Le cadre général de cette thèse est une étude théorique par chimie quantique et dynamique moléculaire de la relation entre la structure et la fluorescence des protéines fluorescentes, en particulier, de la protéine fluorescente jaune (YFP). Dans cette protéine l'énergie de transition électronique est réduite par rapport à celle de la protéine fluorescente verte (GFP) en raison de l'empilement π entre le chromophore (la partie qui peut absorber et émetre de la lumiere visible au cœur de la protéine) et une tyrosine. Cet effet constitue la base de son utilité au laboratoire (transfert d'énergie par résonance «FRET» avec d’autres protéines). Ce travail comporte deux parties. D’une part, nous avons cherché à déterminer si un champ de force classique (ff99 de la suite AMBER) permet de représenter l’effet de π -stacking sur la dynamique à l’état excité. Pour cela nous avons effectué une série de calculs CASPT2 sur une grille de points. La conclusion est que la différence entre les surfaces d’énergie d’interaction résultant du champ de force et des calculs de chimie quantique CASPT2 ne semblent pas déterminante pour les propriétés de fluorescences.D’autre part, nous avons utilisé un modèle développé dans le groupe ThéoSim pour décrire le déclin à partir d’une série de dynamique (300ns) utilisant un champ de force classique. Cette méthode conduit à déterminer des paramètres en principe transférables d’une protéine fluorescente à une autre. Nous avons comparé la GFP et l’YFP. Cette approche ouvre la voie à une méthode rapide pour des propriétés de fluorescences pour de nouvelles protéines fluorescentes. Une prochaine étape serait d'améliorée la description du déclin radiatif utilisée dans ce modèle. / The general framework of this PhD is a theoretical study by quantum chemistry and molecular dynamics of the relationship between the structure and the fluorescence properties of fluorescent proteins, particulary, of the yellow fluorescent protein (YFP). In this protein, the electron transition energy is reduced with respect to that of the green fluorescent protein (GFP) as a result of a π stacking between the chromophore (the part that absorbs and emits visible light in the protein) and a tyrosine . This effect is the basis of the usefulness of YFP in the laboratory (resonance energy transfer "FRET" with other proteins).This study has two parts. First, we have tried to determine if a classical force field (ff99 of the AMBER suite) can represent the effect of π stacking on the dynamics in the excited state. For this goal, we performed a series of CASPT2 calculations on a grid of points. The conclusion is that the difference between the interaction energy surfaces resulting from the force field and the CASPT2 calculations does not seem decisive for the fluorescence properties. Second, we used a model developed in the ThéoSim group to extract the fluorescence decay time from a series of dynamics (300ns) using a classical force field. This method leads to the determination of parameters in principle transferable across fluorescent protein. We compared GFP and YFP. This approach opens the way to a fast method for determining fluorescence properties for new fluorescent proteins. A next step would be to improve the description of radiative decay used in this model.

No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

Traumatic brain injury is a major health problem with much of its morbidity associated with traumatic axonal injury (TAI). To date, significant insight has been gained into the initiating pathogenesis of TAI. However, the specific anterograde and retrograde sequelae of TAI are poorly understood because the diffuse nature of TAI complicates data analysis. To overcome this limitation, we subjected transgenic mice expressing yellow fluorescent protein (YFP) within the visual system to central fluid percussion injury, and consistently generated diffuse TAI within the optic nerve that could easily be followed in the organized YFP positive fibers. We demonstrated progressive axonal swelling, disconnection and proximal and distal axonal dieback, with regression and reorganization of the proximal swellings, and the persistence of the distal disconnected and degenerating swellings. Antibodies targeting the C-terminus of amyloid precursor protein, a marker of TAI, mapped to the proximal axonal segments without distal targeting. Antibodies targeting microglia/macrophages, revealed activated microglia/ macrophages closely encompassing the distal disconnected, degenerating axonal segments at 7 - 28 days post injury, suggesting their role in the delayed axonal degeneration. In contrast, in the proximal reorganizing axonal segments, microglia/macrophages appeared less reactive with their processes paralleling preserved axonal profiles. Concomitant with these events, YFP fluorescence quenching also occurred, complicating data analysis. This quenching mapped to Texas-Red-conjugated-IgG immunoreactive loci, suggesting that blood–brain barrier disruption and its attendant edema participated in fluorescence quenching. This was confirmed through antibodies targeting endogenous YFP, which identified the retention of intact axons despite YFP fluorescent loss. Paralleling these events, TAI was not accompanied by retrograde retinal ganglion cell (RGC) death. Specifically, no TUNEL+ or cleaved caspase-3 immunoreactive RGCs were observed from 2 days to 3 months post-TBI. Further, Brn3a immunoreactive RGC quantification revealed no significant RGC loss. This RGC preservation was accompanied by the persistent phospho-c-Jun expression for up to 3 months post-TBI, a finding linked to neuronal survival and potential axonal repair. Parallel ultrastructural study again failed to identify RGC death. Collectively, this study provides unprecedented insight into the evolving pathobiology associated with TAI, and offers advantages for future studies focusing on its therapeutic management and neuronal reorganization.

Die vorliegende Untersuchung diente, nach der grundlegenden Vorgehensweise im Rahmen des exponentiellen N-Verwertungsmodelles (GEBHARDT 1966, Samadi und Liebert 2008), die Aminosäurewirksamkeit beim Masthähnchen unter spezifischer Fokussierung der schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin und Cystein zu bewerten und neue Erkenntnisse zum Idealprotein-Konzept beim Mastgeflügel zu erhalten. Dazu wurden Stoffwechsel- und Wachstumsversuche mit männlichen Ross 308 Broilerküken in jeweils zwei Altersperioden (Starter- und Growerperiode) durchgeführt. Die Beantwortung der komplexen Fragestellung erforderte ein Herangehen in drei separaten Versuchskomplexen, die folgende Zielstellungen umfassten: Untersuchungskomplex I: Ermittlung des NMR (N-Erhaltungsbedarf) und NRmaxT (theoretisches maximales N-Retentionsvermögen) Untersuchungskomplex II: vergleichende Bertachtung der Methioninwirksamkeit zweier Methioninquellen (DL-Methionin (DLM) und 2-Hydroxy-4-methylthiobuttersäure (MHA)) und Ermittlung des Methioninbedarfs in Abhängigkeit vom Met:Cys-Verhältnis Untersuchungskomplex III: Ableitung eines idealen Aminosäurenverhältnisses unter Betrachtung der Aminosäuren Lysin, Threonin, Tryptophan, Arginin, Isoleucin und Valin Folgende Resultate wurden erzielt: NMR und NRmaxT Der in einem N-Bilanzversuch ermittelte N-Erhaltungsbedarf (NMR) für Ross 308 Broiler betrug für die Altersperiode 10. - 20. LT 295 mg/LMkg0,67 pro Tag und für die Altersperiode 25. - 35. LT 313 mg/LMkg0,67 pro Tag. Da die Ergebnisse, des in beiden Altersabschnitten analysierten N-Erhaltungsbedarfes sehr ähnlich waren, wurde der Mittelwert dieser beiden Parameter eruiert. Der durchschnittliche, als Arbeitswert für den täglichen N-Erhaltungsbedarf angenommene NMR betrug, für die unter der Studie betrachtete Genetik, somit 304 mg/LMkg0,67 pro Tag. Die Bewertung des theoretischen Potentials für die tägliche N-Retention (NRmaxT) männlicher Broilerküken der genetischen Herkunft Ross 308 entsprach für die Altersperiode 10. - 20. LT 3991mg/LMkg0,67 pro Tag und 3110 mg/LMkg0,67 pro Tag für die Altersperiode 25. - 35. LT. Die Ergebnisse demonstrierten, dass das genetische Potential zur Proteindeposition wachsender Broiler mit zunehmendem Alter sank. Methionin-Wirksamkeit Gegenüber der Negativkontrolle konnte durch die DL-Methionin- / MHA-Zulagen bzw. DL-Methionin- / MHA-Zulagen in Kombination mit Cystein der tägliche Zuwachs und der Futteraufwand signifikant verbessert werden. Beim Vergleich der relativen Wirksamkeit von DLM und MHA in dieser Arbeit zeigt sich eine Überlegenheit des DLM in allen Mischungen, mit Ausnahme der zweiten Met+Cys-Supplementationsstufe in der Growerperiode, bei der eine Wirksamkeit von 100 erzielt wurde. Die MHA-Wirksamkeit variierte in einem Bereich zwischen 62% und 100% in Abhängigkeit vom Met:Cys-Verhältnis und dem Gehalt an Met bzw. Cys in der Diät. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass mit zunehmendem Anteil an Methionin sowie innerhalb des Methioninlevels ein zunehender Anteil an Cystein in der Diät, die Wirksamkeit von MHA relativ zu DLM senkte. Ableitungen zum täglichen Methioninbedarf Die abgeleiteten Werte zum täglichen Methioninbedarf bezogen sich auf einen Rohproteinansatz von 6 - 10g/d (Starter) bzw. 12 - 20g/d (Grower) und lagen in einem Bereich von: 244 - 498 mg/LMkg0,67pro LT bei einer Met-Wirksamkeit von 157 (Starter, 10. 21. LT) 230 - 500 mg/LMkg0,67pro LT bei einer Met-Wirksamkeit von 196 (Grower, 25. 35. LT) Danach benötigte ein Broiler mit einer mittleren Lebendmasse von 500g zur Realisierung eines täglichen Proteinansatzes von 6 - 10 mg/d eine Zufuhr von 154 313 mg Met/d und ein Broiler mit einer mittleren Lebendmasse von 1800g zur Realisierung eines täglichen Proteinansatzes von 12 20 mg/d eine Zufuhr von 341 742 mg Met/d. Bei einer täglichen Futteraufnahme von 50g bzw. 130g ergaben sich notwendige Aminosäurekonzentrationen im Futter von 0,26 - 0,57% Methionin bzw. 0,31 - 0,63% Methionin. Für die Methioninbedarfswerte zeigte sich eine bestehende Abhängigkeit zum Met:Cys-Verhältnis bzw. Cys-Gehalt der Futtermischung. Ableitungen zum idealen Aminosäurenverhältnis N-Bilanz- und Wachstumsversuche zur Ermittlung der idealen Aminosäurenverhältnisse wurden durchgeführt. Aus den drei N-Bilanzversuchen ergab sich ein ideales Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val-Verhältnis von 100:61:17:106:59:69 für Broiler in der Altersperiode 10. - 20. LT sowie ein ideales Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val-Verhältnis von 100:65:17:106:65:82 für Broiler in der Altersperiode 25. - 35. LT. Die Ergebnisse bestätigten die schon für Lys:Thr bekannte Altersabhängigkeit. Neue Aspekte ergaben sich jedoch hinsichtlich Ile und Val, bei denen ebenfalls ein altersbedingter Anstieg relativ zum Lys beobachtet wurde. Unter Mittelwertbildung der beiden Wachstumsversuche ergaben sich folgende Aminosäurenverhältnisse: Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val von 100:62:18:95:68:72 für Broiler in der Altersperiode 0. - 21. LT und Lys:Thr:Trp:Arg:Ile:Val von 100:73:15:92:73:82 für Broiler in der Altersperiode 21. - 35. LT.

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eine Gerätes, welches die Überwachung von mehreren hundert Mikrobioreaktoren ermöglicht. Dabei sollte es, neben der Reduzierung von Kosten und Arbeitskraft, die konventionellen Pipettiermethoden in der zeitliche Auflösung übertreffen. Weiterhin soll es über eine Gradientenerzeugung verfügen, um sehr feine Variationen der Zusammensetzung des verwendeten Mediums zu ermöglichen. Dafür wurde ein Analysator für fluoreszierenden Tropfen (Fluorescent Droplet Analyser) entwickelt, mit dem ein segmentierter Fluss von mehreren hundert Tropfen erzeugt werden kann und für viele Tage gemessen werden kann. Für die Messung wurde der Analysator mit einer flexiblen Fluoreszenzoptik ausgestattet um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe oder Molekühle detektieren zu können. Mehrere Experimente wurden durchgeführt, welche das Potentials des Gerätes zeigen. Einzelne Zellen des Pantoffeltierchen (Paramecium tetraurelia) konnten in einzelnen Tropfen eingeschlossen werden und mit einem metabolischen Farbstoffe ihre Stoffwechselaktivität gemessen werden. Ebenfalls wurden viele Experimente mit Pseudomonas fluorescens und E.coli YFP durchgeführt. Durch die flexible Fluoreszenzoptik konnte das Wachstum beider Arten in eine Experiment gemessen werden.

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eine Gerätes, welches die Überwachung von mehreren hundert Mikrobioreaktoren ermöglicht. Dabei sollte es, neben der Reduzierung von Kosten und Arbeitskraft, die konventionellen Pipettiermethoden in der zeitliche Auflösung übertreffen. Weiterhin soll es über eine Gradientenerzeugung verfügen, um sehr feine Variationen der Zusammensetzung des verwendeten Mediums zu ermöglichen. Dafür wurde ein Analysator für fluoreszierenden Tropfen (Fluorescent Droplet Analyser) entwickelt, mit dem ein segmentierter Fluss von mehreren hundert Tropfen erzeugt werden kann und für viele Tage gemessen werden kann. Für die Messung wurde der Analysator mit einer flexiblen Fluoreszenzoptik ausgestattet um unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe oder Molekühle detektieren zu können. Mehrere Experimente wurden durchgeführt, welche das Potentials des Gerätes zeigen. Einzelne Zellen des Pantoffeltierchen (Paramecium tetraurelia) konnten in einzelnen Tropfen eingeschlossen werden und mit einem metabolischen Farbstoffe ihre Stoffwechselaktivität gemessen werden. Ebenfalls wurden viele Experimente mit Pseudomonas fluorescens und E.coli YFP durchgeführt. Durch die flexible Fluoreszenzoptik konnte das Wachstum beider Arten in eine Experiment gemessen werden.:1 Introduction 1 1.1 Motivation 1 1.2 Scope of this thesis 2 1.3 State of the art 3 2 Fundamentals 2.1 Millifluidics vs. microfluidics 5 2.1.1 Droplet based microfluidics 6 2.1.2 Surfactant in droplet-based millifluidics 7 2.2 The model of microorganism growth 8 2.3 The fluorescence based detection 9 3 Materials & Methods 3.1 The culture of the microorganisms and preparation 11 3.1.1 The Paramecium tetraurelia 11 3.1.2 Pseudomonas fluorescens 12 3.1.3 Escherichia coli 12 3.1.4 The bacteria culture 13 3.2 The Poisson distribution . 15 3.3 The composition of the emulsion 16 3.4 The fluidic components 17 3.5 Modules of the Fluorescent Droplet Analyser 18 3.5.1 The optocoupled relay card 18 3.5.2 The used fluidic pumps 19 3.5.3 The photonic elements of the FDA 19 3.5.4 The light sources 21 3.5.5 The optical fibres 23 3.5.6 The used detectors 23 3.6 The operating Software 24 4 The Fluorescent Droplet Analyser 4.1 The fluidic network for droplet generation and shuttling 26 4.1.1 Generation of a droplet sequence 28 4.1.2 Measuring a droplet sequence 30 4.2 The electric schematics of the FDA 31 4.3 The light source, guidance, and detection 32 4.3.1 Preparation of the fibres 33 4.3.2 The detection setup 35 4.4 The developed LabView program for operating the FDA 37 4.4.1 The automated measurement process 40 4.4.2 The peak mode 41 4.4.3 The time mode 42 4.4.4 The combined mode 42 4.4.5 The dynamic threshold 42 4.5 The developed VI program for analysing the data of the FDA 44 4.6 Flow characteristics of the FDA 46 4.6.1 Basic flow characteristics 46 4.6.2 Characteristics for shuttling of a droplet sequence 47 4.6.3 Influence of the hydrodynamic resistance 48 5 Monitoring of Paramecium tetraurelia 5.1 Introduction 51 5.2 Generation of a droplet sequence for Paramecium tetraurelia 53 5.3 Metabolic dynamics in droplets 54 5.4 Ecotoxicity assays 58 6 Monitoring of bacteria 6.1 Introduction 63 6.2 Generation of a droplet sequence for the bacteria experiments 64 6.3 Cell number calibration of the FDA 65 6.4 Monitoring of the bacteria growth 68 6.5 Investigation of the of the fluorescence signal 70 6.6 One bacteria cell in a droplet 71 6.7 The determination of the minimum inhibitory concentration 74 6.8 Long-term monitoring 80 6.9 Sectioning of the droplet sequence 80 6.10 Multicolor fluorescence detection 83

Les protéines fluorescentes, comme la GFP (green fluorescent protein), sont des protéines naturellement fluorescentes qui sont utilisées pour leur rôle de marqueur, permettant de localiser des protéines dans les cellules et d'en suivre les déplacements. De nombreuses études expérimentales et théoriques ont été menées ces dix dernières années sur les protéines fluorescentes. De là, se forge une compréhension essentiellement qualitative du rôle de la protéine vis-à-vis de l'obtention ou non d'une émission radiative : il apparaît que la protéine permet la fluorescence en bloquant les processus qui la désactivent ; ces processus de désactivation sont très rapides et efficaces (à l'échelle de la picoseconde) dans le cas du chromophore seul, et ils sont bien identifiés comme étant des torsions autour des liaisons intercycles (tau et phi). Dans la protéine, la sensibilité des temps de vie de fluorescence à des mutations proches ou non du chromophore, à des modifications de pH ou de température laisse supposer un contrôle de la dynamique du chromophore par différents paramètres, sans qu'ils soient pour autant identifiés et mis en relation.Une étude de la dynamique de la protéine permettrait de faire la lumière sur les mécanismes responsables de ces phénomènes photophysiques pour lesquels une analyse structurale ne suffit pas. Cependant l'étude de la dynamique est limitée par la taille du système (>30 000 atomes), par l'échelle de temps des phénomènes photophysiques considérés (dizaine de nanosecondes) et par le fait que les deux torsions tau et phi sont fortement couplées dans l'état excité du chromophore. Ces trois facteurs excluent les méthodes de dynamique existantes aujourd'hui ; dynamique quantique (AIMD), dynamique mixte classique-quantique (QM/MD) et dynamique moléculaire classique (MD).Nous avons surmonté le problème par la modélisation de la surface d'énergie potentielle de torsion du chromophore à l'état excité basée sur des calculs quantiques de haute précision, par une interpolation des valeurs obtenues par une expression analytique appropriée en fonction des angles de torsion tau et phi et avec une précision suffisante pour reproduire des barrières de l'ordre de la kcal/mol, et enfin, par l'implémentation de cette expression analytique dans le programme parallèle AMBER. Une deuxième difficulté théorique concerne la simulation et l'analyse statistique d'événements peu fréquents à l'échelle de la nanoseconde, et dont on ne connait pas le chemin de réaction, ici les déformations de la protéine et du chromophore conduisant aux géométries favorables à la conversion interne. Grâce à ces développements et aux simulations qu'ils ont permises, nous avons réalisé la première modélisation de la désactivation non-radiative par conversion interne à l'échelle de la nanoseconde dans trois protéines fluorescentes différentes. L'analyse des dynamiques moléculaires classiques nous donne une évaluation quantitative des temps de vie de l'extinction de fluorescence, en accord avec les données expérimentales. Par ailleurs elle nous a permis d'identifier les mouvements moléculaires concertés de la protéine et du chromophore conduisant à cette extinction. De ces résultats, émerge une représentation plus complète du mécanisme qui libère la torsion du chromophore ou qui la déclenche : il peut venir d'un mouvement spécifique de la protéine, qui se produit à l'échelle de la nanoseconde, ou bien de plusieurs mouvements spécifiques, plus fréquents (rupture de liaisons hydrogène, rotation de chaînes latérales, dynamique d'agrégats d'eau), mais qui coïncident seulement à l'échelle de la nanoseconde. Ces mouvements spécifiques n'ont pas un coût énergétique important mais la nécessité de leur coïncidence crée un délai de l'ordre de quelques nanosecondes alors que dans le vide la torsion se produit en quelques picosecondes. Dans le cas des protéines étudiées, on a identifié en grande partie les mécanismes et les acides aminés qui sont impliqués.