L’hidrosadénite suppurée (HS) ou maladie de Verneuil, est une maladie cutanée orpheline fréquente qui touche 1 % de la population générale. Elle se manifeste par des lésions inflammatoires récidivantes ou chroniques des plis axillaires, inguinaux et périnéaux. La sévérité clinique de la maladie varie selon les patients. Les lésions les moins sévères (lésions de stade 1 dans la classification de sévérité clinique de Hurley) sont des nodules inflammatoire centimétriques pouvant évoluer vers l’abcédation. Les lésions les plus sévères (lésions de stade 2 et 3 de Hurley) sont des lésions suppurées étendues et chroniques. Sur le plan histologique, la lésion primitive de l’HS semble être une hyperplasie de l’épithélium du follicule pileux. La physiopathologie de la maladie est mal connue et probablement multifactorielle, incluant des facteurs génétiques, hormonaux, infectieux et dys-immunitaires. Il a été montré récemment qu’une antibiothérapie à large spectre pouvait permettre d’obtenir une rémission clinique prolongée des lésions inflammatoires de l’HS. Objectif du travail : L’objectif principal de ce travail était d’identifier par des techniques de culture classique et de métagénomique bactérienne les espèces ou les flores bactériennes spécifiquement associées aux lésions d’HS des trois stades de sévérité clinique. Résultats : Nous avons identifié par culture bactérienne deux profils bactériens lésionnels. Le premier était représenté par Staphylococcus lugdunensis, et plus rarement par d’autres espèces bactériennes de la flore cutanée commensale (Propionibacterium acnes, staphylocoques à coagulase négative et Staphylococcus aureus). Le second correspondait à une flore anaérobie composée de bactéries anaérobies stricts, d’Actinomycetes et de streptocoques du groupe milleri. L’approche métagénomique a permis d’identifier les germes anaérobies stricts associés aux lésions : des cocci à Gram positif de la flore cutanée (principalement Anaerococcus spp., Peptoniphilus spp., Finegoldia spp.) des bacilles à Gram négatif anaérobies n’appartenant pas à la flore cutanée (Prevotella spp., Porphyromonas spp., Fusobacterium spp), Veillonellaceae et Corynebacteriaceae. Ce profil était caractéristique des lésions suppurées chroniques de stade 2 et 3 et était également associé à certaines lésions de stade 1. Les lésions des stades 2 et 3 présentaient une diversité bactérienne supérieure à celle des lésions de stade 1, avec un nombre plus élevé de taxons très minoritaires dans la flore cutanée (Fusobacteria, Bacteroidetes, Peptococcaceae, Erysipelotrichales). Conclusion : Cette étude démontre que certaines espèces bactériennes sont spécifiquement associées aux lésions d’HS. Ces espèces sont impliquées dans des infections cutanées, mais aussi dans des infections sévères, ce qui témoigne de leur pathogénicité. L’efficacité des antibiotiques chez les patients et les résultats de cette étude suggèrent qu’un processus infectieux participe à la présentation clinique de l’HS. Notre hypothèse est que ces infections surviennent en raison d’une anomalie primitive de la barrière cutanée folliculaire. / Hidradenitis suppuratiav (HS) is an orphan skin inflammatory disease disease characterized by chronic or recurrent inflammatory lesions localized in the armpits, the inguinal and perineal folds. With a 1% prevalence of a general population, HS is an public health issue. The clinical severity of the disease is heterogeneous among patients. Most patients present the mild form of the disease with inflammatory nodules and abscesses (Hurley stage 1 lesions). More severe patients show extended chronically suppurating lesions (Hurley stage 2 and Hurley stage 3 lesions). The primary histological lesion of HS is characterized by epidermal follicular hyperplasia and perifollicular inflammation. The physiopathology of HS remains unclear. HS is probably a multifactorial disease, involving genetical, immunological and infectious factors. Indeed, wide-spectrum antibiotic treatments can significantly improve or induce prolonged clinical remissions of HS inflammatory lesions. Objective: The main objective of this work was to identify the bacterial species or flora specifically associated with Hurley stage 1, 2 and 3, using prolonged aerobic and anaerobic culture and bacterial metagenomics (454 sequencing of 16Sr DNA libraries). Results. Using bacterial culture, we identified two bacterial profiles associated with HS lesions . The first one was represented by Staphylococcus lugdunensis and rarely by other skin commensals (Propionibacterium acnes, coagulase negative staphylococci and Staphylococcus aureus). Results. The second one corresponded to a mixted anaerobic flora including strict anaerobes, Actinomycetes and milleri group streptococci. The metagenomic approach allowed to identify the anaerobic flora associated with lesions : Gram positive cocci from the cutaneous flora (mainly Anaerococcus spp., Peptoniphilus spp., Finegoldia spp.) and Gram negative rods which do not belong to the cutaneous microbiota (Prevotella spp., Porphyromonas spp., Fusobacterium spp), Veillonellaceae and Corynebacteriaceae. This profile was typically associated with Hurley stage 2 and 3 lesions but was also observed in Hurley stage 1 lesions. Hurley stage 2 and 3 lesions presented an increased bacterial diversity as compared to Hurley stage 1 lesions, with a higher number of taxa taxa rarely associated with normal skin microbiota (Fusobacteria, Bacteroidetes, Peptococcaceae, Erysipelotrichales). Conclusion. This study demonstrate that particular bacterial species are specifically associated with HS lesions. These species are cause soft tissue and skin infections, but also in severe infections arguing for their pathogenicity. These data provide a rationale for antibiotic use in HS, and suggests that the disease may be due to a primitive immune defect of the follicular skin barrier.

Abstract The aims of this work were to study the carriage of respiratory bacteria and to identify risk factors affecting pharyngeal colonisation by these pathogens among young Finnish men during military service, and also to investigate the role of mannose-binding lectin (MBL) concentrations and MBL2 gene polymorphisms in the carriage of respiratory bacteria. A total of 892 military recruits entering the Kainuu Brigade, including 224 men with asthma, were followed up prospectively to the end of their military service. Carriage of Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis and beta-haemolytic streptococci appeared to be higher during and at the end of military service than at the beginning. Smoking was found to be a significant risk factor for colonisation by these bacteria. S.pneumoniae was more common in the asthmatic than military conscripts in the non-asthmatic ones at the beginning of military service. A low MBL level increased the risk of carrying N. meningitidis and beta-haemolytic streptococci during military service among non-smokers but not among smokers. Low MBL levels producing MBL2 haplotypes seemed to be associated with the carriage of N. meningitidis and S. pneumoniae. Characterisation of all the oropharyngeal N.meningitidis isolates obtained (n=215) by phenotypic and genotypic methods showed that most of them belonged to the carriage-associated ST-60 clonal complex. Clonal complexes ST-41/44, ST-32, and ST-23, which have previously been associated with disease, also accounted for a third of the carriage strains. Furthermore, a significant association was indicated between an acute upper respiratory infection and oropharyngeal carriage of the virulent meningococcal ST-23 clone. In conclusion, the results reported here show a significant increase in bacterial carriage during military service and provide new information on the association between MBL and carriage of respiratory bacteria. These findings also highlight the importance of smoking cessation, especially among military conscripts, who have been found to be a risk group for invasive bacterial diseases, and they also point to the importance of meningococcal vaccination for military recruits and the need for an efficacious vaccine against serogroup B meningococci. / Tiivistelmä Hengitystieinfektiot ovat yleisiä varusmiespalvelun aikana. Myös oireeton bakteerien nielukantajuus on lisääntynyt. Useimmiten infektiot ovat lieviä virusinfektioita, mutta bakteerien nielukantajuus voi johtaa myös vaikeisiin bakteeritulehduksiin. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia bakteerien nielukantajuutta varusmiespalveluksen alkaessa ja päättyessä sekä mahdollisten hengitystieinfektioiden aikana ja näin saada uutta tietoa bakteerien nielukantajuuteen vaikuttavista tekijöistä. Lisäksi tavoitteena oli selvittää mannoosia sitovan lektiinin (MBL) sekä MBL2-geenin polymorfismien yhteyttä bakteerien nielukantajuuteen. Työn tarkoituksena oli myös feno- ja genotyypittää varusmiehiltä palveluksen aikana eristetyt meningokokkikannat ja verrata niitä vastaavana ajankohtana invasiivista tautia sairastaneista henkilöistä eristettyihin meningokokkikantoihin. Tutkimuksessa seurattiin prospektiivisesti 892 varusmiestä, jotka suorittivat asepalveluksen Kainuun Prikaatissa vuosina 2004–2006. Tutkimukseen osallistuneista varusmiehistä 224:llä oli astma. Tutkimuksessa havaittiin, että oireeton bakteerien nielukantajuus lisääntyy merkitsevästi varusmiespalveluksen aikana. Lisäksi havaittiin, että tupakointi oli merkittävä itsenäinen riskitekijä pneumokokin, meningokokin sekä beta-hemolyyttisten streptokokkien nielukantajuudelle varusmiespalveluksen aikana. Astmaatikkojen pneumokokin nielukantajuus varusmiespalveluksen alussa oli yleisempi kuin terveiden varusmiesten. Tutkimuksessa osoitettiin myös pienen seerumin MBL-pitoisuuden sekä MBL2-geenin polymorfismin eksoni 1:n alueella ja geenin säätelyalueella olevan riskitekijöitä meningokokin, pneumokokin sekä beta-hemolyyttisten streptokokkien nielukantajuudelle tupakoimattomilla varusmiehillä. Meningokokin nielukannoista jopa kolmasosa kuului genotyyppiryhmään, jonka on aiemmissa tutkimuksissa havaittu liittyvän invasiiviseen tautiin. Tutkimuksessa osoitettiin myös tietyn hyperinvasiivisen meningokokin genotyypin (ST-23) liittyvän hengitystieinfektioepisodeihin. Tässä väitöskirjatyössä osoitettiin, että bakteerien nielukantajuus lisääntyy merkitsevästi varusmiespalveluksen aikana ja että oireettomilla varusmiehillä tavataan myös hyperinvasiivisia meningokokkikantoja. Tutkimus antoi myös uutta tietoa hyperinvasiivisten meningokokin genotyyppien liittymisestä hengitystieinfektioihin sekä MBL:n vaikutuksesta bakteerien nielukantajuuteen. Tutkimushavainnot tukevat tupakoimattomuuden edistämisen tärkeyttä myös varusmiespalveluksen aikana.

Early childhood caries (ECC) is closely related to high numbers of mutans streptococci, lactobacilli and Candida albicans . Oral colonization of these microorganisms was monitored in a prospective clinical study in order to investigate the effect of comprehensive treatment under general anesthesia and the sustainability of microbial changes. Saliva samples were collected from 50 healthy infants with ECC before and in regular intervals up to 12 months after treatment. Microorganisms were detected by cultivation on selective agars (CRT ® bacteria and Sabouraud/CandiSelect TM ) and scored. Additionally, plaque on upper front teeth and the dmft were recorded. Parents were repeatedly interviewed regarding the children’s diet and oral hygiene, accompanied by corresponding advice. Plaque frequency and the numbers of mutans streptococci, lactobacilli and yeasts were significantly reduced as a result of treatment (p < 0.0001, Wilcoxon test). Nevertheless, this effect was not permanent. An ordinal regression model on the follow-up period revealed that the odds for bacteria and yeasts to reach a higher score increased linearly over time (p < 0.01) with an odds ratio of 2.244 per year. One third (34%) of the children developed new dentinal lesions within 1 year postoperatively. High scores of lactobacilli before treatment predicted caries relapse (p < 0.05). Nutritional and oral hygiene habits changed only slightly despite advising. Elimination and restoration of ECC lesions under general anesthesia proved to be an effective procedure in reducing cariogenic bacteria and yeasts. A satisfactory and sustainable success, however, could be achieved neither regarding microbiologic parameters nor with respect to the relapse rate. More suitable strategies are needed.

Streptococcus (S.) agalactiae sind grampositive, in Ketten gelagerte Kokken, die auf Blutagar eine Hämolyse zeigen. Aufgrund ihrer Zugehörigkeit zur Lancefield-Gruppe B werden sie auch als Gruppe B Streptokokken (GBS) bezeichnet (Hof, 2005). GBS sind die Hauptursache von Sepsis, Meningitis und Pneumonie bei Neugeborenen (Schrag, et al., 2000). Die Arbeit beschäftigte sich mit der Genotypisierung von GBS. Darüber hinaus konnten auch Einblicke in die Phylogenese sowie die Populationsstruktur von GBS gewonnen werden. Ziel war es, einen DNA-Microarray zu entwickeln und zur Genotypisierung von GBS einzusetzen. Während der Evaluierung des DNA Microarray konnten stammspezifische Muster beobachtet werden, diese wurden durch bereits etablierte Typisierungmethoden (MLST) bekannten Genotypen zugeordnet. Die Ergebnisse wurden in einer Datenbank zusammengefasst. Mithilfe der Datenbank konnte die Software zur Auswertung entwickelt werden. (siehe http://alere-technologies.com/en/products/lab-solutions.html). Der DNA-Microarray trägt Sonden für GBS-spezifische Virulenzfaktoren und Oberflächenmarker. Für die auf dem Microarray basierende Typisierung wurden 11 über das ganze Genom verteilte Gene bzw. Gencluster (bac, alp, pil1 locus, pepS8, fBsB, capsule locus, hylB, abiG-I/-II plus Q8DZ34, pil2 locus, nss plus srr plus rogB2 und rgfC/A/D/B) ausgewählt. Ubiquitär vorkommende, konservierte Gene (z. B. cylD/cylE) eignen sich nicht als Marker für eine Typisierung, wurden aber als Kontrollen und zur Normierung eingeschlossen. Zur vollständigen Charakterisierung wurden außerdem Sonden für hochmobile plasmidgebundene Resistenzgene wie z. B. erm(A), erm(B), erm(C), tet(M), emrB/qacA aufgetragen (Aracil, et al., 2002; Betriu, et al., 2003; Uh, et al., 2001). Diese Gene sind nicht für GBS spezifisch. Sie eignen sich z. B. für eine Unterscheidung einzelner Isolate, nicht jedoch für die Unterteilung der GBS Population in verschiedene Stämme. Für die vorliegende Arbeit wurden insgesamt 448 klinische Isolate von GBS ausgewählt und untersucht. Darunter waren Isolate, die schwerwiegende Erkrankungen wie Sepsis und Meningitis verursacht haben, Isolate aus lokalen Infektionen sowie Isolate von asymptomatischen/gesunden Trägern. Zu Vergleichszwecken wurden außerdem Isolate aus der Veterinärmedizin (von bovinen Mastitisfällen) und humane Isolate aus einer geographisch weit entfernten Region (Trinidad und Tobago) genotypisiert. Für 36 ausgewählte Isolate mit repräsentativen Hybridisierungsmustern wurde zusätzlich eine Typisierung mittels Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) (Jones, et al., 2003) durchgeführt. Die Hybridisierungsmuster vom Microarray wurden mit Daten aus diesem bereits etablierten Typisierungssystem verbunden. Durch die Verknüpfung beider Methoden konnte eine Einteilung der GBS Isolate in verschiedene Stämme vorgenommen werden. Mit Hilfe des eBURST-Algorithmus wurde gezeigt, dass einige Hybridisierungsmuster sich zu Gruppen zusammenfügen. Dieses Verfahren veranschaulicht die Populationsstruktur und beschreibt die genetische Vielfalt. Mit den 11 definierten Markern konnten die untersuchten Isolate 76 verschiedenen Stämmen bzw. „hybridization profiles“ (HP) zugeordnet werden. Die Einteilung beruht auf dem Fehlen bzw. Vorhandensein einzelner Gene/Gencluster bzw. deren allelischen Varianten. Diese Stämme korrelieren mit den durch MLST definierten klonalen Komplexen (CC). Isolate mit identischen oder ähnlichen Hybridisierungsprofilen gehören zum selben CC. Dagegen können Isolate mit einem ähnlichen MLST-Profil verschiedene Hybridisierungsmuster zeigen. Es konnte außerdem häufig beobachtet werden, dass ansonsten ähnliche Stämme sich in einzelnen Merkmalen, z. B. Kapsel-Genen, alp- oder pili-Genen, voneinander unterscheiden, und dass diese Gene unabhängig voneinander variieren. Zusätzlich zeigten einige ubiquitäre Gene/Gencluster, die sich in den publizierten Genomsequenzen immer an derselben Position befinden, zahlreiche verschiedene Allele. Welches Allel in einem gegebenen Stamm gerade vorliegt, scheint dabei eher zufällig zu sein. Eine Erklärung dieses Phänomens könnte in vergangenen Rekombinationsereignissen liegen. Auch eine konvergente Evolution könnte diskutiert werden. Ähnliche Stämme/ „hybridization profiles“ wurden in Analogie zu den MLST-definierten klonalen Komplexen zu Gruppen zusammengefügt. Das bedeutet jedoch nicht notwendigerweise eine direkte Verwandtschaft der Isolate im Sinne des Vorhandenseins eines unmittelbaren gemeinsamen Vorfahren. Die Typisierung sowohl über den DNA-Microarray als auch über die MLST kann nicht die „wahre“ Phylogenese im Rahmen der Evolutionsgeschichte und Herkunft widerspiegeln. Sie stellt lediglich ein zufälliges Modell dar, ein Ordnungssystem im Sinne eines genetischen Fingerabdrucks, das einen Vergleich von Isolaten, aber keine Rückschlüsse über deren Abstammung und Herkunft erlaubt.Die untersuchten GBS Isolate konnten in fünf klonale Komplexe (CC19, CC23, CC26, CC103, CC130) eingeteilt werden, deren Häufigkeit unterschiedlich war. Deutsche humanmedizinische Isolate konnten vorwiegend CC19 zugeordnet werden. Karibische humanmedizinische Isolate sind zumeist CC19 und CC23 zugehörig. Bovine Isolate gehören meist zu CC19 und CC103. Unter humanen Isolaten ist CC103 rar. Vermutlich basierend auf der geografischen und wirtsspezifischen Herkunft der untersuchten GBS Isolate gibt es Unterschiede in der Populationsstruktur. In der vorliegenden Arbeit war CC19 der am häufigsten gefundene und außerdem ein genetisch besonders inhomogener CC. Er besteht aus mehreren unterschiedlichen, bisher als eigenständig angesehenen CCs (darunter CC1, CC17, CC19 und CC22). Diese werden von dem zur MLST-Verwandtschaftsanalysen verwendeten eBURST-Algorithmus zu CC19 zusammengefasst, seit die MLST-Profile von 'missing links' zwischen den CCs identifiziert wurden, da eBURST „gemeinsame Vorfahren“ nicht von durch horizontalem Gentransfer bzw. durch Hybridisierungen entstandenen „Chimären“ unterscheiden kann. Da diese Komplexe klar unterscheidbare Hybridisierungsmuster aufweisen, wurden sie hier als CC19/01, CC19/17, CC19/19 und CC19/22 bezeichnet. Einzelne Gene traten in Gruppen von Isolaten aus verschiedener Herkunft unterschiedlich häufig auf. So fand sich der Virulenzfaktor scpB in 412 von 418 humanen Isolaten (98,6 %), aber nur in 10 von 21 Rinderisolaten (48 %). Ferner ließ sich beobachten, dass invasive Isolate weniger wahrscheinlich abiGI-/II und Q8DZ34 tragen, jedoch häufiger pil1 locus, fbsB (515) und Kapseltyp III sowie pil2b, nss/srr und rgf (COH1 like) aufweisen. Einige dieser Marker erscheinen zusammen in CC19/17-Stämmen, welche häufig bei invasiven Krankheitsverläufen beobachtet werden. CC19 (incl. ST01, ST17, ST19) konnte bei neonatalen Sepsis-Fällen in verschiedenen geografischen Regionen isoliert werden (Brzychczy-Wloch, et al., 2012; Ryu, et al., 2014; Sorensen, et al., 2010; Strakova, et al., 2010; Tien, et al., 2011). Zusätzlich wurden andere Virulenzfaktoren wie speM (Exotoxin M) und das cyl-Operon (beta-Hämolysin) untersucht. In lediglich sieben Isolaten wurde speM nachgewiesen. Das cyl-Operon konnte in allen Isolaten gefunden werden, sein Nachweis ist daher für eine Vorhersage der Virulenz eines gegebenen Isolates nicht hilfreich. Es konnte kein einzelner Faktor zur definitiven Unterscheidung zwischen invasiven Isolaten und Trägerisolaten bestimmt werden. Für die Virulenz eines Isolates ist wahrscheinlich nicht das bloße Vorhandensein oder Fehlen eines bestimmten Genes ausschlaggebend, sondern dessen Expression in vivo. Wichtig wäre in diesem Zusammenhang auch die genaue Betrachtung der Sequenz eines als Virulenzfaktor angesehenen Genes sowie die Untersuchung der zugehörigen regulatorischen Gene. Über den Nachweis der Gene erm(A), erm(B) und erm(C) konnte eine Aussage über die Macrolid-/Clindamycinresistenz eines GBS Isolates getroffen werden. Bei keinem der karibischen Isolate wurden erm Gene nachgewiesen. Innerhalb der deutschen GBS Population wurde erm(B) am häufigsten beobachtet. Die Gene erm(A) und erm(C) waren in humanen Isolaten selten und wurden in bovinen Isolaten überhaupt nicht gefunden. Das Tetracyclinresistenzgen tet(M) wurde häufig in humanen Isolaten und sehr selten in veterinärmedizinischen Isolaten gefunden. Für weiterführende Untersuchungen könnte die beschriebene Typisierungsmethode verfeinert werden. So lassen sich z. B. die oben beschriebenen 11 ausgewählten Typisierungsmarker des Microarrays mit denen der MLST zu einem 18 Marker-System verknüpfen. Daneben können auch erm-, cad-, mer- oder tet-Gene zur Feststellung oder zum Ausschluss der Identität verwandter Isolate in vitro oder in silico verwendet werden. Mit der nun einsatzbereiten Genotypisierungsmethode können in Zukunft weitere Studien zur Untersuchung regionaler und wirtsspezifischer Unterschiede der GBS Population durchgeführt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der DNA-Microarray stabile und reproduzierbare Resultate erbringt. Es kann ein detaillierter Befund erstellt werden, die Ergebnisse sind mit denen anderer Typisierungsmethoden und der Genomsequenzierung vergleichbar. Jedoch steht mit dem DNA-Microarray ein wesentlich unkomplizierteres und schnelleres Procedere zur Verfügung, welches zudem geringere Kosten verursacht.:1. Einleitung 5 1.1 Gegenstand der Untersuchung 5 1.2 Entdeckungsgeschichte 6 1.3 Klinische Bedeutung 7 1.4 Veterinärmedizinische Bedeutung 9 1.5 Stand der Forschung mit Hinblick auf Typisierung von GBS 9 1.6 Ziele der vorliegenden Untersuchung 10 1.7 Vorgehensweise 11 1.7.1 Untersuchungsmaterial 11 1.7.2 Untersuchungsmethode 11 1.8 Zur Typisierung ausgewählte Marker 12 2. DNA Microarray-Based Typing of Streptococcus agalactiae Isolates 15 2.1 Abstract 16 2.2 Introduction 17 2.3 Materials and methods 18 2.3.1 Bacterial isolates 18 2.3.2 Ethics statement 18 2.3.3 Preparation of genomic DNA 19 2.3.4 MLST 19 2.3.5 Microarray design and protocol optimization 19 2.3.6 Microarray procedures 20 2.3.7 eBURST 21 2.4 Results 22 2.4.1 Typing GBS by MLST 22 2.4.2 Genotyping GBS by microarray hybridization 22 2.4.3 Population structure 25 2.4.4 Detection of antibiotic resistance markers 25 2.4.5 Detection of heavy metal resistance markers 26 2.5 Discussion 27 2.6 Acknowledgments 30 2.7 References 31 2.8 Tables and figures 33 3. Zusammenfassung 45 3.1 Zusammenfassung 45 3.2 Summary 49 4. Korrespondenz mit dem Editor 53 4.1 Hinweise des Editors und der Gutachter 53 4.2 Antworten an den Editor 56 4.3 Endgültige Annahme 58 Anhang 61 / Streptococcus (S.) agalactiae are Gram-positive, chain-forming cocci, which show hemolysis on blood agar. They are also referred to group B streptococci (GBS) because of their affiliation to Lancefield-group B (Hof, 2005). GBS are the main cause of sepsis, meningitis and pneumonia in newborns (Schrag, et al., 2000). The work focused on genotyping of GBS. The aim was to develop a DNA microarray and to use it for epidemiological typing of GBS. During the evaluation of the microarray, strain-specific patterns could be observed and these patterns assigned to genotypes as defined by other typing methods (MLST). The results were summarized in a database that subsequently was developed into software for automated analysis of experiments (http://alere-technologies.com/en/products/lab-solutions.html). The DNA microarray carries probes for GBS specific virulence factors and surface markers. For the microarray-based typing, 11 genes or gene clusters were selected that are distributed across the entire genome (bac, alp, pil1 locus, pepS8, fBsB, capsule locus, hylB, abiG-I/-II plus Q8DZ34, pil2 locus, nss plus srr plus rogB2 and rgfC/A/D/B). Ubiquitous, conserved genes (e.g. cylD/cylE) were included to be used as species markers and controls. Furthermore, probes for highly mobile plasmid-borne resistance genes such as erm(A), erm(B), erm(C), tet(M), emrB/qacA were also included (Aracil, et al., 2002; Betriu, et al., 2003; Uh, et al., 2001). These genes are not specific to GBS, but they are found in some isolates. They can be used to distinguish individual, related isolates, rather than for a definition of distinct strains. A total of 448 isolates of GBS was selected and examined for the present work. Among them were isolates from severe diseases, such as sepsis and meningitis, isolates from local infections as well as isolates from asymptomatic/healthy carriers. For comparison, isolates from veterinary medicine (from cases of bovine mastitis) and human isolates from a geographically distant region (Trinidad and Tobago) were genotyped. For 36 selected isolates with representative hybridization patterns, parallel typing was performed using a second method, multilocus sequence typing (MLST) (Jones, et al., 2003). Hybridization patterns on the Microarray could thus be linked to this already established typing system. With the array based GBS typing isolates could be divided into 76 different strains or 'hybridization profiles', HP. The classification with both methods is based on the absence or presence of individual genes or gene clusters or their allelic variants. Similar isolates were lumped together. The eBURST algorithm was used to group strain-specific patterns into groups of related strains illustrating the population structure and describing the genetic diversity. Groups of similar hybridization patterns largely correlate with the clonal complexes (CC) defined by MLST. While isolates with identical or similar hybridization profiles belong to the same CC, isolates with a similar MLST profile can show different hybridization patterns. It has also often been observed that otherwise similar strains differ from each other in individual traits, e.g. capsule genes, alp or pili genes, and that these genes vary independently of one another. In addition, some ubiquitous genes/gene clusters, which are always localized at the same position in the published genomic sequences, show numerous different alleles and related strains (that belong to one clonal complex) might differ in the presence of one allele. Alleles are thus not linked to clonal complexes, but rather randomly distributed. An explanation of this phenomenon could be a frequent occurrence of recombination events or horizontal gene transfers. A convergent evolution could also be discussed as an alternative explanation. A similarity of hybridization profiles does not necessarily mean a direct phylogenetic relationship between the isolates in the sense of being derived from a direct common ancestor. Typing both the DNA microarray and the MLST cannot reflect the 'true' phylogenesis, evolutionary history and origin. Assuming frequent recombination i.e., random events, the MLST profiles as well as the hybridization patterns can be used as genetic fingerprints, allowing a comparison of isolates, but no conclusions about their phylogeny and origin. The investigated GBS isolates were classified into five clonal complexes (CC19, CC23, CC26, CC103, CC130) with very different relative abundances indicating differences in the population structure with regard to geographic origin and host organisms. German medical isolates were mainly assigned CC19. Caribbean medical isolates mostly were assigned to CC19 and CC23. Bovine isolates usually belonged to CC19 and CC103. Among human isolates, CC103 was rare. In the present work, CC19 was the most abundant and the genetically most inhomogeneous CC. Several different clusters that previously been regarded as CCs (CC1, CC17, CC19 and CC22) have recently been merged to CC19 by the eBURST algorithm since MLST profiles of missing links between the CCs have been identified. Unfortunately, eBURST cannot distinguish whether two MLST types are linked by true common ancestors or by hybrid or chimera strains originating from horizontal gene transfers or hybridization events. Since these complexes within CC19 have clearly distinguishable hybridization patterns, they have been referred to herein as CC19/01, CC19/17, CC19/19 and CC19/22, and we assume that they are linked by hybridizations or gene transfers rather than by shared ancestry. Few differences were found between isolates from different origins. The virulence factor scpB was found in 412 of 418 human isolates (98.6%), but only in 10 of 21 bovine isolates (48%). Furthermore, it was observed that invasive isolates are less likely to carry abiGI-/II and Q8DZ34, but are more likely to have pil1 locus, fbsB (515) and capsule type III as well as pil2b, nss/srr and rgf (COH1 like). Some of these markers appear together in CC19/17 strains, which are often observed in invasive disease. speM (exotoxin M) was also investigated. It was detected only in seven isolates. Contrarily, the cyl (beta-hemolysin) operon was found in all isolates. Thus, it detection is not helpful for a prediction of the virulence of a given isolate. No single factor could be identified that allowed a definitive distinction between invasive isolates and carrier isolates. Probably, the virulence of an isolate does not depend on the presence or absence of one particular gene. In this context, it would be important to investigate the expression in vivo of the various putative virulence factors as well as the allelic variants of the factors and of their associated regulatory genes. Macrolide-/clindamycin resistance genes erm(A), erm(B) and erm(C) can also be detected by the microarray. None of these genes was identified in any of the Caribbean isolates. Within the German GBS population, erm(B) was most frequently observed. The genes erm(A) and erm(C) were rare in human isolates, and they were not found in bovine isolates. The tetracycline resistance gene tet(M) was observed frequently in human isolates but only very rarely in veterinary isolates. With the genotyping method that was developed during the present work, further studies can be carried out to study regional and host-specific differences in the GBS population. For future investigations, the described typing method could further be refined. For example, the 11 selected typing markers on the microarray can be combined with those from MLST to one comprehensive marker system. In addition, it is also possible to use genes on mobile genetic elements such as resistance genes (erm, cad, mer or tet) to prove or to rule out the identity of related isolates in vitro or in silico. In our study, it was shown that the DNA microarray provides stable and reproducible results that are comparable to those of other typing methods and genome sequencing. However, since the DNA microarray offers a much more uncomplicated and faster procedure, which also results in lower costs, it is more suitable to a routine setting.:1. Einleitung 5 1.1 Gegenstand der Untersuchung 5 1.2 Entdeckungsgeschichte 6 1.3 Klinische Bedeutung 7 1.4 Veterinärmedizinische Bedeutung 9 1.5 Stand der Forschung mit Hinblick auf Typisierung von GBS 9 1.6 Ziele der vorliegenden Untersuchung 10 1.7 Vorgehensweise 11 1.7.1 Untersuchungsmaterial 11 1.7.2 Untersuchungsmethode 11 1.8 Zur Typisierung ausgewählte Marker 12 2. DNA Microarray-Based Typing of Streptococcus agalactiae Isolates 15 2.1 Abstract 16 2.2 Introduction 17 2.3 Materials and methods 18 2.3.1 Bacterial isolates 18 2.3.2 Ethics statement 18 2.3.3 Preparation of genomic DNA 19 2.3.4 MLST 19 2.3.5 Microarray design and protocol optimization 19 2.3.6 Microarray procedures 20 2.3.7 eBURST 21 2.4 Results 22 2.4.1 Typing GBS by MLST 22 2.4.2 Genotyping GBS by microarray hybridization 22 2.4.3 Population structure 25 2.4.4 Detection of antibiotic resistance markers 25 2.4.5 Detection of heavy metal resistance markers 26 2.5 Discussion 27 2.6 Acknowledgments 30 2.7 References 31 2.8 Tables and figures 33 3. Zusammenfassung 45 3.1 Zusammenfassung 45 3.2 Summary 49 4. Korrespondenz mit dem Editor 53 4.1 Hinweise des Editors und der Gutachter 53 4.2 Antworten an den Editor 56 4.3 Endgültige Annahme 58 Anhang 61

Im Rahmen der Untersuchung wurde bei 27 Patienten, die klinische Zeichen der Karies, aber keine pulpitischen Symptome zeigten, kariöses Dentin mit Hilfe eines sterilen Exkavators entnommen. Das durchschnittliche Alter der Patienten beträgt 41 Jahre und der Durchschnittswert des DMF-T-Index 12,5. Die Untersuchungsgruppe bestand zu 55,5 % aus männlichen Probanden sowie zu 44 % aus Rauchern. Nach Isolierung von 107 Reinkulturen aus den Patientenproben erfolgte die Identifizierung der oralen Streptokokken mittels eines mikrobiologischen Standardtests (RapidID-32Strep der Firma BioMérieux) und MALDI-TOF-MS-Analyse. Parallel wurden speziesspezifische PCRs der Dentinproben für S. sanguinis, S. constellatus, S. intermedius, S. anginosus, S. mutans, S. salivarius, S. oralis, S. mitis, S. gordonii und S. parasanguinis durchgeführt. Mittels MALDI-TOF-MS-Analyse konnten insgesamt sechs verschiedene Spezies oraler Streptokokken in den Dentinproben nachgewiesen werden. Am häufigsten kamen Vertreter der Mitis-Gruppe vor (in 89 % der Dentinproben), gefolgt von S. gordonii und S. sanguinis (zu 52 % und 26 % vertreten). Die MALDI-TOF-MS-Methode erwies sich als geeignetere der mit Kultivierung verbundenen Nachweismethoden. Ihre Ergebnisse wurden durch selektive PCRs einzelner Subkulturen und DNA-Sequenzierung bestätigt. Mittels der speziesspezifischen PCRs der Dentinspäne wurden zehn verschiedene Spezies oraler Streptokokken identifiziert. Vertreter der Mutans-Gruppe wurden so zu durchschnittlich 44 %, S. salivarius zu 37 % nachgewiesen. Es zeigte sich ein signifikantes Vorkommen von S. anginosus in Proben, die ebenfalls S. mutans enthielten (p= 0,00213). Alle drei Verfahren sind zur Untersuchung klinischer Proben geeignet, wobei die MALDI-TOF-MS-Analyse die genaueste Differenzierung auf Speziesebene ermöglicht. Die Non-Mutans-Streptokokken S. oralis, S. gordonii und S. anginosus scheinen die Mikroflora von kariösem Dentin zu dominieren. Sie übertrafen in der vorliegenden Arbeit in ihrem Vorkommen S. mutans in mehr als der Hälfte der untersuchten Proben. Diese Beobachtung stützt die erweiterte ökologische Plaquehypothese.

Tendo em vista o importante papel desempenhado pelos Streptococcus mutans e pelos Streptococcus sobrinus na etiologia da cárie dental, assim como a relevância do meio de cultura empregado para a detecção desses microrganismos, os objetivos do presente estudo foram: Capítulo 1- Avaliar a eficácia do meio de cultura SB-20 modificado (SB-20M) na diferenciação morfológica de colônias de S. mutans e de S. sobrinus, comparativamente à análise bioquímica das colônias isoladas, na saliva de crianças; Capítulo 2- Comparar os meios de cultura SB-20, SB-20M e MSB na quantificação (contagem) de unidades formadoras de colônias (ufc) e na diferenciação morfológica e bioquímica de S. mutans e S. sobrinus, na saliva de crianças; e Capítulo 3- Empregar o meio de cultura SB-20M sem ágar, denominado Caldo Sacarose-Bacitracina modificado (CaSaB- 20M), para avaliar a viabilidade de cepas padrão de S. mutans (ATCC25175) in vitro e a viabilidade de estreptococos do grupo mutans in vivo, nas cerdas de escovas dentais, após diferentes períodos de secagem. No Capítulo 1, a eficácia do meio SB-20M foi avaliada tomando-se amostras de saliva não-estimulada de 145 crianças de 6 a 12 anos de idade, por meio da técnica da espátula de madeira. Após semeadura e incubação em microaerofilia, foi efetuada a contagem das ufc em microscópio estereoscópico e realizada a identificação morfológica e bioquímica (biotipagem) das colônias de S. mutans e de S. sobrinus. Os resultados obtidos após as identificações morfológicas e bioquímicas foram comparados empregando o teste x2. No Capítulo 2, a comparação dos meios de cultura SB-20, SB-20M e MSB foi efetuada em amostras de saliva não-estimulada, colhidas de 20 crianças na faixa etária de 4 a 12 anos, em tubos de ensaio. Amostras de saliva pura e diluídas até 10-4 foram semeadas em placas contendo os referidos meios, por meio de um micrométodo, e incubadas em microaerofilia. A seguir, foi efetuada a contagem das ufc e a identificação morfológica e bioquímica das colônias de S. mutans e de S. sobrinus. Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística, utilizando o teste de Wilcoxon e o teste exato de Fisher. No estudo in vitro do Capítulo 3, um total de 45 escovas dentais infantis, divididas em 9 grupos (n=5 por grupo), foram ontaminadas com uma suspensão contendo Streptococcus mutans (cepa ATCC 25175), na concentração de 1.720.000 unidades formadoras de colônias por mL (escala 0,5 de McFarland), durante 4 minutos. Logo após a lavagem, as escovas do Grupo 1 (controle) foram submetidas ao processamento microbiológico. As escovas dos Grupos 2 a 9 foram mantidas à temperatura ambiente por 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60 e 72 horas, respectivamente, previamente ao processamento microbiológico, em meio de cultura CaSaB-20M. A seguir, foi efetuada a contagem de ufc de S. mutans nas cerdas. Os resultados obtidos foram analisados por meio do teste de Kruskal-Wallis. No estudo in vivo do Capítulo 3 participaram 20 crianças de 4 a 8 anos com alto risco à cárie dental. Cada criança recebeu 13 escovações, com intervalo de 3 dias entre cada escovação, empregando sempre uma escova dental nova, sem dentifrício. As 260 escovas obtidas foram divididas em 13 grupos (n=20 por grupo). Logo após a lavagem, as escovas do Grupo 1 (controle) foram submetidas ao processamento microbiológico. As escovas dos Grupos 2 a 13 foram mantidas à temperatura ambiente por 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 e 48 horas, respectivamente, previamente ao processamento microbiológico, ou seja, semeadura e incubação em meio CasB-20M. Após a incubação foi efetuada a contagem de ufc de S. mutans e a quantificação dos polissacarídeos extracelulares presentes nas cerdas. Os dados obtidos foram avaliados por meio do teste de Wilcoxon. O nível de significância em todas as análises estatísticas foi de 5%. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que o método de identificação morfológica, empregando o meio de cultura SB-20M, foi confiável para a identificação de S. mutans e S. sobrinus. Os meios SB-20 e SB-20M foram semelhantes na quantificação de estreptococos do grupo mutans e na identificação morfológica e bioquímica de S. mutans e de S. sobrinus, evidenciando que a ubstituição da sacarose pelo açúcar cristal não alterou a eficácia do meio. Quando comparado ao meio MSB, o SB-20M apresentou resultados estatisticamente superiores, com relação à uantificação de ufc e com relação à identificação morfológica e bioquímica de S. mutans e de S. sobrinus. O Caldo Sacarose-Bacitracina modificado (CaSaB-20M) permitiu avaliar a viabilidade de estreptococos do grupo mutans nas cerdas de escovas dentais, após diferentes períodos de secagem. De acordo com o estudo in vitro com cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175), observou-se viabilidade de microrganismos nas escovas dentais por até 8 horas. Por outro lado, no estudo in vivo, os estreptococos do grupo mutans permaneceram viáveis por períodos superiores (44 horas) / The important role veloped by Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in dental caries ethyology as well as the relevance of the culture medium used for the detection of these microorganisms, the aims of the present study were divided into three parts as follows: Chapter 1 To evaluate the modified SB-20 culture medium efficacy (SB-20M) in the morphologic differentiation of the S. utans and S. sobrinus colonies comparatively to the biochemical analysis of the isolated colonies in childrens saliva samples; Chapter 2 To compare the culture media SB- 20, SB-20M, and MSB in the quantification (counting) of the colony forming units (cfu), and in the morphological and iochemical differentiation of S. mutans and S. sobrinus in childrens saliva; and Chapter 3 To employ the SB-20M culture medium without agar, called Sucrose Bacitracin Broth Modified (CaSaB-20M), in order to evaluate the viability of the in vitro S. mutans pattern strains (ATCC 25175), and the viability of the in vivo mutans streptococci in toothbrush bristles after different dry periods. In Chapter 1, the efficacy of the SB-20M was evaluated by wood spatula technique using non-stimulated saliva samples of 145 children of 6 to 12 years old. After seeding and incubation in microaerophilic conditions, the cfu counting in stereoscopic microscope, and the morphological and biochemical identification (biotyping) of S. mutans and S. sobrinus colonies were made. The results obtained after morphological and biochemical identifications were compared by the X2 test. In Chapter 2, the comparison of the SB-20, SB-20M, and MSB culture medium was made using assay tubes with non-stimulated saliva samples of 20 children with age between 4 and 12 years old. Samples of pure and diluted saliva (until 10-4) were seeded by a micromethod in Petri dishes with the culture media, and incubated under microaerophilic conditions, followed by the cfu counting, and morphological and biochemical identification of S. mutans and S. sobrinus colonies. The results obtained were submitted to the statistical analysis using Wilcoxon test and the exact Fisher test. In the in vitro study of the Chapter 3, a total of 45 childrens toothbrush divided in 9 groups (n=5 per group) were infected with a Streptococcus mutans (strain ATCC25175) suspension, under the concentration of 1.720.000 colony forming unities by mL (McFarland 0.5 scale) during 4 minutes. Briefly, after washing the Group 1 toothbrushes (control) were submitted to the microbiological processing. Group 2 to 9 toothbrushes were maintained in room temperature for 4, 8, 12, 14, 24, 36, 48, 60, and 72 hours respectively, previously to microbiological processing in CaSaB-20M culture medium. After that, the S. mutans cfu counting in the bristles were made. The results obtained were analysed by KruskalWallis test. In the in vivo study of the Chapter 3, 20 high caries risk children of 4 to 8 years old children have been participated. Each child received 13 times brushing, with intervals of 3 days between each brushing using always a new toothbrush with no toothpaste. The 260 obtained toothbrushes were divided into 13 groups (n=20 per group). After whashing the Group 1 toothbrushes (control) were submitted to microbiological processing. The other ones (groups 2 to 13) were maintained in room temperature for 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, and 48 hours respectively, previously the microbiological processing (CaSaB-20M). After incubation the S. mutans cfu counting and the quantification of extracellular polysaccharides present in the bristles were made. The data obtained were evaluated by Wilcoxon test. The level of significance in all statistical analysis was 5%. Based on the results obtained we could conclude that de morphological method for identification using SB-20M culture medium was trustable for the identification of S. mutans and S. sobrinus. The SB-20 and SB-20M showed the same effect in the quantification of the mutans streptococci, and in the morphological and biochemical identification of S. mutans and S. sobrinus evidentiating that the substitution of sucrose for coarse granular cane sugar (SB-20M) did not altered the efficacy of the medium. When compared to MSB medium, the SB-20M showed results statistically superiors with relation to cfu quantification, and morphological and biochemical of S. mutans and S. sobrinus. Sucrose-Bacitracin modified broth (CaSaB-20M) allowed the evaluation of the viability of mutans streptococci in toothbrush bristles after different drying times. According to the in vitro study with Streptococcus mutans (ATCC 25175), we could observe viability of microorganisms in toothbrush bristles for 8 hours remaining. On the other hand, in the in vivo study the mutans streptococci remain viable for extended periods (44 hours).

Les éléments génétiques mobiles contribuent grandement à la diversité et à l’évolution des génomes bactériens par le biais du transfert horizontal. Parmi eux, les éléments intégratifs conjugatifs (ICE) codent leur propre excision, leur transfert par conjugaison et leur intégration. En revanche, les éléments intégratifs et mobilisables (IME) ne sont autonomes que pour leur excision et intégration et ne codent seulement que certaines des protéines/fonctions (oriT) dont ils ont besoin pour leur transfert conjugatif. Par conséquent, les IME ont besoin d’un élément conjugatif « helper » pour se transférer. Malgré leur impact sur le flux des gènes et l’évolution des génomes, la prévalence des ICE reste peu étudiée et seulement très peu d’IME avaient été identifiés au début de cette étude. De plus, bien que plusieurs méthodes de détection des ilots génomiques existent, aucune d’elles n’est dédiée aux ICE ou aux IME. Ce qui ne facilite pas l’analyse exhaustive de ces éléments. Le genre Streptococcus appartient au phylum des firmicutes. La quasi-totalité des streptocoques sont des bactéries commensales ou pathogènes de l’homme et d’autres animaux. Aussi, 2 espèces de streptocoques sont utilisées en tant que ferments lactiques lors la production de laits fermentés et divers fromages. Globalement, le genre streptocoques représente un groupe d’intérêt pour l’homme, l’étude du flux de gènes au sein de ces organismes et l’impact qu’il peut avoir sur leur mode vie est primordiale. Au cours de cette thèse, nous avons recherché les ICE et les IME dans 124 souches de streptocoques appartenant à 27 espèces en utilisant une base de données de référence comportant des protéines dites « signatures » d’IME et d’ICE (de leurs modules de conjugaison/mobilisation et d’integration/excision). Cette analyse exhaustive a permis l’identification et la délimitation de 131 ICE ou ICE légèrement dégénérés et 144 IME. Tous ces éléments ont été délimités, ce qui nous a permis de déterminer leur spécificité d’intégration dans les génomes. Au total, 17 spécificités d’intégration ont été identifiées pour les ICE dont 8 encore jamais décrites (ftsK, guaA, lysS, mutT, rpmG, rpsI, traG and ybaB/EbfC) et 18 spécificités pour les IME dont seulement 5 étaient connues chez les firmicutes. Les modules d’intégration des ICE codent soit une intégrase à tyrosine pouvant avoir une faible spécificité (1 famille d’intégrase) ou une forte spécificité (13 spécificités différentes), soit des intégrases à sérine seule ou en triplet (4 spécificités différentes), soit une transposase à DDE. Les IME codent soit des intégrases à tyrosine (10 spécificités différentes) soit des intégrases à serine seule (8 spécificités différentes). Les ICE ont été groupés en 7 familles distinctes selon les protéines codées par leur module de conjugaison. Les IME présentaient une très forte diversité au sein de leur module de mobilisation, empêchant ainsi leur regroupement en famille selon les gènes portés par ce module. Les analyses phylogénétiques des protéines signature codées par tous les ICE et les IME ont montré des échanges de modules d’intégration entre les ICE et les IME et de nombreux échanges entre les modules de mobilisation des IME. L’ensemble de ces résultats révèle la forte prévalence et l’extrême diversité des ICE et des IME au sein des génomes de streptocoques. Une meilleure connaissance et compréhension de ces éléments nous a incité à construire un outil informatique semi-automatisé de détection des ICE et des IME de Streptocoques ainsi que leurs sites d’insertion / Mobile genetic elements largely contribute to the evolution and diversity of bacterial genomes through horizontal gene transfer. Among them, the integrative and conjugative elements (ICEs) encode their own excision, conjugative transfer and integration. On the other hand, integrative mobilizable elements (IMEs) are autonomous for excision and integration but encode only some of the proteins needed for their conjugative transfer. IMEs therefore need a “helper” conjugative element to transfer. Despite their impact on gene flow and genome dynamics, the prevalence of ICEs remains largely underscored and very few IMEs were identified at the beginning of this study. Furthermore, although several in silico methods exist to detect genomic islands, none are dedicated to ICEs or IMEs, thus complicating exhaustive examination of these mobile elements. The Streptococcus genus belongs to the firmicutes’ phylum. Almost all streptococci are commensal bacteria or pathogenes to men and animals. Two species of Streptococcus are also used in the dairy industry as lactic ferments in order to produce fermented milk and different types of cheese. Studying the gene flux of the Steptococci genus and the impact it can have on the lifestyle of these organisms is essential, as it has a lot of interest for human health and activities. In this work, we searched for ICEs and IMEs in 124 strains of streptococci belonging to 27 species using a reference database of ICE and IME signature proteins (from their conjugation, mobilization and integration/excision modules). This exhaustive analysis led to the identification and delimitation of 131 ICEs or slightly decayed ICEs and 144 IMEs. All these elements were delimited, which allowed us to identify their integration specificities in the genomes. In total, 17 ICE integration specificities were identified. Among them, 8 had never been described before (ftsK, guaA, lysS, mutT, rpmG, rpsI, traG and ybaB/EbfC). 18 specificities were also identified for IMEs, among which only 5 were known for the firmicutes. ICEs encode high or low-specificity tyrosine integrases (13 different specificities), single serine intégrases (1 specificity), triplet of serine integrases (3 different specificities), or DDE transposases while IMEs encode either tyrosine integrases (10 different specificities) or single serine integrases (8 different specificities). ICE were grouped in 7 distinct families according to the proteins encoded by their conjugation module whereas the mobilization modules of IMEs were highly diverse, preventing them from grouping into families according to their mobilization modules. The phylogenetic analysis of the signature proteins encoded by all ICEs and IMEs showed integration module exchanges between ICEs and IMEs and several mobilization module exchanges between IMEs. The overall results reveal a strong prevalence and extreme diversity of these elements among Streptococci genomes. Better understanding and knowledge of ICEs and IMEs prompted us to build a semi-automated command-line tool to identify streptococcal ICEs and IMEs as well as to determine their insertion site

Tendo em vista o importante papel desempenhado pelos Streptococcus mutans e pelos Streptococcus sobrinus na etiologia da cárie dental, assim como a relevância do meio de cultura empregado para a detecção desses microrganismos, os objetivos do presente estudo foram: Capítulo 1- Avaliar a eficácia do meio de cultura SB-20 modificado (SB-20M) na diferenciação morfológica de colônias de S. mutans e de S. sobrinus, comparativamente à análise bioquímica das colônias isoladas, na saliva de crianças; Capítulo 2- Comparar os meios de cultura SB-20, SB-20M e MSB na quantificação (contagem) de unidades formadoras de colônias (ufc) e na diferenciação morfológica e bioquímica de S. mutans e S. sobrinus, na saliva de crianças; e Capítulo 3- Empregar o meio de cultura SB-20M sem ágar, denominado Caldo Sacarose-Bacitracina modificado (CaSaB- 20M), para avaliar a viabilidade de cepas padrão de S. mutans (ATCC25175) in vitro e a viabilidade de estreptococos do grupo mutans in vivo, nas cerdas de escovas dentais, após diferentes períodos de secagem. No Capítulo 1, a eficácia do meio SB-20M foi avaliada tomando-se amostras de saliva não-estimulada de 145 crianças de 6 a 12 anos de idade, por meio da técnica da espátula de madeira. Após semeadura e incubação em microaerofilia, foi efetuada a contagem das ufc em microscópio estereoscópico e realizada a identificação morfológica e bioquímica (biotipagem) das colônias de S. mutans e de S. sobrinus. Os resultados obtidos após as identificações morfológicas e bioquímicas foram comparados empregando o teste x2. No Capítulo 2, a comparação dos meios de cultura SB-20, SB-20M e MSB foi efetuada em amostras de saliva não-estimulada, colhidas de 20 crianças na faixa etária de 4 a 12 anos, em tubos de ensaio. Amostras de saliva pura e diluídas até 10-4 foram semeadas em placas contendo os referidos meios, por meio de um micrométodo, e incubadas em microaerofilia. A seguir, foi efetuada a contagem das ufc e a identificação morfológica e bioquímica das colônias de S. mutans e de S. sobrinus. Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística, utilizando o teste de Wilcoxon e o teste exato de Fisher. No estudo in vitro do Capítulo 3, um total de 45 escovas dentais infantis, divididas em 9 grupos (n=5 por grupo), foram ontaminadas com uma suspensão contendo Streptococcus mutans (cepa ATCC 25175), na concentração de 1.720.000 unidades formadoras de colônias por mL (escala 0,5 de McFarland), durante 4 minutos. Logo após a lavagem, as escovas do Grupo 1 (controle) foram submetidas ao processamento microbiológico. As escovas dos Grupos 2 a 9 foram mantidas à temperatura ambiente por 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60 e 72 horas, respectivamente, previamente ao processamento microbiológico, em meio de cultura CaSaB-20M. A seguir, foi efetuada a contagem de ufc de S. mutans nas cerdas. Os resultados obtidos foram analisados por meio do teste de Kruskal-Wallis. No estudo in vivo do Capítulo 3 participaram 20 crianças de 4 a 8 anos com alto risco à cárie dental. Cada criança recebeu 13 escovações, com intervalo de 3 dias entre cada escovação, empregando sempre uma escova dental nova, sem dentifrício. As 260 escovas obtidas foram divididas em 13 grupos (n=20 por grupo). Logo após a lavagem, as escovas do Grupo 1 (controle) foram submetidas ao processamento microbiológico. As escovas dos Grupos 2 a 13 foram mantidas à temperatura ambiente por 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 e 48 horas, respectivamente, previamente ao processamento microbiológico, ou seja, semeadura e incubação em meio CasB-20M. Após a incubação foi efetuada a contagem de ufc de S. mutans e a quantificação dos polissacarídeos extracelulares presentes nas cerdas. Os dados obtidos foram avaliados por meio do teste de Wilcoxon. O nível de significância em todas as análises estatísticas foi de 5%. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que o método de identificação morfológica, empregando o meio de cultura SB-20M, foi confiável para a identificação de S. mutans e S. sobrinus. Os meios SB-20 e SB-20M foram semelhantes na quantificação de estreptococos do grupo mutans e na identificação morfológica e bioquímica de S. mutans e de S. sobrinus, evidenciando que a ubstituição da sacarose pelo açúcar cristal não alterou a eficácia do meio. Quando comparado ao meio MSB, o SB-20M apresentou resultados estatisticamente superiores, com relação à uantificação de ufc e com relação à identificação morfológica e bioquímica de S. mutans e de S. sobrinus. O Caldo Sacarose-Bacitracina modificado (CaSaB-20M) permitiu avaliar a viabilidade de estreptococos do grupo mutans nas cerdas de escovas dentais, após diferentes períodos de secagem. De acordo com o estudo in vitro com cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175), observou-se viabilidade de microrganismos nas escovas dentais por até 8 horas. Por outro lado, no estudo in vivo, os estreptococos do grupo mutans permaneceram viáveis por períodos superiores (44 horas) / The important role veloped by Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus in dental caries ethyology as well as the relevance of the culture medium used for the detection of these microorganisms, the aims of the present study were divided into three parts as follows: Chapter 1 To evaluate the modified SB-20 culture medium efficacy (SB-20M) in the morphologic differentiation of the S. utans and S. sobrinus colonies comparatively to the biochemical analysis of the isolated colonies in childrens saliva samples; Chapter 2 To compare the culture media SB- 20, SB-20M, and MSB in the quantification (counting) of the colony forming units (cfu), and in the morphological and iochemical differentiation of S. mutans and S. sobrinus in childrens saliva; and Chapter 3 To employ the SB-20M culture medium without agar, called Sucrose Bacitracin Broth Modified (CaSaB-20M), in order to evaluate the viability of the in vitro S. mutans pattern strains (ATCC 25175), and the viability of the in vivo mutans streptococci in toothbrush bristles after different dry periods. In Chapter 1, the efficacy of the SB-20M was evaluated by wood spatula technique using non-stimulated saliva samples of 145 children of 6 to 12 years old. After seeding and incubation in microaerophilic conditions, the cfu counting in stereoscopic microscope, and the morphological and biochemical identification (biotyping) of S. mutans and S. sobrinus colonies were made. The results obtained after morphological and biochemical identifications were compared by the X2 test. In Chapter 2, the comparison of the SB-20, SB-20M, and MSB culture medium was made using assay tubes with non-stimulated saliva samples of 20 children with age between 4 and 12 years old. Samples of pure and diluted saliva (until 10-4) were seeded by a micromethod in Petri dishes with the culture media, and incubated under microaerophilic conditions, followed by the cfu counting, and morphological and biochemical identification of S. mutans and S. sobrinus colonies. The results obtained were submitted to the statistical analysis using Wilcoxon test and the exact Fisher test. In the in vitro study of the Chapter 3, a total of 45 childrens toothbrush divided in 9 groups (n=5 per group) were infected with a Streptococcus mutans (strain ATCC25175) suspension, under the concentration of 1.720.000 colony forming unities by mL (McFarland 0.5 scale) during 4 minutes. Briefly, after washing the Group 1 toothbrushes (control) were submitted to the microbiological processing. Group 2 to 9 toothbrushes were maintained in room temperature for 4, 8, 12, 14, 24, 36, 48, 60, and 72 hours respectively, previously to microbiological processing in CaSaB-20M culture medium. After that, the S. mutans cfu counting in the bristles were made. The results obtained were analysed by KruskalWallis test. In the in vivo study of the Chapter 3, 20 high caries risk children of 4 to 8 years old children have been participated. Each child received 13 times brushing, with intervals of 3 days between each brushing using always a new toothbrush with no toothpaste. The 260 obtained toothbrushes were divided into 13 groups (n=20 per group). After whashing the Group 1 toothbrushes (control) were submitted to microbiological processing. The other ones (groups 2 to 13) were maintained in room temperature for 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, and 48 hours respectively, previously the microbiological processing (CaSaB-20M). After incubation the S. mutans cfu counting and the quantification of extracellular polysaccharides present in the bristles were made. The data obtained were evaluated by Wilcoxon test. The level of significance in all statistical analysis was 5%. Based on the results obtained we could conclude that de morphological method for identification using SB-20M culture medium was trustable for the identification of S. mutans and S. sobrinus. The SB-20 and SB-20M showed the same effect in the quantification of the mutans streptococci, and in the morphological and biochemical identification of S. mutans and S. sobrinus evidentiating that the substitution of sucrose for coarse granular cane sugar (SB-20M) did not altered the efficacy of the medium. When compared to MSB medium, the SB-20M showed results statistically superiors with relation to cfu quantification, and morphological and biochemical of S. mutans and S. sobrinus. Sucrose-Bacitracin modified broth (CaSaB-20M) allowed the evaluation of the viability of mutans streptococci in toothbrush bristles after different drying times. According to the in vitro study with Streptococcus mutans (ATCC 25175), we could observe viability of microorganisms in toothbrush bristles for 8 hours remaining. On the other hand, in the in vivo study the mutans streptococci remain viable for extended periods (44 hours).

Obwohl seit der Einführung des Penicillins ein wirksames Medikament gegen Streptokokken der Lancefield Gruppe A (GAS) existiert, bei welchem bislang keine Resistenzen beschrieben wurden, bleiben GAS-Infektionen auch heute noch ein großes gesundheitspolitisches Problem, das sowohl die Morbidität als auch die Mortalität der Menschen weltweit beeinflusst. GAS können ein breites Spektrum an Erkrankungen beim Menschen verursachen. Dazu zählen nicht nur unkomplizierte Racheninfektionen mit und ohne Scharlach oder Hautinfektionen wie Erysipel oder Impetigo, sondern auch invasive sowie Folgeerkrankungen. 1928 wurde als Typ-spezifische, Antikörperbildung-induzierende Substanz das M-Protein beschrieben, welches durch das emm-Gen kodiert und seither zur Beschreibung der Epidemiologie von GAS verwendet wird. Eine der Hauptfunktionen des auf der Oberfläche von GAS verankerten M-Proteins besteht darin, die Phagozytose durch polymorphkernige Leukozyten zu verhindern, was zu den wichtigsten Abwehrmechanismen von Infektionen mit GAS gezählt wird. Obwohl seit einigen Jahrzehnten große Anstrengungen unternommen wurden, bleibt ein sicherer und effektiver Impfstoff bisher ein unerreichtes Ziel. In der hier vorliegenden Studie wurde, anhand der über den Zeitraum vom 11.03.2006 bis 19.05.2012 am Universitätsklinikum Freiburg gesammelten Daten und Isolaten, die regionale Epidemiologie von Infektionen pädiatrischer Patienten durch GAS retrospektiv untersucht. Mit insgesamt 566 Isolaten und zugehörigen klinischen Daten stellt diese Studie die bisher größte unizentrische epidemiologische Untersuchung von pädiatrischen Erkrankungen mit emm-Typisierung von GAS in Deutschland dar. Dabei wurde besonders auf Zusammenhänge zwischen den molekularepidemiologischen Daten, basierend auf der emm-Typisierung, und den anonymisierten klinischen Informationen eingegangen. In die Kohorte konnten insgesamt 566 Fälle eingeschlossen werden. Bei 405 Fällen wurde eine Racheninfektion festgestellt, wovon bei wiederum 75 Fällen zusätzlich die Diagnose Scharlach gestellt wurde, 34 Kinder stellten sich mit einer Hautinfektion vor, 21 mit einer akuten Otitis media, 19 mit einer anogenitalen Infektion, acht mit einer invasiven Infektion und zwei mit einer Harnwegsinfektion. Als Kolonisation durch GAS ohne Krankheitswert wurden 77 Fälle gewertet, davon 48 mit pharyngealer Kolonisation. In der molekularepidemiologischen Untersuchung konnten drei neue emm-subtypen entdeckt werden, welche als emm29.13, emm36.7 sowie emm75.5 erstbeschrieben und deren Sequenzen in der Datenbank des CDC hinterlegt wurden. Über die gesamte Kohorte hinweg wurde Typ emm12 bei 19% aller Fälle gefunden und lag somit am häufigsten vor, gefolgt von emm1 und emm4 mit je 14% sowie emm28 und emm89 mit je 11%. Bei Betrachtung der emm-Cluster zeigte sich E4 mit 31% am häufigsten, danach folgten Cluster A-C4 mit 19%, A-C3 und E1 mit jeweils 14%. Unter den 405 Fällen mit GAS-Tonsillopharyngitis lag emm12 mit knapp 20% am häufigsten vor, gefolgt von emm4 mit 15%, emm1 mit 14%, emm89 mit 13% und emm28 sowie emm3 mit je 9%. Hinsichtlich der Cluster wurde E4 dort mit knapp 30% am häufigsten festgestellt, gefolgt von A-C4 mit 20%, E1 mit 15%und A-C3 mit 14%. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass sich die emm-Typ- sowie die emm-Cluster-Epidemiologie in Abhängigkeit von der klinischen Manifestation unterscheidet. Auch wenn sich die Verteilungen grundsätzlich ähnelten, traten emm4 bzw. die Cluster A-C5 und E1 bei Patienten mit Tonsillopharyngitis mit Scharlach auch nach Bonferroni-Korrektur signifikant häufiger auf als bei solchen mit Tonsillopharyngitis ohne Scharlach. Erste Hinweise hierfür wurden im Rahmen dieser Arbeit in einer Vorabauswertung zu dieser Kohorte 2013 erstmals beschrieben und durch Ergebnisse folgender, internationaler Studien gestützt. Bei anogenitalen Infektionen wurde in knapp 80% der Fälle Cluster E4 und in 58% emm28 festgestellt, so-dass hier ein deutlich eingeengtes Erregerspektrum vorlag. Verglichen zu allen Fällen mit Tonsillopharyngitis wurden bei anogenitaler Infektion Typ emm28 und Cluster E4 signifikant häufiger isoliert. Für Hautinfektionen konnte kein signifikanter Unterschied der emm-Typ-Verteilung im Vergleich zu Racheninfektionen insgesamt gefunden werden. Es zeigte sich jedoch Cluster E4 signifikant häufiger bei Patienten mit einer Hautinfektion als bei solchen mit Scharlach. Insgesamt zeigte sich im konkreten Vergleich zu einer französischen Studie eine weitgehende Übereinstimmung hinsichtlich der Epidemiologie der emm-Typen und -Cluster, jedoch auch einzelne Differenzen. Diese Unterschiede waren signifikant für emm6 und emm22, ebenso wie für Cluster M6. Weiterhin bestätigte unter anderen die Studie von d´Humieres et al. die Häufung von emm4 bei Scharlach-Patienten, was die Aussage der vorgelegten Ergebnisse unter-streicht. Weiterhin wurde zur Untersuchung der longitudinalen Entwicklung der emm-Typen und emm-Cluster die Verteilung des Zeitraumes vom 01.04.2006 und 31.03.2007 mit dem vom 01.05.2011 bis 30.04.2012 verglichen. Zumindest für den vergleichsweise kurzen zeitlichen Abstand konnten nach Adjustierung keine signifikanten Veränderungen der Epidemiologie hinsichtlich einzelner emm-Typen bzw. -Cluster beobachtet werden. In bisherigen Studien wurde die Pathogenität eines Stammes meist anhand des klinischen Erscheinungsbildes bestimmt. In dieser Studie wurde weiterführend untersucht, inwiefern sich einzelne emm-Typen bzw. emm-Cluster auch in quantitativ messbaren Parametern wie u.a. dem C-reaktiven Protein (CRP) sowie der Leukozytenzahl im Blut unterscheiden. Bei Patienten mit Tonsillopharyngitis zeigte sich lediglich Cluster E4 signifikant häufiger mit einem CRP-Wert über 35 mg/l assoziiert. Für die Leukozytenzahl war ein solcher Zusammenhang dagegen nicht nachweisbar. Da die verwendeten Analysen jedoch Störfaktoren unterlagen und ein Kausalzusammenhang zwischen der Pathogenität des Erregers und der Auslenkung der ge-nannten Parameter im Rahmen des Studiendesigns nicht bewiesen werden konnte, lassen diese Ergebnisse keine abschließende Beurteilung zu. Der bereits entwickelte 30-valente Impfstoff zeigte anhand der enthaltenen M-Antigene eine gute Übereinstimmung mit den in dieser Studie gefundenen emm-Typen. Dabei waren die Antigene von 19 der 25 in dieser Studie registrierten emm-Typen in dem Impfstoff enthalten, was jedoch unter Berücksichtigung der Kreuzreaktivitäts-Hypothese für emm-Cluster zu einem Deckungsgrad von 99,8% aller untersuchten Fälle (565 von 566) führt. Insgesamt erwies sich der unizentrische Charakter der hier vorgelegten Studie in gewisser Hinsicht als Vorteil gegenüber multizentrischen Studien, da hierdurch zu bestimmten Fragen Informationen ohne den Einfluss regionaler Besonderheiten ausgewertet werden konnten. Inwiefern regionale Prävalenzen einzelner emm-Typen oder deren Pathogenitätspotential ent-scheidend für die Epidemiologie insbesondere invasiver Infektionen sind, kann anhand dieser Studie nicht abschließend beurteilt werden. Zur näheren Untersuchung dieses Sachverhaltes wären weiterführende Studien in größerem Maßstab notwendig. Zusammenfassend wurde mit dieser Arbeit eine umfassende epidemiologische Untersuchung anhand der molekularepidemiologischen Erregeranalyse unter Einschluss klinischer Aspekte an einer großen pädiatrischen Kohorte durchgeführt. Die gewonnenen Erkenntnisse leisten einen Beitrag zur Aufklärung der regionalen wie auch internationalen Epidemiologie von GAS und bieten wichtige Grundlagen sowie Ansätze für nachfolgende Untersuchungen, insbesondere für die Impfstoffentwicklung gegen GAS.:1 Einleitung 7 2 Theoretische Grundlagen 8 2.1 Epidemiologie 8 2.2 Taxonomie 10 2.3 Infektionspathologie 11 2.4 Aufbau des M-Proteins 14 2.5 Die Bedeutung des M-Proteins 16 2.6 emm-Genetik 18 2.7 Therapie und Prophylaxe 20 3 Ziele der Studie 22 4 Patienten, Material und Methoden 23 4.1 Mikrobiologische Isolate und klinische Daten 23 4.1.1 „Klinische Krankheitsbilder“ 25 4.1.2 Modifizierter Centor-Score 26 4.1.3 Grunderkrankungen 27 4.1.4 Paraklinik 27 4.2 Geräte und Materialien 29 4.2.1 Geräte und Hilfsmittel 29 4.2.2 Verbrauchsmaterialien 30 4.2.3 Molekulare Diagnostiksysteme 31 4.2.4 Primer für PCR und Sequenzierung 31 4.2.5 Medien und Lösungen 31 4.3 Mikrobiologische Methoden 32 4.3.1 Mikrobiologische Proben 32 4.3.2 Kultur von GAS 32 4.3.3 Latex-Agglutinationstest auf Gruppe A Antigen 33 4.3.4 Kryokonservierung der Isolate 34 4.4 Molekulargenetische Methoden 35 4.4.1 DNA-Isolierung 35 4.4.2 Photometrische Bestimmung der DNS-Konzentration und Einstellung 36 4.4.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 37 4.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 37 4.4.5 DNA Sequenzierung 39 4.4.6 Sequenz-basierte Typisierung 41 4.5 Statistische Auswertung 42 5 Ergebnisse 43 5.1 Ausgewertete mikrobiologische Proben und retrospektive Daten 43 5.2 Analyse der Kohorte 45 5.2.1 Analyse der Altersverteilung 45 5.2.2 Analyse der Geschlechtsverteilung 48 5.2.3 Analyse der saisonalen Verteilung 49 5.2.4 Analyse der klinischen Symptome 51 5.2.5 Analyse von Vorerkrankungen und Versorgungsform 55 5.3 Laborbefunde 58 5.3.1 Analyse der semiquantitativen Wachstumsdichte der Abstrich-Kulturen 58 5.3.2 Blutparameter: C-Reaktives Protein (CRP) 59 5.3.3 Blutparameter: Leukozytenzahl 59 5.4 Molekulare Epidemiologie des emm-Typs 60 5.5 Erstbeschreibung neuer emm-Subtypen 60 5.6 emm-Typ- bzw. Cluster-Verteilung und klinische Manifestation 61 5.6.1 emm-Verteilung bei Tonsillopharyngitis 61 5.6.2 emm-Verteilung bei akuter Otitis media (AOM) 63 5.6.3 emm-Verteilung bei Hautinfektionen 64 5.6.4 emm-Verteilung bei anogenitalen Infektionen 65 5.6.5 emm-Verteilung bei invasiven Infektionen 68 5.6.6 emm-Verteilung bei asymptomatischer Rachen-Kolonisierung 68 5.7 Analyse der Altersverteilung für emm-Typen und -Cluster 70 5.8 Infektionsparameter und Korrelation zur molekularen Epidemiologie 71 5.8.1 Temperatur: 71 5.8.2 CRP: 72 5.8.3 Leukozytenzahl: 73 5.9 Patienten mit wiederholten Vorstellungen 73 5.9.1 Antibiotische Therapie 75 5.10 Resistenzlage 76 5.11 Analyse der molekularen Epidemiologie über der Zeit 78 6 Diskussion 80 6.1 Vorbemerkung 80 6.2 Kohorte 81 6.2.1 Alter 81 6.2.2 Geschlecht 82 6.2.3 Jahreszeit 82 6.2.4 Vorerkrankungen 83 6.2.5 Klinische Symptome 84 6.2.6 Diagnostischer Wert der semiquantitativen Wachstumsdichte 85 6.2.7 Rezidive 85 6.3 emm-Typ und –Cluster-Epidemiologie 86 6.3.1 emm-Typen und -Cluster bei Tonsillopharyngitis 86 6.3.2 emm-Typen und –Cluster bei Anogenitalinfektionen 86 6.3.3 emm-Typen und -Cluster bei invasiven Infektionen 87 6.3.4 emm-Typ und -Cluster-Epidemiologie im Vergleich zu anderen Studien 87 6.3.5 Longitudinale Betrachtung der emm-Typ-Epidemiologie 91 6.3.6 Vergleich der emm-Typen und Cluster-hinsichtlich des Alters der Patienten 92 6.3.7 emm-Typen und -Cluster hinsichtlich Infektionsparametern 92 6.3.8 Deckungsgrad mit 30-valentem M-Protein-basiertem GAS-Impfstoff 95 6.3.9 emm-Typ / -Cluster – Antibiotika-Resistenz 96 6.4 Ausblick 97 7 Zusammenfassung 98 8 Summary 101 9 Anhang 104 10 Abbildungsverzeichnis 112 11 Tabellenverzeichnis 114 12 Abkürzungsverzeichnis 116 13 Literaturverzeichnis 118 14 Anlage 1 127 15 Anlage 2 129 16 Danksagung 131 / Although - since the introduction of penicillin - there has been an effective drug against strep-tococci of Lancefield Group A (GAS), in which no resistance has been described so far, GAS infections remain a major healthcare policy problem, which affects both morbidity and mortality of people worldwide. GAS can cause a wide range of disorders in humans. These include un-complicated pharyngeal infections with and without scarlet fever as well as skin infections such as erysipelas or impetigo but also invasive as well as secondary complications. In 1928, the M-protein encoded by the emm gene was described as a type-specific, antibody -inducing substance and has since been used to characterize the epidemiology of GAS. One of the main functions of the M protein, anchored on the surface of GAS, is to evade phagocytosis by polymorphonuclear leukocytes, which is one of the most important defense mechanisms against infections by GAS. Although major efforts have been made for several decades, a safe and effective vaccine remains an unreached goal. In this study, the regional epidemiology of infections of pediatric patients by GAS was retro-spectively investigated on the basis of data and isolates collected from 11.03.2006 to 19.05.2012 at the University Medical Center in Freiburg. With a total of 566 isolates and asso-ciated clinical data, the present study provides the largest uni-centric epidemiological study of pediatric diseases with emm-typing of GAS so far in Germany. Particular attention was paid to associations between molecular epidemiology, based on emm-typing, and anonymized clinical data. The total cohort included 566 cases, thereof 405 cases of pharyngeal infection, 75 of which were additionally diagnosed with scarlet fever, 34 children presented with a skin infection, 21 with an acute otitis media, 19 with an anogenital infection, eight with an invasive infection and two with an urinary tract infection. In 77 cases colonization by GAS was estimated as having no clinical relevance of those 48 isolates were isolated from pharyngeal swabs. In the molecular investigation, three new emm subtypes were discovered which were first de-scribed as emm29.13, emm36.7 as well as emm75.5. These sequences were entered into the database of the CDC. Over the entire cohort, emm12 was found in 19% of all cases and was thus the most frequent, followed by emm1 and emm4, with 14% each, emm28 and emm89, with 11% each. When considering emm-clusters, E4 was the most frequent with 31%, followed by cluster A-C4 with 19%, A-C3 and E1 with 14%. Among the 405 cases with GAS-related pharyngeal infection, emm12 was the most common with almost 20%, followed by emm4 with 15%, emm1 with 14%, emm89 with 13% and emm28 as well as emm3 with 9% each. With respect to the clus-ters, E4 was found to be the most common with around 30%, followed by A-C4 with 20%, E1 with 15% and A-C3 with 14%. In the present study it was shown that emm-types as well as emm-clusters differed depending on the clinical manifestation. Although the distributions were basically similar, emm4 as well as clusters A-C5 and E1 were significantly more common in patients with tonsillopharyngitis and scarlet fever, even after Bonferroni correction, than those with tonsillopharyngitis but without the diagnosis of scarlet fever. These findings were first described in a preliminary evaluation of this cohort in 2013 and supported by the results of consecutively published international stud-ies. In anogenital infections, cluster E4 was found in almost 80% and emm28 in 58%, indicat-ing a clearly narrowed spectrum. Compared to cases with tonsillopharygitis, emm28 and clus-ter E4 were significantly more frequently isolated in anogenital infections. For skin infections no significant difference could be found in the emm-distribution compared to tonsillopharyngi-tis. However, cluster E4 was found to be significantly more common in patients with a skin infection than in those with scarlet fever. Overall, in a direct comparison to a French study, there was a wide agreement regarding the epidemiology of emm-types and -clusters, but also some differences. These differences were significant for emm6, emm22, as well as for cluster M6. Furthermore, among others, the study by d´Humieres et al. confirmed the accumulation of emm4 in scarlet fever patients, which un-derlines the statement of the presented results. Furthermore, in order to investigate the longitudinal development of emm-types and emm-clusters, the distribution in the period from 01.04.2006 to 31.03.2007 was compared to that from 01.05.2011 to 30.04.2012. At least for the comparatively short period, no significant changes in the epidemiology of individual emm-types or -clusters could have been observed after adjusting the p-values. In previous studies, the pathogenicity of a strain was determined by its association to the clini-cal picture. In addition, this study investigated the extent to which individual emm-types or emm-clusters also differed in quantitatively measurable parameters such as the C-reactive protein (CRP) and the leukocyte count in the blood. In cases of tonsillopharyngitis, cluster E4 was found significantly associated with a CRP value above 35 mg/l. For the leukocyte count such a difference was not detectable. However, since the values were subject to confounding factors, a causal link between pathogenicity of certain emm-types and the deflection of the mentioned parameters could not be proved within the framework of this study. Therefore, these results do not allow to draw final conclusions. The existing 30-valent M-protein based vaccine would show a good agreement with the corre-sponding emm-types of the cohort used here. The antigens of 19 of the 25 different emm-types registered in this study were included in the vaccination model, which corresponds to a vaccine coverage of 99.8% (565 of 566) of all strains examined here, if cross-reactivity of GAS strains within an emm-cluster was taken into consideration. Overall, the uni-centric character of the study presented here provided in certain aspects an advantage over multi-centric studies, as differences and similarities between different clinical pictures, excluding regional differences as well as comprehensive clinical information on the cases, could be emphasized. The extent to which regional prevalence of individual emm-types or their pathogenicity potential are decisive for the epidemiology of invasive infections could not be conclusively assessed by this study. For a closer look at this issue, further studies on a larger scale would be necessary. In summary, this work presents a comprehensive epidemiological investigation on molecular epidemiologic pathogen analysis including clinical aspects in a large pediatric cohort. The find-ings contribute to the elucidation of the regional an international epidemiology of GAS and pro-vide important basics as well as approaches for subsequent investigations, especially for vac-cine development against GAS.:1 Einleitung 7 2 Theoretische Grundlagen 8 2.1 Epidemiologie 8 2.2 Taxonomie 10 2.3 Infektionspathologie 11 2.4 Aufbau des M-Proteins 14 2.5 Die Bedeutung des M-Proteins 16 2.6 emm-Genetik 18 2.7 Therapie und Prophylaxe 20 3 Ziele der Studie 22 4 Patienten, Material und Methoden 23 4.1 Mikrobiologische Isolate und klinische Daten 23 4.1.1 „Klinische Krankheitsbilder“ 25 4.1.2 Modifizierter Centor-Score 26 4.1.3 Grunderkrankungen 27 4.1.4 Paraklinik 27 4.2 Geräte und Materialien 29 4.2.1 Geräte und Hilfsmittel 29 4.2.2 Verbrauchsmaterialien 30 4.2.3 Molekulare Diagnostiksysteme 31 4.2.4 Primer für PCR und Sequenzierung 31 4.2.5 Medien und Lösungen 31 4.3 Mikrobiologische Methoden 32 4.3.1 Mikrobiologische Proben 32 4.3.2 Kultur von GAS 32 4.3.3 Latex-Agglutinationstest auf Gruppe A Antigen 33 4.3.4 Kryokonservierung der Isolate 34 4.4 Molekulargenetische Methoden 35 4.4.1 DNA-Isolierung 35 4.4.2 Photometrische Bestimmung der DNS-Konzentration und Einstellung 36 4.4.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 37 4.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 37 4.4.5 DNA Sequenzierung 39 4.4.6 Sequenz-basierte Typisierung 41 4.5 Statistische Auswertung 42 5 Ergebnisse 43 5.1 Ausgewertete mikrobiologische Proben und retrospektive Daten 43 5.2 Analyse der Kohorte 45 5.2.1 Analyse der Altersverteilung 45 5.2.2 Analyse der Geschlechtsverteilung 48 5.2.3 Analyse der saisonalen Verteilung 49 5.2.4 Analyse der klinischen Symptome 51 5.2.5 Analyse von Vorerkrankungen und Versorgungsform 55 5.3 Laborbefunde 58 5.3.1 Analyse der semiquantitativen Wachstumsdichte der Abstrich-Kulturen 58 5.3.2 Blutparameter: C-Reaktives Protein (CRP) 59 5.3.3 Blutparameter: Leukozytenzahl 59 5.4 Molekulare Epidemiologie des emm-Typs 60 5.5 Erstbeschreibung neuer emm-Subtypen 60 5.6 emm-Typ- bzw. Cluster-Verteilung und klinische Manifestation 61 5.6.1 emm-Verteilung bei Tonsillopharyngitis 61 5.6.2 emm-Verteilung bei akuter Otitis media (AOM) 63 5.6.3 emm-Verteilung bei Hautinfektionen 64 5.6.4 emm-Verteilung bei anogenitalen Infektionen 65 5.6.5 emm-Verteilung bei invasiven Infektionen 68 5.6.6 emm-Verteilung bei asymptomatischer Rachen-Kolonisierung 68 5.7 Analyse der Altersverteilung für emm-Typen und -Cluster 70 5.8 Infektionsparameter und Korrelation zur molekularen Epidemiologie 71 5.8.1 Temperatur: 71 5.8.2 CRP: 72 5.8.3 Leukozytenzahl: 73 5.9 Patienten mit wiederholten Vorstellungen 73 5.9.1 Antibiotische Therapie 75 5.10 Resistenzlage 76 5.11 Analyse der molekularen Epidemiologie über der Zeit 78 6 Diskussion 80 6.1 Vorbemerkung 80 6.2 Kohorte 81 6.2.1 Alter 81 6.2.2 Geschlecht 82 6.2.3 Jahreszeit 82 6.2.4 Vorerkrankungen 83 6.2.5 Klinische Symptome 84 6.2.6 Diagnostischer Wert der semiquantitativen Wachstumsdichte 85 6.2.7 Rezidive 85 6.3 emm-Typ und –Cluster-Epidemiologie 86 6.3.1 emm-Typen und -Cluster bei Tonsillopharyngitis 86 6.3.2 emm-Typen und –Cluster bei Anogenitalinfektionen 86 6.3.3 emm-Typen und -Cluster bei invasiven Infektionen 87 6.3.4 emm-Typ und -Cluster-Epidemiologie im Vergleich zu anderen Studien 87 6.3.5 Longitudinale Betrachtung der emm-Typ-Epidemiologie 91 6.3.6 Vergleich der emm-Typen und Cluster-hinsichtlich des Alters der Patienten 92 6.3.7 emm-Typen und -Cluster hinsichtlich Infektionsparametern 92 6.3.8 Deckungsgrad mit 30-valentem M-Protein-basiertem GAS-Impfstoff 95 6.3.9 emm-Typ / -Cluster – Antibiotika-Resistenz 96 6.4 Ausblick 97 7 Zusammenfassung 98 8 Summary 101 9 Anhang 104 10 Abbildungsverzeichnis 112 11 Tabellenverzeichnis 114 12 Abkürzungsverzeichnis 116 13 Literaturverzeichnis 118 14 Anlage 1 127 15 Anlage 2 129 16 Danksagung 131