Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La chaperona bacteriana periplasmática CusF es parte del sistema de resistencia a cobre CusCFBA. CusF une cobre (I) en el periplasma bacteriano mediante una histidina y dos metioninas muy conservadas en las bacterias. En Acidithiobacillus ferrooxidans, la histidina del sitio de unión a cobre de CusFAf se encuentra sustituída por metionina. Se ha determinado que a pesar que la afinidad de la histidina por cobre es mayor que la de la metionina a pH neutro, esta última presenta una mayor afinidad por cobre a pH ácido. Siendo A. ferrooxidans una bacteria que vive en ambientes ácidos, esta sustitución podría estar relacionada con la adaptación al periplasma ácido de la bacteria. Se analizó bioinformáticamente el sitio de unión a cobre de CusF para determinar las especies en las que se encuentra esta sustitución. Se encontró que sólo el género Acidithiobacillus presenta esta sustitución. Adicionalmente se midió la unión de cobre a la CusF de A. ferrooxidans y el efecto que tiene esta sustitución. Para ello se clonó el gen cusF3Af en E. coli y se realizó una mutación sitio dirigida de su metionina 66 cambiándola por histidina. Luego de expresar y purificar ambas proteínas (silvestre y mutada) se midió in vitro su capacidad de unir cobre tanto a pH ácido como neutro. A pH 7, la CusF3 de A. ferrooxidans presentó unión a cobre con un valor experimental de 0.7 átomos de cobre por proteína mientras que la mutante M66H unió 0.3 átomos de cobre por proteína (la misma cantidad de cobre que el control). A pH ácido no fue posible medir la unión de cobre con el método utilizado. Se concluye que la sustitución de histidina por metionina en la CusF3Af es exclusiva del género Acidithiobacillus y que esta chaperona tiene capacidad de unir cobre a pH neutro. / The periplasmatic metallochaperone CusF is part of the CusCFBA copper resistance system. CusF binds Cu(I) through a conserved site consisting of 1 histidine and 2 methionines. In Acidithiobacillus ferrooxidans, this histidine present in the position 66 of CusFAf is found substitued by a methionine. It has been determined that while the affinity of copper for histidine is higher than that for methionine at neutral pH, the latter has higher affinity for the metal at low pH. Since A. ferrooxidans lives in acidic environments, it is proposed that this subsitution could be an adaptation to the acid periplasm of this bacterium. The copper binding site of CusF was analyzed bioinformatically to determine the species in which this subsitution is found. This substitution was only present in the CusF of species from the genus Acidithiobacillus. Additionally, copper binding capacity of the A. ferrooxidans CusF was measured, and the effect of this substitution was investigated. To fulfill that purpose, the cusF3Af gene was cloned into E. coli and a site directed mutation was performed to replace methionine 66 with histidine. Both wild type and mutated proteins were expressed and purified to measure in vitro their copper binding capacity at both neutral and acid pH. A copper binding capacity of 0,7 copper atoms per protein was found for the wild type CusF3Af, while the M66H mutant was able to bind 0,3 copper atoms per protein (the same amount of copper present in the negative control). It was not possible to perform this measurement under acidic conditions. It was concluded that the subsitution of histidine for methionine in CusF3Af is exclusive of the Acidithiobacillus genus, and that this copper chaperone has the capacity to bind copper at neutral pH. / Enero 2018

Orientador: Laura Maria Mariscal Ottoboni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:11:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bergamo_RogerioFaria_D.pdf: 5816487 bytes, checksum: c55c4aa07d6b8202428bd0d045c5779f (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans é uma bactéria não patogênica, Gram-negativa, que obtém a energia necessária para o seu crescimento pela oxidação de compostos inorgânicos. Essa bactéria tem despertado interesse por fazer parte de um consórcio de microrganismos envolvidos na biolixiviação de metais. O processo de biolixiviação é influenciado por vários fatores, dentre eles o pH. Apesar desse fator ser importante no crescimento e sobrevivência da bactéria, existem poucas informações sobre os mecanismos moleculares acionados pela bactéria para suportar mudanças envolvendo este parâmetro. Assim sendo, nesse trabalho foram realizados experimentos de respirometria e curvas de crescimento para analisar-se o comportamento da linhagem brasileira de A. ferrooxidans LR em situações que envolviam alterações no pH ideal de cultivo. Com esses experimentos, observou-se que, na presença de pHs acima (2,5 e 3,0) e abaixo (1,5 e 1,2) de 1,8, tanto a respiração quanto o crescimento de A. ferrooxidans LR são afetados. Os pHs dos experimentos de respirometria e curvas de crescimento foram utilizados para obtenção de células de A. ferrooxidans para o isolamento do RNA que foi analisado por RAP-PCR com os primers arbitrários OPF01, OPF03, OPF04, OPF08, OPJ04, OPJ14. Como controle, foi utilizado RNA isolado de células obtidas em pH ideal de cultivo da bactéria. Os cDNAs isolados tiveram a expressão diferencial confirmada por slot blot e foram, a seguir, clonados e seqüenciados. As seqüências obtidas foram comparadas em bancos de dados. As seqüências deduzidas de aminoácidos de quatro cDNAs com expressão induzida em pHs acima ou abaixo de 1,8 apresentaram similaridade com as seguintes proteínas: proteína hipotética, proteína small heat shock, L-2-haloalkanoic acid dehalogenase e ResB. As seqüências deduzidas de aminoácidos de quatro cDNAs com expressão reprimida em pHs acima ou abaixo de 1,8 apresentaram similaridade com as proteínas fructose/tagatose biphosphate aldolase, DedA, proteina ribosomal e DNA helicase dependente de ATP. Esses resultados sugerem que alterações no pH ideal de cultivo de A. ferrooxidans resultam em alterações da expressão de genes que codificam para proteínas pertencentes a diferentes categorias funcionais / Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans are non pathogenic, Gram-negative bacteria that obtain energy for growth from the oxidation of inorganic compounds. These bacteria are part of a consortium of microorganisms involved in the bioleaching of metals. Among others, pH alterations can affect bioleaching. The pH is very important in the survival and growth of the bacteria, but very little is known about the molecular mechanisms used by the bacteria to bare pH alterations. This way, in this work respirometric experiments and growth curves were conducted to analyze the behavior of the A. ferrooxidans Brazilian strain LR in situations involving changes in the bacteria ideal pH. In pHs above (2.5 and 3.0) and below (1.5 and 1.2) 1.8 both oxygen consumption and growth were affected. The pHs used in the respirometric experiments and growth curves were selected to grow A. ferrooxidans cells to isolate the RNA that was used in the RAP-PCR experiments with the arbitrary primers OPF01, OPF03, OPF04, OPF08, OPJ04 and OPJ14. The differential expression of the isolated cDNAs was validated by slot blot. The cDNAs were cloned, sequenced and the obtained sequences were compared to the ones present In GenBank. The deduced amino acids sequences of four cDNAS up-regulated in pHs above and below 1.8 presented similarity with the following proteins: hypothetical protein, small heat shock, L-2-haloalkanoic acid dehalogenase and ResB. The deduced amino acids sequences of four cDNAS down-regulated in pHs above and below 1.8 presented similarity with the proteins: fructose/tagatose biphosphate aldolase, DedA, ribosomal protein and ATP-dependent DNA helicase. These results suggest that alterations in the A. ferrooxidans ideal pH change the expression of genes that encode proteins from different functional categories / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Resumo: Devido ao esgotamento progressivo das jazidas de minérios de cobre com teores elevados (>2%), a aplicação de processos convencionais para a extração de cobre desses minérios, como a pirometalurgia, torna-se inviável devido ao alto custo dos gastos de energia envolvidos. Em função desse esgotamento, bem como do acúmulo de rejeitos de baixos teores (< 0,5%), a busca de processos alternativos para atender a demanda crescente desse metal em todo mundo tornou-se uma necessidade. Uma das alternativas mais viáveis envolve o uso de microrganismos capazes de solubilizar sulfetos metálicos de cobre, em decorrência de seus processos metabólicos oxidativos. O processo que utiliza esses microrganismos na recuperação do cobre de minérios de baixo teor ou de rejeitos é conhecido como biolixiviação e tem sido aplicado em escala industrial em vários países, em especial EUA e Chile, onde estão as maiores reservas mundiais de minério de cobre. Biolixiviação ou lixiviação bacteriana é o processo pelo qual bactérias, sobretudo as do gênero Acidithiobacillus e, principalmente, a espécie Acidithiobacillus ferrooxidans, oxidam sulfetos metálicos (CuFeS2, CuS, CuS2, PbS, ZnS entre outros) como fonte de energia, levando à solubilização desses metais. O A. ferrooxidans é uma espécie mesofílica, quimiolitotrófica e acidofílica que, além de sulfetos metálicos, oxida também íons ferrosos e compostos reduzidos de enxofre. Esse processo é uma alternativa viável para a extração de cobre, pois requer poucos gastos com insumos (ácidos e agentes oxidantes), apresenta reduzido gasto energético, baixo investimento de capital, baixo custo operacional e reduzida mão de obra especializada na operação. Dentre os minerais de cobre, o mais abundante e também o mais refratário ao ataque químico ou bacteriano é a calcopirita. Assim, muitos estudos foram desenvolvidos...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: High-grade copper ores deposits (>2%) have been depleted for centuries. So, conventional processes to recover copper from low-grade ores such as pirometallurgy have become prohibitive due the elevated costs, since large amount of energy is spent in this process. As a result of this depletion, a huge amount of low-grade ores (<0.5%) as well waste materials from conventional process have been accumulated for years, waiting for an economic alternative method. In order to match up a constant increase in the copper world demand, the search for new methodologies has become an obligation. Among these alternatives, the use of microorganisms capable to copper sulfides dissolution is the most feasible one. This process, known as bioleaching or bacterial leaching, has been applied in industrial scale in several countries, such as USA and Chile, where the highest copper deposits are located. Bacterial leaching is developed by certain bacteria belong to the Acidithiobacillus genus, among others, mainly by species Acidithiobacillus ferrooxidans, which oxidize metal sulfides (CuFeS2, CuS, CuS2, PbS, ZnS, etc) as its energy source, solubilizing the corresponding metal. It is a mesophilic, chemolithotrophic and acidophilic bacterium that besides metal sulfides oxidize also ferrous iron and other reduced sulphur compounds as energy source. The viability of the process is related with the low costs operation: low capital investments, reduced needs for specialized works, low reagents and materials consumption, etc. Chalcopyrite is most abundant copper mineral and, at same time, the most refractory to chemical or bacterial attack. In this way, several studies have been devoted to understand the mechanisms involved in the mineral dissolution, as well to developed new methodologies to improve chalcopyrite dissolution. It was investigated in this study the effect of some chemical agents...(Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Oswaldo Garcia Junior / Coorientador: Denise Bevilaqua / Banca: Assis Vicente Benedetti / Banca: Wilson Cervi da Costa / Mestre

La oxidación bacteriana del ión ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en presencia de carbón activado es un proceso útil tanto para la generación de ión férrico como para la generación de inóculos de alta concentración bacteriana. El objetivo del presente trabajo es mejorar el entendimiento del mecanismo mediante el cual la presencia del carbón activado afecta los procesos de oxidación del ión ferroso. En particular, en este trabajo se evalúa por primera vez la influencia que el efecto químico del carbón activado sobre el ión férrico pueda tener en el proceso. El trabajo experimental se efectuó a 30 ºC. Experimentos preliminares en que se contactó medio basal MC, de composición igual a 0,4 g/L de (NH4)2SO4; 0,056 g/L de K2HPO4·3H2O y 0,4 g/L de MgSO4·7H2O,.a pH = 1.6 y 3 g/l de ión férrico con carbón activado, confirmaron que el ión férrico es parcialmente reducido a ión ferroso por la acción química del carbón. Estudios cinéticos conducidos con el mismo medio basal MC, pero con concentraciones de ión férrico en el rango entre 100 a 1200 mg/L, y con 0.2 g carbón en 100 ml de solución, demostraron que la cinética de reducción del ión férrico con carbón se rige por la expresión: Con : k =7,68x10-6 [(mg/L)-0,731/min] ; n=3,369 Los estudios de crecimiento bacteriano en presencia de carbón activado se efectuaron con 6,2 g/L de carbón, con una cepa pura de Acidithiobacillus ferrooxidans con concentración inicial de 2,9 x 109 [bact/L], en un medio basal MC a pH 1,6 que contenía una concentración inicial de 3 g/L de ión férrico, sin ión ferroso. El experimento se efectuó en un frasco agitado modificado que impedía el contacto directo entre los microorganismos y el carbón, de modo que el crecimiento bacteriano se pudo monitorear por conteo directo. El resultado de este experimento permitió constatar que, a pesar de no haber inicialmente ión ferroso, la población bacteriana después de 19 días creció hasta 4x1010 [bact/L]. En un experimento control efectuado en condiciones similares, pero sin agregar carbón, no se observó crecimiento durante el mismo período. Los resultados de este estudio permitieron confirmar que en el proceso de oxidación bacteriana del ión ferroso con Acidithiobacillus ferrooxidans en presencia de carbón activado, el carbón contribuye adicionalmente al crecimiento bacteriano a través de la regeneración del ión ferroso por reducción química de ión férrico con el carbón. El trabajo de simulación efectuado permitió demostrar, además, que la evolución de la población bacteriana, concentración de ión ferroso, ión férrico y Eh durante el proceso se puede describir adecuadamente en base a un modelo que describe la oxidación bacteriana del ión ferroso con una cinética tipo Monod que incluye el efecto inhibitorio del ión férrico y describe la reducción de ión férrico con la expresión cinética deducida en este trabajo. El efecto químico del carbón activado sobre el ión férrico detectado en este estudio es un aspecto que no ha sido considerado en los artículos reportados hasta el momento en este tema. El resultado de este estudio contribuirá entonces a aclarar las contradicciones entre los diferentes resultados reportados y posibilitará el estudio de la optimización del proceso sobre bases conceptuales más sólidas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-02Bitstream added on 2014-06-13T19:08:53Z : No. of bitstreams: 1 silva_dr_me_araiq.pdf: 984256 bytes, checksum: bcc952300b822c0cddcc1c2d5f5eec53 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A biolixiviação (lixiviação bacteriana) é uma alternativa para a extração de metais presentes em sulfetos minerais empregando microorganismos. Dentre as principais vantagens da biohidrometalurgia em relação aos métodos convencionais podem ser destacadas a não-emissão de SO2 para a atmosfera, pequeno gasto com insumos, pois são produzidos pelos próprios microorganismos, baixa demanda energética e o tratamento de minérios contendo metais em baixo teor. Uma das espécies envolvidas na biolixiviação de sulfetos minerais mais estudadas é Acidithiobacillus ferrooxidans. Essa bactéria é gram negativa, aeróbia, acidófila, mesófila e obtém energia através da oxidação de íons Fe2+ e compostos reduzidos de enxofre. A calcopirita é a principal fonte de cobre presente na crosta terrestre. Uma das principais propriedades desse sulfeto é a sua alta refratariedade ao ataque químico e bacteriano, conseqüência da sua elevada energia de rede cristalina. Além disso, a formação de uma camada protetora, constituída basicamente por polissulfetos, sobre a sua superfície diminui a dissolução desse minério. Por isso, diversos grupos de pesquisa buscam alternativas para a resolução desses problemas visando elevar as extrações de cobre a partir desse sulfeto. Com esse objetivo, o presente trabalho estudou o efeito da adição de nanopartículas, polares e apolares, na biolixiviação da calcopirita por A. ferrooxidans LR. O único estudo relacionado à lixiviação envolvendo nanopartículas demonstrou que a adição de nanosílica elevou as taxas de dissolução da calcopirita mediante utilização de agentes oxidantes, meio reacional ácido e temperatura moderada. Para avaliar o efeito da adição de nanopartículas no crescimento bacteriano, foi monitorada a concentração de íons Fe2+ presentes em sistemas contendo A. ferrooxidans... / Bioleaching is an alternative for metal extraction from mineral sulfides using microorganisms. The main advantages of the biotechnological processes in comparison with usual methods of metal extraction are the non-emission of SO2 to atmosphere, lower inputs cost, as they are produced by the microorganisms themselves, lesser energy requirements and treatment of low-grade ores. One of the most studied microbes involved in the bioleaching of mineral sulfides is Acidithiobacillus ferrooxidans. This bacterium is Gram-negative, aerobic, acidophilic, mesophilic and oxidizes Fe2+ ions and reduced forms of sulfur to obtain energy. Chalcopyrite is the main copper source present in the world. One of its main properties is the high resistance to the chemical and bacterial attacks, result of its great crystal lattice energy. Also, the formation of a protective layer, mainly constituted by polysulfides, over its surface reduces the dissolution of that ore. For those reasons, several research groups throughout the world are investigating alternatives to solve these problems and promote the higher copper extraction from this sulfide. This work studied the effect of adding nanoparticles, polar and non-polar, in the bioleaching of chalcopyrite by A. ferrooxidans LR. The only study related to leaching involving nanoparticles, published in 2005, demonstrated that the addition of nano-sized silica raised the dissolution rates of chalcopyrite when using oxidizing agents, acidic medium and moderate temperature. To evaluate the effect of adding nanoparticles in bacteria growth, it was monitorated the Fe2+ ions concentration present in flasks that contained A. ferrooxidans LR and different concentrations of nanoparticles. Thus, it was observed that high amounts of nanoparticles (> 2.5% m/v) affected the bacteria growth. Shake flasks... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-24Bitstream added on 2014-06-13T18:50:19Z : No. of bitstreams: 1 ribeironeto_wa_me_araiq.pdf: 385928 bytes, checksum: 31aa2d033d1770556324d25a26f258a0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Devido ao esgotamento progressivo das jazidas de minérios de cobre com teores elevados (>2%), a aplicação de processos convencionais para a extração de cobre desses minérios, como a pirometalurgia, torna-se inviável devido ao alto custo dos gastos de energia envolvidos. Em função desse esgotamento, bem como do acúmulo de rejeitos de baixos teores (< 0,5%), a busca de processos alternativos para atender a demanda crescente desse metal em todo mundo tornou-se uma necessidade. Uma das alternativas mais viáveis envolve o uso de microrganismos capazes de solubilizar sulfetos metálicos de cobre, em decorrência de seus processos metabólicos oxidativos. O processo que utiliza esses microrganismos na recuperação do cobre de minérios de baixo teor ou de rejeitos é conhecido como biolixiviação e tem sido aplicado em escala industrial em vários países, em especial EUA e Chile, onde estão as maiores reservas mundiais de minério de cobre. Biolixiviação ou lixiviação bacteriana é o processo pelo qual bactérias, sobretudo as do gênero Acidithiobacillus e, principalmente, a espécie Acidithiobacillus ferrooxidans, oxidam sulfetos metálicos (CuFeS2, CuS, CuS2, PbS, ZnS entre outros) como fonte de energia, levando à solubilização desses metais. O A. ferrooxidans é uma espécie mesofílica, quimiolitotrófica e acidofílica que, além de sulfetos metálicos, oxida também íons ferrosos e compostos reduzidos de enxofre. Esse processo é uma alternativa viável para a extração de cobre, pois requer poucos gastos com insumos (ácidos e agentes oxidantes), apresenta reduzido gasto energético, baixo investimento de capital, baixo custo operacional e reduzida mão de obra especializada na operação. Dentre os minerais de cobre, o mais abundante e também o mais refratário ao ataque químico ou bacteriano é a calcopirita. Assim, muitos estudos foram desenvolvidos... / High-grade copper ores deposits (>2%) have been depleted for centuries. So, conventional processes to recover copper from low-grade ores such as pirometallurgy have become prohibitive due the elevated costs, since large amount of energy is spent in this process. As a result of this depletion, a huge amount of low-grade ores (<0.5%) as well waste materials from conventional process have been accumulated for years, waiting for an economic alternative method. In order to match up a constant increase in the copper world demand, the search for new methodologies has become an obligation. Among these alternatives, the use of microorganisms capable to copper sulfides dissolution is the most feasible one. This process, known as bioleaching or bacterial leaching, has been applied in industrial scale in several countries, such as USA and Chile, where the highest copper deposits are located. Bacterial leaching is developed by certain bacteria belong to the Acidithiobacillus genus, among others, mainly by species Acidithiobacillus ferrooxidans, which oxidize metal sulfides (CuFeS2, CuS, CuS2, PbS, ZnS, etc) as its energy source, solubilizing the corresponding metal. It is a mesophilic, chemolithotrophic and acidophilic bacterium that besides metal sulfides oxidize also ferrous iron and other reduced sulphur compounds as energy source. The viability of the process is related with the low costs operation: low capital investments, reduced needs for specialized works, low reagents and materials consumption, etc. Chalcopyrite is most abundant copper mineral and, at same time, the most refractory to chemical or bacterial attack. In this way, several studies have been devoted to understand the mechanisms involved in the mineral dissolution, as well to developed new methodologies to improve chalcopyrite dissolution. It was investigated in this study the effect of some chemical agents...(Complete abstract click electronic access below)

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / In the first chapter, this thesis aims to demonstrate the great potential of Constraint-Based Reconstruction and Analysis (COBRA) methods for studying and predicting specific phenotypes in the bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. A genome-scale metabolic reconstruction of Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 (iMC507) is presented and characterized. iMC507 is validated for aerobic chemolithoautotrophic conditions by fixating carbon dioxide and using three different electron donors: ferrous ion, tetrathionate and thiosulfate. Furthermore, the model is utilized for (i) quantitatively studying and analyzing key reactions and pathways involved in the electron transfer metabolism, (ii) describing the central carbon metabolism and (iii) for evaluating the potential to couple the production of extracellular polymeric substances through knock-outs. The second chapter work outlines the effort towards advancing the field of systems metabolic engineering by using COBRA methods in conjunction with chemoinformatic approaches to metabolically engineer the bacterium Escherichia coli. A complete strain design workflow integrating synthetic pathway prediction with growth-coupled designs for the production of non-native compounds in a target organism of interest is outlined. The generated enabling technology is a computational pipeline including chemoinformatics, bioinformatics, constraint-based modeling, and GEMs to aid in the process of metabolic engineering of microbes for industrial bioprocessing purposes. A retrosynthetic based pathway predictor algorithm containing a novel integration with GEMs and reaction promiscuity analysis is developed and demonstrated. Specifically, the production potential of 20 industrially-relevant chemicals in E. coli and feasible designs for production strains generation is outlined. A comprehensive mapping from E. coli s native metabolome to commodity chemicals that are 4 reactions or less away from a natural metabolite is performed. Sets of metabolic interventions, specifically knock-outs and knock-ins that coupled the target chemical production to growth rate were determined. In the third chapter, in order to aid the field of cancer metabolism, potential biomarkers were determined through gain of function oncometabolites predictions. Based on a chemoinformatic approach in conjunction with the global human metabolic network Recon 2, a workflow for predicting potential oncometabolites is constructed. Starting from a list of mutated enzymes genes, described as GoF mutations, a range of promiscuous catalytic activities are inferred. In total 24 chemical substructures of oncometabolites resulting from the GoF analysis are predicted.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / Acidithiobacillus ferrooxidans es una bacteria quimiolitoautótrofa, acidófila, involucrada en un consorcio bacteriano capaz de biolixiviar metales como el cobre. Este microorganismo posee la capacidad de vivir en ambientes con altas concentraciones de metales. Por ello que esta bacteria es importante en procesos industriales de biolixiviación y por ende, su estudio resulta de utilidad en relación con esta biotecnología. Uno de los componentes más abundantes e importantes de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas como A. ferrooxidans es el lipopolisacárido (LPS). Esta molécula consta de una parte integral hidrofóbica conocida como lípido A, y una parte hidrofílica dividida en dos, el “core” y el antígeno O. La síntesis de las distintas partes del LPS es catalizada por varias proteínas. Dentro de éstas, se encuentra la proteína RfaE, involucrada en la síntesis del “core” del LPS, la enzima Wzy, que polimeriza al antígeno O y la proteína Wzz, que determina el largo de cadena del antígeno O. Al ser la molécula más expuesta de la bacteria, el LPS está en contacto directo con el medio donde vive el microorganismo. Por lo tanto, interactúa directamente con eventuales metales presentes en el ambiente como el cobre, el oro, etc. Diversos estudios han revelado que modificaciones del LPS pueden afectar la adherencia de las bacterias a distintas superficies e incluso afectar la viabilidad de la célula. En base a estos antecedentes, para analizar si el LPS modifica su estructura y/o cantidad, se midieron mediante qRT-PCR los cambios transcripcionales de los genes wzy, wzz y rfaE de las cepas ATCC 23270 y ATCC 53993 de A. ferrooxidans, que codifican para las proteínas nombradas previamente, cuando la bacteria creció a distintas concentraciones de cobre. También se cuantificó y analizó la estructura del LPS de A. ferrooxidans. 2 Los resultados mostraron que la presencia de cobre provoca cambios transcripcionales significativos para los tres genes analizados en la cepa ATCC 23270 y sólo para el gen wzz en la cepa ATCC 53993. Tanto la estructura del LPS analizado, como el número de unidades repetidas del antígeno O, no presentaron cambios significativos en ambas cepas. La cantidad de LPS presente en la cepa ATCC 23270 es menor que en la cepa ATCC 53993, sin embargo, se observó un aumento parcial del LPS en la cepa ATCC 23270 cuando la bacteria crece a mayores concentraciones de cobre, mientras que la cepa ATCC 53993 no presentó cambios significativos en esta condición, sugiriendo que la cepa ATCC 23270 utilizaría el LPS como una forma de resistencia contra el cobre y que la cepa ATCC 53993 no aumentaría su cantidad de LPS, ya que de manera basal posee mayores cantidades de esta molécula. Estos resultados son una primera aproximación al posible rol que tendría el LPS en esta bacteria acidófila en la interacción con metales. / Acidithiobacillus ferrooxidans is a chemolithoautotrophic and acidophilic bacterium, involved in the microbial consortium capable of bioleaching metals such as copper. This microorganism has the ability to live at very high metal concentrations and therefore, plays a pivotal rol in bioleaching of minerals. One of the most abundant and important components of the outer membrane of Gram-negative bacteria such as A. ferrooxidans is the lipopolysaccharide (LPS). This molecule consists of an integral hydrophobic part known as lipid A, and a hydrophilic portion divided in to the “core” and the O-polysaccharide or O-antigen. The synthesis of the different parts of LPS is catalyzed by several proteins. Among these, RfaE protein is involved in the “core” synthesis of LPS. Wzy enzyme polymerizes the O antigen and Wzz protein is the O antigen chain lenght determinant. Being the most exposed molecule of the bacterium, LPS is in direct contact with the environment. Therefore, it can directly interact with the metals present in the environment. Some reports indicate that modifications of LPS can affect the attachment of bacteria to different surfaces and even their viability. Based on this background, to analyze whether the LPS structure and/or its quantity are modified in the presence of copper, transcriptional changes of wzy, wzz and rfaE genes from A. ferrooxidans ATCC 23270 and ATCC 53993, were measured in bacteria grown at different copper concentrations. The levels of LPS present in both strains of A. ferrooxidans were also quantified and their structure analyzed by electrophoresis in poliacrilamide gels. 4 The results showed significant transcriptional changes for the three genes analyzed in strain ATCC 23270 and only for the wzz gene in strain ATCC 53993. The LPS structure was analyzed by determining the number of repeated units of O antigen. No significant changes in the electrophoretic banding patterns were seen in both strains. The amounts of LPS present in strain ATCC 23270 was lower than that of strain ATCC 53993. However, the amounts of LPS were partially increased when strain ATCC 23270 was grown in high copper concentrations. On the contrary, strain ATCC 53993 did not show significant changes in the presence of the metal, suggesting that strain ATCC 23270 would use LPS as a way of copper resistance. Strain ATCC 53993 on the other hand, already has a higher basal amount of LPS. These preliminary results are a first approximation to study the posible role of LPS in its interaction with metals in this acidophilic bacteria.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2014-10-22T17:58:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Luiz Eduardo Lacerda de Oliveira.pdf: 2604227 bytes, checksum: 7c9c502a0ab174d9ab61202c3b062504 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-22T17:58:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Luiz Eduardo Lacerda de Oliveira.pdf: 2604227 bytes, checksum: 7c9c502a0ab174d9ab61202c3b062504 (MD5) / CAPES / Acidithiobacillus ferrooxidans é uma das bactérias catalizadoras da reação de oxidação que leva à formação drenagem ácida mineira (DAM). Devido à capacidade oxidativa e lixiviante deste micro-organismo, a indústria passou a usá-lo na extração de minerais, por biolixiviação, com vantagens em relação aos métodos convencionais em alguns casos. A Bahia tem uma expressiva produção mineral, no entanto poucos são os relatos sobre a investigação sistemática de aspectos microbiológicos envolvidos na DAM neste estado. Com foco nisto, o objetivo desta pesquisa foi identificar bactérias envolvidas na formação de DAM na região de Jacobina – BA, e isolar a bactéria A. ferrooxidans, proveniente de locais que sofrem com este problema, para utilização em ensaio de biolixiviação a fim de avaliar a capacidade oxidativa deste isolado na recuperação de cobre. Para isto, uma amostra de sedimento foi coletada em uma barragem de rejeitos e caracterizada a nível molecular por Microarray, sendo encontrados 5 taxa, todos do domínio Bacteria, entre eles a espécie A. ferrooxidans, a qual foi isolada após enriquecimento em meio T&K e posterior purificação em meio sólido seletivo T&K-agarose. O crescimento bacteriano no enriquecimento foi acompanhado pela titulação de Fe2+ residual do meio com dicromato de potássio, por inspeção visual (mudança cor de verde claro para marrom avermelhado) e aumento do potencial redox. Durante o enriquecimento, a cultura chegou à fase estacionária em 2 dias após o inóculo. Em meio sólido, as colônias isoladas foram obtidas do 10º ao 15º dia de incubação. Análise molecular por qPCR confirmou que A. ferrooxidans foi a espécie isolada. O isolado foi empregado no ensaio de biolixiviação com minérios sulfetados de cobre, no qual predomina calcopirita. O ensaio foi realizado com 20% de sólidos, com pH inicial de 2, agitação constante (130 RPM), temperatura de 30ºC e duração de 60 dias, em três condições: o frasco sem inóculo e esterilizado pela adição de formaldeído; o frasco inoculado com A. ferrooxidans; e o frasco sem inóculo e não esterilizado. O processo de biolixiviação ficou evidenciado quando utilizada esta cepa bacteriana, uma vez que os frascos que a continham apresentaram melhor recuperação de cobre, 58 e 60%, em relação aos frascos sem inóculo, cuja recuperação foi de 31 e 35% para os esterilizados com formaldeído, e de 37 e 44% para o não esterilizado. O minério estudado, apesar da refratariedade da calcopirita, mostrou boa potencialidade na utilização de bactérias para recuperação de cobre por biolixiviação. A manutenção e ajuste do pH durante a lixiviação bacteriana foi essencial para a eficiente recuperação deste metal.

Submitted by Laíze Fernanda Pereira null (laize_fernandapereira@yahoo.com.br) on 2016-10-03T11:51:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Laize Fernanda Pereira_versão final.pdf: 1765685 bytes, checksum: c480da42091df39cbc80f15e56710bec (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-10-05T17:05:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_lf_me_araiq.pdf: 1765685 bytes, checksum: c480da42091df39cbc80f15e56710bec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T17:05:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_lf_me_araiq.pdf: 1765685 bytes, checksum: c480da42091df39cbc80f15e56710bec (MD5) Previous issue date: 2016-09-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O carvão é a mais importante fonte de energia não renovável de origem fóssil do planeta. Um dos maiores problemas em sua utilização como fonte energética se deve à presença de enxofre na forma orgânica e inorgânica (pirita FeS2). Durante a combustão do carvão, são lançados na atmosfera vários gases, entre eles o SO2 que causam problemas ambientais como a formação de chuva ácida além da corrosão de “boilers”, oleodutos subterrâneos, instalações metálicas e maquinários de minas. Há vários processos físicos e químicos para redução do enxofre antes da combustão do carvão, no entanto, tais métodos são dispendiosos, pois necessitam de condições extremas de temperatura e pressão. Os métodos biológicos de dessulfurização deste combustível fóssil têm demonstrado serem mais eficazes para tal fim. Neste contexto o presente trabalho utilizou bactérias oxidantes de ferro e/ou enxofre, Acidithiobacillus ferrooxidans e Acidithiobacillus thiooxidans a fim de obter uma redução no conteúdo de enxofre pirítico do carvão fornecido pela Carbonífera do Cambuí. Ensaios de biolixiviação em frascos sob agitação foram conduzidos em diferentes condições com a finalidade de acompanhar a cinética de dissolução do enxofre pirítico na amostra mineral. Na fase líquida a evolução dos seguintes parâmetros foi monitorada: pH, Eh e íons ferrosos. A fase sólida foi caracterizada posteriormente através de medidas de difração de raio-X (DRX) e espectroscopia de infravermelho (FTIR). A quantificação parcial do enxofre total foi avaliada utilizando Analisador Preiser Mineco de acordo com as normas ABNT NBR 8295 e suas formas (pirítica, sulfática e orgânica) foram analisadas por normas ASTM. Os ensaios utilizando tais microrganismos obtiveram redução de 44% no teor de enxofre total e de 90% no teor de enxofre pirítico. Como resultado das análises de raio-X observou-se a redução de picos característicos da pirita e o surgimento de uma nova fase cristalina durante o tratamento biológico. Os espectros de infravermelho indicaram que os microrganismos utilizados neste estudo foram capazes de interagir apenas com a fase inorgânica do carvão. Estes ensaios de bancada forneceram parâmetros para um posterior trabalho em escala de bancada utilizando colunas de biolixiviação. / Coal is the most important non-renewable energy source of fossil origin in the world. One of the major problem in using coal as an energy source is the presence of sulfur in the organic and inorganic form (pyritic FeS2). During combustion of coal, SO2 is released in the atmosphere, causing many environmental problems such as the formation of acid rain, beside this sulfur also causes the corrosion of boilers and installations of underground metal pipelines. There are several physical and chemical processes to reduce sulfur in the coal before combustion, however, such methods are very costly, with the use of extreme temperatures and pressures. The biological method for desulfurization of the fossil fuel has proved to be more effective for such purpose. In this context, the present work evaluated the use iron and/or sulfur oxidizing bacteria, Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans in order to obtain a maximum reduction in the pyritic sulfur content of the coal supplied by the Carbonífera Cambuí. For this purpose, the bioleaching tests were performed in shake flasks and conducted under different conditions in order to follow the pyritic sulfur kinetics of dissolution of the mineral sample. In the liquid phase, the following parameters such as pH, Eh and ferrous ions were monitored. The solid phase was characterized subsequently by means of measurements of X-ray diffraction (XRD) and infrared spectroscopy (FTIR). The partial quantification of total sulfur was evaluated using Preiser Mineco analyzer according to ABNT NBR 8295 standards and other forms such as pyritic, sulfatic and organic were analyzed by ASTM. The tests using such microorganisms obtained 44% reduction in total sulfur and 90% pyritic sulfur. The result of ray-X analyzes showed the reduction of characteristic peaks of pyrite and the emergence of a new crystalline phase during biological treatment. Infrared spectra indicated that the microorganisms used in this study were able to interact only with the inorganic phase coal. These bench tests provided parameters for further laboratory scale using bioleaching column.