Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les carbohydrates sont des composés importants au niveau biologique. De nombreux analogues contenant un hétéroatome autre que l'oxygène sur le cycle hémiacétallique existent dans la nature et ont fait l'objet de nombreuses synthèses dans de nombreux groupes de recherche depuis près de 40 ans. Cependant les hétéroatomes présents sur le cycle hémiacétallique sont essentiellement les atomes d'azote et de soufre et il existe peu de carbohydrates contenant la liaison carbone-phosphore. Quant aux analogues concernant le remplacement du carbone anomérique par un hétéroatome, ils sont très peu nombreux. Nous avons synthétisé un nouveau type d'analogue les phostones. Les phostones sont des analogues de carbohydrates où le carbone anomérique est remplacé par un atome de phosphore pentacovalent. Nous avons synthétisé différents analogues dans quatre projets. Notre premier projet concerne la synthèse des L-fucophostones, des analogues du L-fucose. Plusieurs oligosaccharides présents à la surface des cellules contiennent une unité L-fucose. Ces oligosaccharides sont aussi communs à de nombreux cancers dont ceux du foie, de l'ovaire et du sein. La modification de son carbone anomérique pourrait mener à une activité inhibitrice sur les enzymes concernées par le L-fucose tel que les fucosidases et les fucosyltransférases. Nous avons utilisé le L-fucose comme produit de départ afin de conserver au maximum sa stéréochimie. Quant aux N-acétyl-D-glucosaminophostone et N-acétyl-D-mannosaminophostone, elles sont des analogues des N-acétyl-D-glucosamine et N-acétyl-D-mannosamine. Ces saccharides sont des composants essentiels de nombreuses glycoprotéines. Ces glycoprotéines sont une classe de produits naturels jouant un rôle crucial dans les phénomènes de reconnaissance moléculaire. Nous avons pu effectuer pour la première fois la réaction d'Abramov sur une oxime, ce qui a généré les phosphonates cycliques avec une fonction alkoxy amine en a du phosphore. Le troisième projet concerne le phosphoramidon qui est un puissant inhibiteur d'une métalloprotéase à zinc jouant un rôle particulièrement important au niveau des cellules endothéliales, l'enzyme de conversion de l'endothéline (ECE). Cette enzyme est impliquée dans la régulation du flux sanguin et son dérèglement est reconnu comme un important facteur déclenchant dans de nombreuses maladies. L'analogue en phostone du phosphoramidon modifie la structure du phosphoramidon en incorporant la fonction phosphonamide à l'intérieur du L-rhamnose et en supprimant la fonction acide phosphonique. En dépit des progrès considérables faits dans la compréhension du mécanisme d'action et de la biologie du virus de la grippe, celui-ci continue d'être la plus importante cause de mortalité au niveau des maladies respiratoires. Le mécanisme unique de propagation du virus de la grippe a permis aux chercheurs d'identifier un certain nombre de cibles potentielles dont l'hémagglutinine et la neuraminidase, les deux glycoprotéines de surface les plus importantes impliquées dans la propagation du virus. L'activité enzymatique des neuraminidases repose sur la coupure du lien a.2,3 entre l'acide sialique et le carbohydrate auquel il est lié. Dans ce dernier projet, nous avons synthétisé les sialophostones, des analogues de l'acide sialique où l'action de l'acide carboxylique et de l'hydroxyle anomérique est remplacé par un acide phosphonique.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L’objectif de ces travaux de thèse était de rechercher un potentiel effet inhibiteur de l’acide acétique endogène sur le métabolisme oxydo réductif de Saccharomyces cerevisiae, afin d’évaluer la pertinence d’une stratégie d’amélioration des capacités de production d’éthanol par la modulation de la synthèse de cet acide. Ces travaux devaient également permettre d’approfondir la compréhension des principaux facteurs commandant la synthèse de l’acide acétique et plus largement des acides organiques. La stratégie de modulation de la synthèse d’acide acétique mise en place reposait sur des approches microbiologique et génétique, consistant en l’ajout d’acide oléique et / ou de carnitine dans le milieu de culture ainsi que la surexpression du gène CIT2 ou la suppression du gène ALD6.Cette démarche a permis de montrer que, contrairement à la version exogène, l’acide acétique endogène ne présentait pas d’effet inhibiteur du métabolisme oxydo réductif de Saccharomyces cerevisiae ou qu’il était négligeable par rapport au stress éthanol. En outre, la modulation de la production de cet acide ne semble pas être une stratégie envisageable en vue de l’amélioration des capacités de production d’éthanol de cette levure, bien qu’une corrélation ait été observée entre les titres finaux de ces deux molécules.En outre, il a été montré que l’isoforme 6 de l’acétaldéhyde déshydrogénase (Ald6p) était essentiel pour assurer la croissance cellulaire normale ainsi que les mécanismes de résistance au stress éthanol dans ces conditions de culture. Plus largement, l’interrelation entre les différents isoformes ne paraissait pas aussi flexible qu’en anaérobiose. Saccharomyces cerevisiae semblait également présenter un métabolisme flexible en réponse à une modulation de la synthèse d’acide acétique. La voie des pentoses phosphates serait ainsi capable de prendre le relais de l’Ald6p pour assurer la régénération du NADPH cytosolique, bien que le flux à travers cette voie semble avoir été limité par le ratio NADP+ / NADPH. Enfin, les cellules paraissaient capables de réguler la synthèse de l’acétyl coA à partir d’acide acétique en réaction à une évolution des besoins anaboliques lors de la fin de la phase de croissance. Elles seraient toutefois incapables de pallier le manque d’acétyl coA suite à la suppression du gène ALD6. La modulation de la synthèse des acides pyruvique et succinique a également fait l’objet de discussions. / The aim of this work was to investigate a potential inhibitory effect of endogenous acetic acid on the oxido-reductive metabolism of Saccharomyces cerevisiae, to assess the relevance of a strategy based of the modulation of the synthesis of this acid, to improve ethanol production capacities. This work should also help to broaden the understanding of the main factors controlling the synthesis of acetic acid, and more generally organic acids. The strategy to modulate the synthesis of acetic acid was based on microbiological and genetic approaches, consisting in the addition of oleic acid and / or carnitine in the medium as well as the overexpression of the gene CIT2 or the deletion of the gene ALD6.This approach has shown that, contrary to exogenous version, endogenous acetic acid did not induce inhibitory effects on the oxido-reductive metabolism of Saccharomyces cerevisiae, or was negligible compared to stress caused by ethanol. Moreover, the modulation of the synthesis of this acid appear to be not an attractive strategy to improve ethanol production capacities of the yeast, although a correlation was observed between the end-culture titer of these two molecules.In addition, it has been shown that the isoform 6 of acetaldehyde dehydrogenase (Ald6p) was essential to ensure regular growth and mechanisms of ethanol stress resistance under these conditions of culture. More broadly, the interrelation between the different isoforms did not seem as flexible as under anaerobic conditions. Saccharomyces cerevisiae also seemed to have a flexible metabolism in response to a modulation of the synthesis of acetic acid. The pentose-phosphate way would be able to take over from Ald6p for regeneration of cytosolic NADPH, although the ratio NADP+ / NADPH seemed to lessen the flux through this pathway. Finally, the cells appeared to be able to regulate the synthesis of acetyl-CoA from acetic acid in response to changing in anabolic needs at the end of the growth phase. However, yeasts would be unable to overcome the lack of acetyl-CoA following the suppression of the gene ALD6. The modulation of the synthesis of pyruvic and succinic acids has also been discussed.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Au-delà de sa présence sur les microtubules stables, l'acétylation de l’-tubuline peut être augmentée après exposition des cellules aux UV ou après une carence en nutriments, phénomène que l’on appelle « hyperacétylation ». Cependant, le mécanisme d’induction de cette hyperacétylation est encore inconnu. Dans cette étude, nous montrons que l’hyperacétylation de la tubuline est une réponse générale aux stress cellulaire, et nous avons cherché à caractériser cette réponse, à identifier la voie de signalisation activée par le stress et conduisant à cette réponse, et à étudier la signification biologique de ce phénomène rapide et réversible. Nous avons trouvé que MEC-17/-TAT1, l’acétyltransférease majeure de l’ tubuline, est une enzyme nécessaire à l’induction de l’hyperacétylation en réponse aux stress, et qu'elle est régulée, à l’état basal par une autre acétyltransférase appelée p300. Au cours du stress, nous montrons que l'augmentation de la production des espèces réactives de l'oxygène (ROS), conduit à l'activation de la kinase « AMP-activated protein kinase (AMPK) », qui, à son tour provoque la phosphorylation de MEC-17, et probablement son activation. Enfin, nous montrons que l’hyperacétylation de la tubuline induite par le stress, participe à la survie des cellules dans des conditions de stress et à l'induction de l'autophagie de survie. / Beyond its presence in stable microtubules, -tubulin acetylation can be boosted after UV exposure or after nutrient deprivation but the mechanisms of this hyperacetylation are still unknown. In this study, we show that tubulin hyperacetylation is a general cell stress response, and aimed to characterize this response, to identify the stress-activated signaling pathway leading to its induction and the biological significance of this rapid and reversible phenomenon. We found that the major tubulin acetyltransferase MEC-17/-TAT1 is the main enzyme required for mediating tubulin hyperacetylation upon stress, and that it is regulated under normal conditions by the acetyltransferase p300. Upon stress, we show that the increased production of reactive oxygen species (ROS), leads to the activation of AMP-activated protein kinase (AMPK), which in turn mediates MEC-17 phosphorylation, and probably its subsequent activation. Finally, we show that tubulin hyperacetylation induced upon stress participate in cell survival under stress conditions and in the induction of protective autophagy.

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Les travaux de cette thèse portent sur le développement d'une méthodologie permettant le passage au continu d'une production de cristaux d'un principe actif pharmaceutique : l'acétyl-L- leucine. Le travail est centré sur l'étape de précipitation et ses interactions avec les procédés en aval de filtration / lavage et séchage. La démarche adoptée fut donc d'abord d'acquérir un ensemble de données analytiques et thermodynamiques sur les produits, sous-produits et cristaux. L'impact de plusieurs paramètres opératoires sur la solubilité du produit fut ainsi mis en évidence. D'autre part, on a montré que l'acétyl-DL- eucine cristallise sous la forme d'un conglomérat. Des études ont ensuite été réalisées sur les procédés en discontinu, notamment sur les étapes de précipitation et de lavages, afin d'identifier les paramètres permettant de contrôler au mieux la qualité finale des cristaux. Enfin, à partir de ces résultats, des essais de précipitation en continu ont pu être réalisés à l'échelle du laboratoire, puis à l'échelle industrielle sur l'ensemble de la chaîne de production du principe actif. / This study deals with the development of a methodology allowing to transform a batch precipitation process in a continuous one. The active substance considered is acetyl-L-leucine. The work is focused on the precipitation step but also considers the interactions with the downstream processes of filtration, washing and drying. In a first part, characterization methods of pure and impure solutions of active substance were developed as well as methods for determining the crystals properties (purity, size, size distribution, shape, ...). Then the solubility of the product was investigated and the influence of parameters such as temperature, pH, impurity concentration, was studied. The crystallization mode of the racemic mixtures was also determined . Finally, batch crystallization was carried out at the laboratory scale in order to determine nucleation kinetics and to understand the main operating parameters influencing the quality of the crystals. For the applied range of concentrations, the induction time was found very small and indicates that the control of the nucleation step is difficult and depends on the mixing of the reactants. The whole continuous process was finally designed and tested, from the initial reactive to the final dry ZPI powder, in industrial site to validate the feasibility of the continuous process

Trypanosoma brucei, parasite protozoaire flagellé appartenant à l’ordre des kinétoplastidés, est responsable de la maladie du sommeil, ou trypanosomiase humaine africaine (THA). Son cycle de vie fait intervenir un insecte vecteur hématophage (la mouche tsé-tsé ou glossine) qui lors d’un repas sanguin sur un individu infecté ingère des parasites. Après plusieurs étapes de différentiation, les parasites sont injectés à un hôte lors d’un autre repas sanguin. Nous avons étudié le métabolisme intermédiaire et énergétique de la forme procyclique de T. brucei, forme présente dans l’appareil digestif de l’insecte vecteur. Chez ce parasite, la dégradation du glucose aboutit à la production d’acétate dans l’unique mitochondrie, et de succinate dans la mitochondrie et les glycosomes, organelles spécifiques des trypanosomatidés dans lesquels la glycolyse est compartimentalisée. T. brucei utilise une "navette acétate" permettant de transférer l’acétyl-CoA produit dans la mitochondrie vers le cytosol pour initier la biosynthèse de novo des acides gras et la production d’acétate est essentielle à la croissance du parasite. La navette acétate fait intervenir dans la mitochondrie l’acétate:succinate CoA-transférase (ASCT), qui converti l'acétyl-CoA produit à partir du glucose en acétate. Nous avons identifié et caractérisé une autre enzyme mitochondriale contribuant aussi à la production d’acétate à partir du glucose : l’acétyl-CoA thioesterase (ACH). Le double mutant n’exprimant ni l’ACH ni l’ASCT ne produit plus d’acétate et n’est plus viable, confirmant le rôle essentiel de la production d’acétate. Par ailleurs, nous avons montré que l’ASCT, grâce au cycle formé avec la succinyl-CoA synthétase (SCoAS), contribue à la production d’ATP par phosphorylation au niveau du substrat dans la mitochondrie, mais l’ACH n’est pas impliqué dans la production d’ATP. La thréonine est l’acide aminé le plus rapidement consommé par le parasite et sa dégradation aboutit à la production d’acétate et de glycine. En utilisant des outils de génétique inverse et des analyses métaboliques par RMN du proton et HPTLC, nous avons caractérisé la première étape enzymatique de cette voie, catalysée par la thréonine déshydrogénase (TDH), et nous avons montré que la thréonine est la principale source de carbone pour la production d’acétate, pour la biosynthèse de novo des acides gras et des stérols. L’acétyl-CoA est produit dans la mitochondrie à partir du pyruvate provenant de la dégradation du glucose par le complexe pyruvate déshydrogénase (PDH) et à partir de la thréonine dont la dégradation est initiée par la TDH. L’acétyl-CoA provenant de la dégradation du glucose ou de la thréonine est converti en acétate par les mêmes enzymes, l’ACH et l’ASCT. Nous avons montré que la voie de dégradation de la thréonine est sous régulation métabolique. L’activité et l’expression de la TDH ainsi que la production d’acétate à partir de la thréonine sont diminuées dans le mutant knock out de la phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) dans lequel le flux glycolytique est redirigé vers la production d’acétate. De plus, contrairement au glucose, la dégradation de la thréonine ne participe pas à la production d’ATP dans la mitochondrie du parasite. Nos résultats nous amène à l’hypothèse d’un channeling mitochondrial des voies de dégradation du pyruvate et de la thréonine pour la production d’acétate. Les trypanosomes ont développé une voie de biosynthèse de novo des acides gras faisant appel aux élongases du réticulum endoplasmique et un précurseur inhabituel, le butyryl-CoA dont la voie de biosynthèse n’est à l’heure actuelle pas connue chez les trypanosomatidés. Nous avons reconstitué une voie de biosynthèse hypothétique à partir de l’acétyl-CoA dans la mitochondrie. La dernière enzyme de cette voie, l’isovaléryl-CoA déshydrogénase (IVDH), a été caractérisée, et nos premiers résultats indiquent que cette enzyme est impliquée dans la production du butyryl-CoA. / Trypanosoma brucei, a flagellated protozoan parasite of the kinetoplastidae order, is responsible for human sleeping sickness or human african trypanosomiasis (HAT). Its life cycle is complex and involves a haematophageous insect vector (tse-tse fly or Glossina), which ingests parasites during a blood meal on an infected host. After a series of differentiations, the parasites are injected to another host during another blood meal. We studied the energy and intermediary metabolism of the procyclic form of T. brucei, which is present into the midgut of the tse-tse fly. In this parasite, glucose degradation produces acetate into the mitochondria of the parasite and succinate into both the mitochondria and the glycosomes. Glycosomes are specific organites of trypanosomatids in which the glycolysis is compartimentalized. T. brucei uses an "acetate shuttle" to transfer acetyl-CoA from the mitochondrion to the cytosol to feed de novo fatty acids biosynthesis. This acetate production is essential for cell viability. The "acetate shuttle" involves inside the mitochondrion, the acetate:succinate CoA-transferase (ASCT), which converts glucose-derived acetyl-CoA into acetate. We identified and characterised a new mitochondrial enzyme involved in acetate production from glucose, in addition to ASCT: the acetyl-CoA thioesterase (ACH). Indeed, a double mutant affecting expression of both ACH and ASCT doesn’t produce anymore acetate and is lethal, which confirms the essential role of mitochondrial production of acetate. In addition, we showed that ASCT, via the ASCT/SCoAS (succinyl-CoA synthetase) cycle, contributes to mitochondrial ATP production by substrate phosphorylation, while ACH is not involved in ATP production. We also observed that contribution of the ASCT/SCoAS cycle and oxidative phosphorylation by the mitochondrial F0-F1-ATP synthase to ATP production are similar. Threonine is the most rapidly consumed amino acid by the procyclic trypanosomes and its degradation produces acetate and glycine. Using a combination of reverse genetics, proton NMR metabolic profiling and HPTLC, we characterized the first enzymatic step of the pathway, catalysed by the threonine dehydrogenase (TDH) and showed that threonine is the main carbon source for acetate production, de novo fatty acids and sterol biosynthesis. Acetyl-CoA is produced into the mitochondrion from glucose-derived pyruvate by the pyruvate dehydrogenase complex (PDH) and by the two first steps of the threonine degradation pathway, including TDH. Both glucose-derived and threonine-derived acetyl-CoA is then converted into acetate by the same enzymes, ACH and ASCT. We also found that the threonine degradation pathway is under metabolic control. Indeed, TDH activity, TDH expression and threonine-derived acetate production are reduced in the phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) knock out mutant, in which glycolytic flux is redirected towards acetate production. In addition, we showed that, as opposed to glucose-derived acetyl-CoA, metabolism of threonine-derived acetyl-CoA doesn’t contribute to ATP production into the mitochondrion of the parasite. Our results suggest the existence of mitochondrial metabolic channelings, which disconnect pyruvate and threonine degradation pathways leading to acetate production. Trypanosomes developed a specific de novo fatty acids biosynthesis pathway using elongases located in the endoplasmic reticulum and an unusual primer, butyryl-CoA. The biosynthesic pathway of butyryl-CoA has not been investigated so far in trypanosomatids. Genomic data mining of the T. brucei database, highlights an hypothetical mitochondrial biosynthesis pathway from acetyl-CoA to butyryl-CoA. The last enzyme of this pathway, isovaleryl-CoA dehydrogenase (IVDH), was characterised and our first results suggest that this enzyme is indeed involved into butyryl-CoA production.

Les symbioses bactérie-légumineuse (nodulation) et champignon-plante (mycorhization) présentent un intérêt agrobiologique et écologique majeur ; elles permettent aux plantes de croître naturellement sur un sol aride et peu fertile. Il a été démontré très récemment que les signaux impliqués dans la mise en place de la symbiose endomycorhizienne à arbuscule (facteurs "Myc") sont très proches de ceux de la nodulation. Il s'agit de molécules appartenant à la famille des lipo-chitooligosaccharides. Afin de réaliser la synthèse de ces molécules, deux nouvelles méthodologies ont été développées. L'ouverture oxydante d'acétals de 4,6-O-benzylidène de plusieurs glycopyranosides (en série gluco, galacto et manno) par le diméthyldioxirane (DMDO) a été étudiée. Le contrôle de la régiosélectivité a été effectué grâce au groupement protecteur introduit sur la fonction alcool de la position 3. La formation directe de β-glycosides de la N-acétyl-D-glucosamine par catalyse au triflate de fer (III) a été étudiée. La réaction a été menée sous irradiation micro-ondes ou en flux continu (système minifluidique Vapourtec®). Une nouvelle stratégie pour la synthèse du facteur [Myc-IV (C16:0, S)] a ensuite été établie. Nous avons utilisé un réactif peu toxique et non odorant pour introduire le motif thio nécessaire à la formation de deux liaisons glycosidiques. Le disaccharide précurseur de l'unité réductrice a été obtenu grâce à la première méthodologie développée au cours de cette thèse.