reguladas positiva e negativamente, respectivamente. Quando tratada com o quelante de ferro 2,2\'-dipiridil, 193 CDS foram consideradas como reguladas positivamente e 216 negativamente. A expressão diferencial de um subconjunto de 44 CDS foi também avaliada por RT-qPCR, que mostrou uma correlação de Pearson de 0,77 com os resultados dos microarranjos. As CDS diferencialmente expressas nas variações de concentração de ferro participam em diversas funções celulares. Muitas CDS envolvidas com funções regulatórias, patogenicidade e estrutura celular foram moduladas em ambas as condições testadas, sugerindo que grandes mudanças na arquitetura celular e metabolismo ocorrem quando células de X. fastidiosa são expostas a variações extremas na concentração de ferro. Interessantemente, as CDS moduladas incluem as de síntese e secreção de bacteriocinas similares à colicina tipo V e funções ligadas a formação de pilus e fímbria. Nós também investigamos a contribuição do regulador transcricional Fur no stimulon do ferro em X. fastidiosa. Para tal, as regiões promotoras do genoma da cepa 9a5c foram varridas em busca de Fur boxes putativas. Nossas análises identificaram que regiões promotoras de 49 CDS contem elementos com características de Fur boxes. A funcionalidade de pelo menos uma das Fur boxes identificadas foi confirmada através de ensaios de alteração de mobilidade eletroforética que demonstraram sua interação específica com a proteína recombinante Fur de X. fastidiosa. Entretanto, nem todos os genes cuja expressão é modulada por alterações na concentração de ferro, são diretamente regulados por Fur, apoiando a hipótese de que Fur não é o único responsável pela modulação do stimulon de ferro em X. fastidiosa. Em conjunto, nossos dados apresentam novas evidências da relação entre a disponibilidade de ferro e a regulação de determinantes de patogenicidade e virulência em X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the etiologic agent of a wide range of plant diseases including citrus variegated chlorosis (CVC), a major threat to citrus industry. Transcript levels in different iron availabilities were assessed with DNA microarrays representing 2608 (91.6%) coding sequences (CDS) of X. fastidiosa CVC strain 9a5c. In the presence of 100 uM of ferric pyrophosphate, 218 and 256 CDS were considered as up- and down-regulated, respectively. When treated with the iron chelator 2,2\'-dipyridyl, 193 CDS were considered as up-regulated and 216 as down-regulated. Differential expression for a subset of 44 CDS was further evaluated by RT-qPCR that showed a Pearson correlation of 0.77 with array results. The CDS differentially expressed upon the iron concentration shift participate in diverse cellular functions. Many CDS involved with regulatory functions, pathogenicity and cell structure, were modulated in both conditions tested suggesting that major changes in cell architecture and metabolism occur when X. fastidiosa cells are exposed to extreme variations in iron concentration. Interestingly, the modulated CDS include those related to colicin V-like bacteriocin synthesis and secretion and to pili/fimbriae functions. We also investigated the contribution of the ferric uptake regulator Fur to the iron stimulon of X. fastidiosa. Thus, the promoter regions of strain 9a5c genome were screened for putative Fur boxes. Our analyses identified Fur boxes-like elements in promoter regions of 49 CDS. The functionality of at least one Fur box was confirmed by electrophoretic mobility shift assays which demonstrated its interaction with X. fastidiosa recombinant Fur. However, not all genes that appeared to be modulated by iron concentration shift are directly regulated by Fur. This supports the hypothesis that Fur is not solely responsible for the modulation of the iron stimulon of X. fastidiosa. Taken together, our data present novel evidence for iron regulation of pathogenicity and virulence determinants in X. fastidiosa.

Orientadores: Marcos Antônio Machado, Alessandra Alves de Souza / O último capítulo está em inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T01:07:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MarianadeSouzae_D.pdf: 4833630 bytes, checksum: 8baede33597b26761daf544db4af1291 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Xylella fastidiosa é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC), da doença de Pierce em videiras e doenças em muitas outras culturas. Com o seqüenciamento completo do genoma de várias linhagens deste organismo, a função de cada gene , principalmente os ligados à virulência ainda estão pouco caracterizados. A fixação da X. fastidiosa nos vasos do xilema e no canal alimentar dos insetos vetores, cigarrinhas, é necessária para a virulência, formação de biofilme e transmissão desta bactéria. Uma vez que o gene pilC esta envolvido na formação do pili tipo IV e este por sua vez é importante na motilidade e formação do biofilme, neste presente trabalho é mostrado dados fenotípicos obtidos com a interrupção de pilC na linhagem J1a12 de X. fastidiosa. A interrupção do gene pilC na linhagem J1a12 foi obtida por recombinação homóloga utilizando o plasmídeo pUCBM21oriC. Reação de polimerase em cadeia (PCR) e análises por Southern blot dos mutantes indicaram que o gene cromossômico foi substituido pelo gene truncado e com isso a produção da proteína correspondente, PilC, não foi indicada pelo Westen blot. Microscopia eletrônica de varredura transmissão revelou que o tamanho e o número das fímbrias foi reduzido para os mutantes de pilC de X. fastidiosa. Esses mutantes não mostraram capacidade de colonização das regiões acima do ponto de inoculação dos vasos do xilema da planta de laranja Pêra e, além disso, não apresentaram formação de biofilme. No estudo da formação do biofilme, a caracterização da expressão de proteínas foi realizada através do uso da eletroforese de primeira e segunda dimensão e a espectrometria de massa encontramos um total de 456 proteínas expressas na condição de biofilme maduro e 387 proteínas no crescimento planctônico, sendo que, o biofilme apresentou 37% (ou 144 proteínas) diferencialmente expressas em relação ao crescimento planctônico. As alterações encontradas no estado fisiológico das células em biofilme podem ser explicadas pela diferença no padrão de proteínas encontrado. Essas proteínas são produtos correspondentes à 31 genes presentes no biofilme maduro da linhagem isolada de citros 9a5c, esses foram envolvidos na adaptação, no metabolismo e na adesão dessa bactéria. Foi observado superexpressão de genes relacionados ao quorum sensing, comprovando a existência da comunicação entre células e com isso, o desenvolvimento da estruturação do biofilme (biofilme maduro) levando à obstrução dos vasos e desenvolvimento da doença / Abstract: Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis (CVC), Pierce's disease in grapevines and other diseases in many crops. With the full genome sequencing of several strains of this organism, the function of each gene, particularly those related to virulence are still poorly characterized. The setting of X. fastidiosa in xylem vessels and the alimentary canal of insects, leafhoppers, is required for virulence, biofilm formation and transmission of this bacterium. Once the gene is involved in the formation pilC of type IV pili and this in turn is important in motility and biofilm formation, this work is shown in this phenotypic data obtained with the interruption in the strain of pilC J1a12 X. fastidiosa. The interruption of the gene pilC in the strain J1a12 was obtained by homologous recombination using the plasmid pUCBM21oriC. Polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot analysis of mutants indicated that the chromosomal gene was replaced by the truncated gene and thereby producing the corresponding protein, PilC was not indicated by Western blot. Scanning transmission electron microscopy revealed that the size and number of fimbriae was reduced for the mutants of pilC X. fastidiosa. These mutants showed no ability to colonize the region above the inoculation of the plant xylem vessels of Pera and, moreover, did not show biofilm formation. In the study of biofilm formation, the characterization of protein expression was performed by using electrophoresis of first and second dimension and mass spectrometry we found a total of 456 proteins expressed in condition of mature biofilm and 387 proteins in planktonic growth, and , the biofilm showed 37% (or 144 proteins) differentially expressed in relation to planktonic cells. The changes found in the physiological state of cells in biofilm can be explained by the difference in the pattern of proteins found. These proteins are products corresponding to 31 genes present in the mature biofilm of strain isolated from citrus 9a5c, they were involved in the adaptation, metabolism and adhesion of bacteria. We observed overexpression of genes related to quorum sensing, proving the existence of communication between cells and thus, the development of the biofilm structure (mature biofilm) leading to obstruction of vessels and development of disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

A citricultura paulista pode ser considerada uma das mais competitivas e importantes atividades agroindustriais do Brasil, gerando aproximadamente 400 mil empregos e adicionando anualmente U$ 1,4 bilhões ao país. Entretanto ainda apresenta uma produtividade inferior àquela encontrada na Flórida, principalmente devido a deficiências nutricionais e hídricas e a doenças que há diversos anos atingem às lavouras. Nos últimos dez anos a clorose variegada dos citros (CVC), conhecida popularmente como a doença do amarelinho, apresenta-se como o principal problema, sendo a bactéria gram-negativa Xylella fastidiosa seu agente causal. Em vista da importância do cultivo da laranja no país, o projeto \"Genoma Xylella fastidiosa\" foi proposto, visando o seqüenciamento total do genoma deste fitopatógeno bem como o treinamento de pessoal capacitado na utilização das modernas técnicas de biologia molecular. Segmentos de DNA provenientes de 7 cosmídeos e diversos clones provenientes de bibliotecas de \"shotgun\" genômico foram seqüenciados em nosso laboratório, totalizando 271.220 pb do genoma da bactéria. Em seguida foi feita a anotação das orfs preditas por programa GLIMMER, sendo que em nosso laboratório foram anotadas aproximadamente 290 ORFs. Seqüenciamentos diretamente do genoma e de clones das bibliotecas de RDA foram também realizados, complementando as metodologias de primer walking e construção de bibliotecas de fago utilizadas em outros laboratórios do projeto para o fechamento de \"gaps\". Todos os resultados obtidos em nosso laboratório, somados às contribuições de todos os grupos do projeto, serão base para a melhor compreensão dos mecanismos utilizados pela bactéria, podendo favorecer o desenvolvimento de novas estratégias para o combate desta praga. / The São Paulo\'s citriculture can be considered one of the most competitive and important agroindustrial activity from Brazil. It provides aproximately 400,000 jobs and adds US$ 1,4000,000,000 for the country\'s economy. This activity, however, still shows less productivity than the one from Florida, mainly due to nutritional and hydric deficiencies and plagues that are already present for a long time. In the last ten years, the citrus variegated chlorosis (CVC), also known as little yellow disease, constitutes the main problem for the orange farmers. This disease is caused by gram-negative bacterium Xylella fastidiosa. Due to the importance of the orange cultive in the country, the project called Xylella fastidiosa\'s Genome was proposed. The main goals of this project are to sequence the entire genome of this phytopathogen and the trainning of specialized people in the use of modern techniques of molecular biology. DNA fragments cloned in 7 cosrnids and also form genomic shotgun libraries were sequenced in our laboratory. A total of 271,220 bp of bacteria genome were obtained. The next step was the annotation of the open reading frames (ORFs). This was made using the GLIMMER computer program which generates, in our laboratory, aproximately 290 ORFs. Direct sequencing of the genome and clones of RDA libraries were also done for obtaining nucleotide sequences form gaps. These methodologies complement the primer walking and phage library construction used by other laboratories included in the project. All results, obtained either by our laboratory or the other groups from the project, will be used for a better understanding of the mechanisms used by the bacteria, Altogether, they can be favor the development of new strategies in the plague combact.

Xylella fastidiosa is a small, xylem-limited bacterium that causes a number of diseases in over 100 species of plants. Many of the species infected are economically important (such as coffee, grapevines, citrus, and almond) and billions of dollars worldwide are lost annually due to X. fastidiosa infection of crops. The bacterium colonises both plant and insect hosts, using the insect host to transfer it from plant to plant. Sequencing of the X. fastidiosa genome in 2000 discovered that while the genome is reduced, it contains a high number of putative bifunctional enzymes. One of these enzymes, aspartate kinase:diaminopimelate decarboxylase (AK:DapDc), occurs in only a handful of species and is predicted to catalyse the first and last steps of lysine biosynthesis. This study reports the first experimental characterisation of this enzyme. AK:DapDc was over-expressed in the pET30dSE plasmid in Escherichia coli BL21 DE3 cells. It was purified by Ni2+ His-Trap chromatography followed by size exclusion chromatography. Homology models of AK:DapDc were created in SWISS-MODEL, which indicate homology with the aspartate kinase from Arabidopsis thaliana and the diaminopimelate decarboxylase from E. coli. Circular dichroism, and analytical ultracentrifugation were used to obtain information about the secondary and quaternary structure of AK:DapDc. This data, in combination with the homology models, suggests that AK:DapDc exists as a dimer or tetramer in solution. A coupled enzyme assay to assay for diaminopimelate decarboxylase activity has been set up, and preliminary crystal screens have been carried out.

Xylella fastidiosa is an important bacterial plant pathogen that colonizes the xylem of hundreds of plant species. X. fastidiosa cause Pierce's disease in grapevine by occlusion of the xylem by extensive bacterial colonization, extracellular polysaccharides and the formation of a biofilm. These traits are mediated in a cell-density manner by a cell-to-cell signaling system that transduces a diffusible signaling factor (DSF). This dissertation demonstrates that PD1994, PD1617 and RpfG regulate important traits for bacterial virulence such as cell-cell signaling, biofilm formation and cell aggregation. X. fastidiosa strains harboring mutations in pd1994 (which encodes for a defective GGDEF- EAL-domain protein) and in pd1617 (which encodes for a EAL-domain protein) have increased growth rate, increased biofilm formation, increased plant colonization and decreased cell aggregation. Gene expression analysis of the pd1994 mutant strain showed overexpression of rpfF, which is a DSF synthase, suggesting that PD1994 regulates DSF signaling by repressing rpfF expression. Additionally, the pd1994mutant showed overexpression of pd1617 and rpfG (with EAL and HD-GYP domains respectively, that may be responsible for c-di-GMP turnover), which suggested that this mutant may have low c-di-GMP levels and that PD1994 regulates c-di-GMP turnover by repression of RpfG activity and PD1617 gene expression. X. fastidiosa harboring a mutation on rpfG exhibited decreased biofilm formation while it had no effect in growth or cell aggregation. Together, these results suggest that PD1994, PD1617 and RpfG regulate the DSF regulatory network by controlling the turnover of the second messenger c-di-GMP.

Orientador: Francisco Javier Medrano Martin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:29:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_Kelly_D.pdf: 4767617 bytes, checksum: 886f6b5d543544a3913da5d9e5dae0bb (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Aminopeptidases realizam a clivagem de resíduos de aminoácidos de peptídios e proteínas. Elas estão presentes em todos os organismos e desempenham importantes papéis em processamento de alimentos, maturação de proteínas pela eliminação do resíduo de metionina Nterminal, patogenicidade e muitos outros processos celulares. Neste trabalho foi realizada a clonagem, expressão, purificação e caracterização de uma prolina iminopeptidase de Xylella fastidiosa(Xf1510) e de uma aminopeptidase de Xanthomonasaxonopodispv. citri (Xac2987). Estes dois genes foram anotados como prováveis prolina iminopeptidases. Ambos foram clonados em vetor de expressão pET15b, expressados em Escherichiacoli, e purificados na fração solúvel em um passo por cromatografia a metal imobilizado (IMAC). Ensaios de atividade enzimática confirmaram que a Xf1510 é uma prolina iminopeptidase, e que a Xac2987 é uma aminopeptidase de amplo espectro e não uma prolina iminopeptidase como foi anotada no banco de dados, sendo capaz de catalisar a remoção de diferentes aminoácidos de substratos sintéticos. Os espectros de dicroísmo circular das enzimas mostram que ambas podem ser incluídas na família das a/ß a/ß hidrolases e que estão enoveladas. A proteína Xf1510 apresenta maior atividade na faixa de pH entre 7,5 e 8,5. A temperatura ótima para hidrólise de prolina foi 45ºC. O pH ótimo para a atividade enzimática da proteína Xac2987 foi encontrado na faixa de pH de 6,5 e 7,5; sendo o pH ótimo 6,6. Neste pH a temperatura ótima para a hidrólise de alanina foi encontrada à 40ºC. Estudos estruturais com relação ao pH e estabilidade térmica das proteínas foram acompanhados por dicroísmo circular. Estudos de desnaturação térmica e química indicam que as proteínas Xf1510 e Xac2987 apresentam estados intermediários antes de atingirem o desenovelamento máximo / Abstract: Aminopeptidases release the Nterminal amino acid residue from polypeptides and proteins. They are present in all organisms and play several important roles in food processing, maturation of proteins by elimination of the Nterminal methionine, pathogenicity and many other cellular processes. We report here, the cloning, expression, purification and characterization of a proline iminopeptidase from X.fastidiosa(Xf1510) and a broad specificity aminopeptidase from X.axonopodispv. citri(Xac2987). These two genes have been annotated as putative proline iminopeptidase. Both genes were cloned into the pET15b expression vector, expressed in Escherichia coli, and purified to apparent homogeneity in one step by IMAC. The protein was expressed in the soluble fraction and could be purified in one step by IMAC. Enzymatic assays confirmed Xf1510 as a PIP, and Xac2987 as a broad spectrum aminopeptidase, being able to catalyze the removal of different synthetic substrates. The circular dichroism spectrum allowed us to classify the proteins as part of the a/ß hydrolyses family. Structural studies with pH dependence and thermal stability were preformatted by circular dichroism. The Xf1510 protein presents greater activity in the range of pH between 7,5 and 8,5. The optimum temperature for prolina hydrolysis was 45ºC. The pH optimum for the enzymatic activity of the Xac2987 protein was found in the range of pH of 6,5 and 7,5; being pH optimum 6,6. In this pH the temperature for alanine hydrolysis was found to 40ºC. Structural studies with regard to pH and thermal stability of proteins had been followed by circular dichroism. Studies of thermal and chemical denaturation indicate that the proteins Xf1510 and Xac2987 present intermediate states before reaching the maximum unfolding / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-10T20:45:14Z No. of bitstreams: 1 Tese- Tatiana da Costa Jansen.pdf: 9287267 bytes, checksum: 5acef6d7e086380870298a29736c4242 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-13T14:22:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese- Tatiana da Costa Jansen.pdf: 9287267 bytes, checksum: 5acef6d7e086380870298a29736c4242 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-13T14:27:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese- Tatiana da Costa Jansen.pdf: 9287267 bytes, checksum: 5acef6d7e086380870298a29736c4242 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-13T14:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese- Tatiana da Costa Jansen.pdf: 9287267 bytes, checksum: 5acef6d7e086380870298a29736c4242 (MD5) Previous issue date: 2008-09-08 / SUFRAMA - Superintendência da Zona Franca de Manaus / The Chlorosis Variegad of Citrus (CVC) popularly known as small yealow is a disease that is attacking the Brazilian orchards since 1987, with the causal agent the bacterium Xylella fastidiosa that colonizes the xilematic vessels mainly of sweet oranges (Citrus sinensis). In the states of São Paulo and Minas Gerais the disease has great impact especially in the north, northeastern state of Sao Paulo and Minas Gerais triangle, regions of warm climate where the bacteria presents major conditions for growth in xilematic vessels. There were isolated strains of X. fastidiosa of thirteen municipalities between Sao Paulo and Minas Gerais. The strains of X. fastidiosa in seedlings were inoculated in a greenhouse where there are differences in symptoms of plants and bacterial virulence. Among those inoculated strains of the municipalities Neves Paulista, Matão, Jeriquara and had greater frequency of symptoms, since the municipality Capela do Alto, southern state of São Paulo had the lowest frequency of symptoms. The CVC has been detected in several Brazilian states, but no reports of the occurrence of CVC had been done to the state of Amazonas, where the cultivation of citrus is being commercially exploited by at least three decades. An evaluation sample was held in Manaus, President Figueiredo, Itacoatiara, Balbina and Rio Preto da Eva, in the period August to December 2003, March to December 2004 and 2005 and January to March 2006. Were observed symptoms of CVC in sheets, as chlorotic spots arranged in front of leaves and straw color injuries in the back. Collected up 10 leafs of each plant for the isolation of the bacterium, extracting DNA and PCR specific for the identification and confirmation of the occurrence of the pathogen. According to the results presented were unable to detect the occurrence of CVC of citrus orchards in the state of Amazonas. / A Clorose Variegada do Citros (CVC) popularmente conhecida como amarelinho é uma doença que vem atacando os pomares brasileiros desde 1987, tendo como agente causal a bactéria Xylella fastidiosa que coloniza os vasos xilemáticos principalmente das laranjas doces (Citros sinensis). A doença apresenta grande incidência principalmente nas regiões norte, nordeste do estado de São Paulo e triangulo mineiro, regiões de clima quente onde a bactéria apresenta maiores condições de crescimento nos vasos xilemáticos. Foram isoladas cepas de X. fastidiosa de treze municípios entre São Paulo e Minas Gerais. As cepas de X. fastidiosa foram inoculadas em seedlings em casa de vegetação onde verificou-se diferenças na sintomatologia das plantas e na virulência bacteriana. Dentre as cepas inoculadas as dos municípios de Neves Paulista, Matão e Jeriquara apresentaram maior freqüência de sintomas, já o município de Capela do alto, sul do estado de São Paulo apresentou a menor. A CVC já foi detectada em vários estados brasileiros, mas nenhum relato da ocorrência da CVC havia sido feito para o estado do Amazonas, onde a cultura do citros vem sendo explorada comercialmente por pelo menos três décadas. Uma avaliação amostral foi realizada em Manaus, Presidente Figueiredo, Itacoatiara e Rio Preto da Eva, no período de agosto a dezembro de 2003, março a dezembro de 2004 e 2005 e janeiro a março de 2006. Foram observados sintomas de CVC em folhas, como, manchas cloróticas dispostas na parte anterior das folhas e lesões cor palha na parte posterior. Coletaram-se 10 folhas de cada planta para o isolamento da bactéria, extração de DNA e PCR específico, para a identificação e confirmação da ocorrência do patógeno. Foram encontrados sintomas de CVC em várias localidades do estado do Amazonas, Manaus, Presidente Figueiredo e Rio Preto da Eva, as amostram sintomáticas foram confirmadas por PCR e através do isolamento da bactéria X. fastidiosa. De acordo com os resultados apresentados foi possível detectarmos a ocorrência de CVC nos pomares de citros do estado do Amazonas.

A bactéria Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) é um patógeno de planta que causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Através da determinação experimental da seqüência primária de algumas proteínas marcadamente expressas pela X. fastidiosa e a comparação destas com seqüências de ácidos nucléicos do genoma identificou entre elas três ORFs codificadoras de proteínas que podem estar relacionadas à patogenicidade desta bactéria no seu hospedeiro. No entanto, a função biológica destas proteínas ainda não foi funcionalmente caracterizada. Para investigar o papel biológico e realizar estudos de estrutura e função, as ORFs correspondentes as proteínas hidroxinitrila liase, corismato sintase e proteína D do sistema de transporte e secreção Tat foram clonadas, seqüenciadas e expressas em Escherichia coli. As proteínas recombinantes expressas foram purificadas por cromatografia de afinidade e suas identidades verificadas por seqüenciamento. As proteínas purificadas foram encontradas como uma única banda em SDS-PAGE. As proteínas recombinantes, pela primeira vez isoladas, foram caracterizadas em termos de estabilidade conformacional e comportamento estrutural frente a mudanças de pH e temperatura utilizando-se as espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. O sucesso na construção do gene sintético e na clonagem em vetores de expressão de E. coli resultou em quantidade satisfatória de expressão das proteínas recombinantes. Duas delas apresentaram-se na formas solúveis, facilmente purificadas e ativas e permitindo suas caracterizações. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as \"amarelinho\". Xylella fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, and is transmitted by sharpshooter vectors. The experimental determination of the primary sequence of some markedly expressed proteins for X. fastidiosa and the comparison with the nucleic acids sequence of its genome aided the identification of three of them as being proteins involved in host pathogenicity. However, the biological role of these proteins should be assigned experimentally. In order to investigate the biological role, function and structure, ORFs corresponding to hydroxynitrile liase, chorismate synthase and type V secretory pathway proteins were cloned, sequenced and expressed in Escherichia coli. The expressed recombinant proteins were purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and their identities were verified by protein sequencing. The purified proteins were found as a single band on SDS-PAGE. The successful cloning and heterologous expression of recombinant HNL in E. coli resulted in a satisfactory amount of expressed protein. Two of the expressed recombinant proteins were soluble, easily purified, and isolated in an active form. X. fastidiosa recombinant proteins, for the first time isolated, were characterized according to enzyme conformational stability and structural behavior as a function of pH and temperature using circular dichroism and fluorescence spectroscopy.

Gram-negativas e é utilizado por diversos patógenos para colonizar seus hospedeiros, sendo o primeiro passo do processo de desenvolvimento do biolfilme. Uma variedade de apêndices celulares e proteínas está envolvida na adesão bacteriana, tais como pili, fimbrias, adesinas fimbriais e afimbriais. O fitopatógeno Xylella fastidiosa, agente causal de importantes doenças como a doença de Pierce de videiras, a clorose variegada dos citros e a síndrome do rápido declínio de oliveiras, possui em sua superfície várias dessas estruturas que são potencialmente responsáveis pela colonização eficiente de insetos-vetores e plantas hospedeiras. Entre as adesinas afimbriais codificadas no genoma dessa bactéria, três XadA (XadA1, Hsf/XadA2 e XadA3) são classificadas como autotransportadores triméricos. Dados da literatura sugerem que XadA1 e XadA2 são importantes para a formação do biofilme, porém a função de XadA3 ainda não havia sido investigada. Nesse trabalho, tivemos como objetivo caracterizar bioquímica e funcionalmente a proteína XadA3 e obter informações adicionais sobre o papel desempenhado por XadA1 e XadA2 na adesão e virulência de X. fastidiosa. Utilizando imunodetecção com um anticorpo policlonal anti-XadA3 por nós obtido, demonstramos que essa proteína localiza-se na superfície bacteriana e medeia a adesão intercelular. A caracterização dos fenótipos de mutantes de deleção de cada um dos genes das adesinas XadA revelou que o mutante ΔxadA3 tem reduzida capacidade de agregação celular e formação de biofilme quando comparado tanto aos mutantes ΔxadA1 e ΔxadA2 como à cepa selvagem Temecula. A deleção dos genes xadA afeta marginalmente o perfil de expressão gênica global avaliado através de RNAseq das cepas mutantes comparativamente à cepa selvagem, porém destaca-se, nas cepas mutantes, o aumento nos níveis dos transcritos de lipases/esterases. Já foi descrito que essas enzimas parecem atuar na degradação do tecido vegetal associada aos sintomas da doença de Pierce de videiras. A deleção de xadA3 resulta em um fenótipo de hipervirulência em videiras, mas também de deficiência de transmissão pelo inseto-vetor. O conjunto dos resultados obtidos nesse trabalho evidenciam o importante papel desempenhado pelas adesinas XadAs, particularmente XadA3, na adesão intercelular, no desenvolvimento do biofilme e na virulência de X. fastidiosa. / Adhesion is a widely conserved mechanism of virulence among Gram-negative bacteria that is used by several pathogens to colonize their hosts, being the first step in biolfilm development. A variety of appendages and proteins are involved in bacterial adhesion, such as pili, fimbriae, fimbrial and afimbrials adhesins. The phytopathogen Xylella fastidiosa, causal agent of important diseases such as Pierce\'s disease of grapevines, citrus variegated chlorosis and olive quick decline syndrome, harbours on its surface several of these structures that are potentially responsible for efficient colonization of insect vectors and plant hosts. Among the afimbrial adhesins encoded in the genome of this bacterium, three XadAs (XadA1, Hsf/XadA2 and XadA3) are classified as trimeric autotransporters. Data from the literature suggest that XadA1 and XadA2 are important for biofilm formation, but XadA3 function has not been yet investigated. In this work, we aimed to biochemically and functionally characterize the XadA3 protein and gather additional information about the role played by XadA1 and XadA2 in X. fastidiosa adhesion and virulence. Using immunodetection with a polyclonal anti-XadA3 antibody, we have demonstrated that this protein localizes to the bacterial surface and mediates intercellular adhesion. Phenotypic characterization of the deletion mutants of XadA adhesins encoded genes revealed that the ΔxadA3 mutant has reduced cell aggregation capacity and biofilm formation when compared to both ΔxadA1 and ΔxadA2 mutants as well as to Temecula wild type strain. Deletion of the xadA genes marginally affects the global gene expression profile assessed by RNA-seq of the mutant strains compared to the wild-type strain, eventhough an increase in lipase/esterase transcripts levels was observed in the mutant strains. It has been reported that these enzymes appear to participate in the degradation of plant tissue that is associated with symptoms of Pierce\'s disease of grapevines. The deletion of xadA3 results in a phenotype of hypervirulence in grapevines but also of deficiency in insect-vector transmission. The results obtained in this work evidenced the important role played by XadAs adhesins, particularly XadA3, in X. fastidiosa intercellular adhesion, biofilm development and virulence.

Muitas das proteínas de valor biomédico relevante são encontradas em baixas concentrações em suas fontes nativas. O alto nível de expressão de proteínas recombinantes em E. coli, muitas vezes gera o acúmulo de proteínas como agregados insolúveis no citoplasma e/ou periplasma da bactéria, denominados de corpos de inclusão (CI). A alta pressão tem sido amplamente utilizada no estudo da conformação das proteínas,ela modula as interações proteína-proteína e proteína-solvente através de mudanças no volume das mesmas, promovendo a entrada de água nas cavidades não expostas da molécula e promovendo hidratação e solubilização dos agregados. O presente trabalho teve como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas como CI em Escherichia coli usando alta pressão hidrostática como condição branda de dissociação dos agregados. As tiorredoxinas TsnC e TrxA, a proteína YbbN e a proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp), todas de Xylella fastidiosa, foram estudadas neste trabalho. As condições de renaturação foram otimizadas, utilizando-se diferentes proporções do par redox, concentrações de GdnHCl, presença de aditivos e esquemas de descompressão. Para a quantificação e análise da eficácia do processo de renaturação das proteínas sob pressão foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura dos CI e de SDS-PAGE, e ensaios de atividade enzimática das proteínas. A TsnC foi renaturada em Tris HCl 50 mM com proporção de 10GSH:1GSSG em concentração final de 10 mM, 0,75 M GdnHCl, na presença de 0,5 M de Triton-X e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. O rendimento final de obtenção de TsnC solúvel foi altíssimo, de até 89,9%. A renaturação de proteína YbbN, nunca antes descrita, foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, na presença de 0,5 M de L-Arginina e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. A proteína YbbN, que apresentou atividade de tioredoxina, foi renaturada com rendimento de até 98% a partir da proteína insolúvel nos CI. Foi possível a solubilização da tiorredoxina TrxA e Bcp sob alta pressão hidrostática em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, utilizando diferentes proporções do par redox na concentração final de 10 mM e 1,5 M de GdnHCl, porém não foi possível obter a atividade biológicas destas proteínas. Mostramos também que a L-Arginina apresenta efeito auxiliar na solubilização dos CI induzida pela alta pressão, e ao mesmo tempo se mostrou altamente protetora contra a inativação da atividade da YbbN promovida pela incubação em altas temperaturas, o que sugere que a presença deste aminoácido pode ter alta aplicabilidade juntamente com a aplicação de altas pressões para elevar os rendimentos de renaturação de proteínas recombinantes a partir de CI. / Many of the relevant proteins are found in low concentrations in their native sources. The high level expression of recombinant heterologous proteins in Escherichia coli often causes their accumulation as insoluble aggregates in the cytoplasm or periplasm of bacteria in a mainly inactive form, known as inclusion bodies (IB). The high pressure has been widely used to study the conformational states of proteins. It modulates the protein-protein and protein-solvent interactions by changing the volume of the system, promoting the entrance of water into the cavities unexposed to water, exposing hydrophobic regions and promoting solubilization of the aggregates. The present study aimed to refold recombinant proteins expressed in E. coli as IB using high hydrostatic pressure as a mild condition for IB dissociation. The thioredoxins TsnC, TrxA and Ybbn and the protein comigratory with bacterioferritin (Bcp) of Xylella fastidiosa were studied in this work. The conditions for refolding were optimized for proportions of the redox pair, GdnHCl concentration, presence of additives and schemes for decompression. To analyze the effectiveness of the process of refolding under pressure we have used, scanning electron microscopy of the IB and SDS-PAGE and enzymatic activity assays for quantification and analysis of the solubilized proteins. The TsnC was renatured in 50 mM TrisHCl at a ratio of 10GSH: 1GSSG in 10 mM final concentration, 0.75 M GdnHCl in the presence of 0.5M Trito X-100 and application of 2.4 kbar for 1.5 hours, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. The final yield of soluble and biological active TsnC was very high, up to 89,9%. The refolding of protein YbbN was obtained by application of 2.4 kbar for 1.5 h to an IB suspension in buffer 50 mM Tris HCl, in the presence of 0.5 M L-arginine, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. We also show that L-arginine had a highly protective effect on the inactivation of biological activity of YbbN promoted by incubation at high temperatures.The final yield of refolded YbbN, that present thioredoxin activity, was also very high: 98%. TrxA and Bcp thioredoxins were solubilized at 2.4 kbar and step decompression. However, these proteins did not present biological activity. We also show that L-arginine has an auxiliary effect on the solubilization of IB induced by high pressure, while its presence proved highly protective against inactivation of the enzymatic activity promoted by incubation at high temperatures. These results suggest that the presence of this amino acid can have high applicability to increase the yield of refolding of recombinant proteins from the IC at high pressure.