As células T regulatórias (Tregs) são essenciais para a manutenção da tolerância periférica, prevenção de doenças autoimunes e limitantes nas doenças inflamatórias crônicas. Além disso, essas células exercem um papel fundamental no controle da rejeição de transplantes. Diferentes protocolos mostraram que é possível obter Tregs a partir de células T naive CD4+ in vitro. Para tal, é consenso que o TGF-? e a interleucina-2 (IL-2) são capazes de direcionar as células T naive CD4+ a se tornarem regulatórias após um estímulo antigênico (anti-CD3/CD28). Nosso grupo recentemente notou que, durante a imunomodulação de linfócitos T pelas células estromais mesenquimais (CTMs), estas eram capazes de produzir adenosina que, por sua vez, participa do processo de imunorregulação. Outros trabalhos indicam que as CTMs suprimem a proliferação dos linfócitos T pela geração de Tregs e que as CTMs induzem a geração de Tregs através da regulação negativa da via TCR e da via AKTmTOR. Evidências apontam que a adenosina pode atuar regulando negativamente a via mTOR. Portanto, acredita-se que a adenosina possa participar do processo de geração de Tregs através da modulação da via mTOR. Além disso, estudos recentes indicam que a ativação de receptores de adenosina, mais especificamente A2a, com agentes agonistas, leva ao aumento da produção de células Tregs, enquanto que a utilização de agentes antagonistas destes receptores leva à diminuição da diferenciação de Tregs. Porém, estes estudos mostram a geração de Tregs a partir de células T naive de camundongos. Visto a grande importância das Tregs no contexto imunológico, a produção eficiente de Tregs in vitro tem importância fundamental para o desenvolvimento de novos protocolos terapêuticos para o tratamento de doenças autoimunes e no combate à rejeição de transplantes. Assim, o objetivo central deste trabalho foi avaliar a participação de agonistas e antagonistas de receptores de adenosina na indução de células T regulatórias geradas in vitro (iTreg) pela ativação de células T CD4+ naive isoladas de sangue de cordão umbilical (SCU) humano. Para isso, células mononucleares foram isoladas de bolsas de SCU e as células T naive foram isoladas imunomagnéticamente. Essas células foram ativadas com beads ligadas a anticorpos anti-CD2/CD3/CD28 e cultivadas por cinco dias na presença de IL-2 e diferentes concentrações de drogas agonistas e antagonistas de receptores de adenosina. Em seguida, foram avaliados os principais marcadores de células T regulatorias por meio de citometria de fluxo e o meio de cultura foi coletado ao final da geração para quantificação de citocinas. Além disso, o RNA total foi extraído de todas as condições de cultivo para a análise da expressão de genes envolvidos na geração e desenvolvimento das Tregs, por PCR quantitativo. O potencial de supressão de células T efetoras também foi avaliado. / Regulatory T cells (Tregs) are essential for the maintenance of peripheral tolerance, prevention of autoimmune and limiting diseases in chronic inflammatory diseases. In addition, these cells play a key role in the control of transplant rejection. Different protocols have shown that it is possible to obtain Tregs from naive CD4+ T cells in vitro. To this end, there is consensus that TGF-? and interleukin-2 (IL-2) are capable of directing the naive CD4 + T cells to become regulatory following an antigenic stimulus (anti-CD3/CD28).. Our group recently noted that during the immunomodulation of T lymphocytes by mesenchymal stromal cells (MSCs), they were able to produce adenosine which in turn participates in the immunoregulation process. Other studies indicate that MSCs suppress the proliferation of T lymphocytes by generation of Tregs and that MSCs induce generation of Tregs by downregulation of the TCR pathway and the AKT-mTOR pathway. Evidence indicates that adenosine may act by downregulating the mTOR pathway. Therefore, it is believed that adenosine may participate in the generation of Tregs by modulating the mTOR pathway. In addition, recent studies indicate that activation of adenosine receptors, more specifically A2a, with agonist agents, leads to increased production of Treg cells, whereas the use of antagonistic agents of these receptors leads to a decrease in Treg differentiation.. However, these studies show the generation of Tregs from naive T cells of mice. In view of the great importance of Tregs in the immunological context, the efficient production of Tregs in vitro is of fundamental importance for the development of new therapeutic protocols for the treatment of autoimmune diseases and in the fight against transplant rejection. Thus, the central objective of this study was to evaluate the participation of adenosine receptor agonists and antagonists in induction of regulatory T cells generated in vitro (iTreg) by the activation of naive CD4+ T cells isolated from human umbilical cord blood (SCU). For this, mononuclear cells were isolated from SCU and naive T cells were immunomagnetic isolated. These cells were activated with beads bound to anti-CD2/CD3/CD28 antibodies and cultured for five days in the presence of IL-2 and different concentrations of agonist drugs and antagonists of adenosine receptors. Next, the major regulatory T-cell markers were assessed by flow cytometry and the culture medium was collected at the end of the generation for quantification of cytokines. In addition, total RNA was extracted from all culture conditions for the analysis of the expression of genes involved in the generation and development of Tregs by quantitative PCR. The potential for suppression of effector T cells was also evaluated.

O ATP extracelular atua como um mediador pró-inflamatório e a adenosina tem sido descrita por suas propriedades anti-inflamatórias. O papel desse nucleosídeo no controle da inflamação ocorre principalmente via receptores A2A. As ecto-enzimas responsáveis pelo controle dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares são as ectonucleotidases. Esse grupo de ecto-enzimas é composto pela família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPases), a família das ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfodiesterases (E-NPP) e pela ecto-5'-nucleotidase. Considerando o papel que os nucleotídeos e nucleosídeos exercem durante eventos inflamatórios, e a importância das ectonucleotidases na manutenção dos seus níveis extracelulares, o objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da indução do modelo de endotoxemia sobre as atividades ectonucleotidásicas em diferentes tipos e frações celulares. O envolvimento do receptor A2A sobre esses parâmetros também foi avaliado, através da utilização do agonista específico do receptor A2A, GCS-21680, no intuito de melhor compreender o envolvimento do sistema purinérgico no processo inflamatório. Para a indução do modelo de endotoxemia os ratos foram injetados intraperitonialmente (i.p.) com 2 mg/kg de LPS e os camundongos foram injetados i.p. com 12 mg/kg de LPS e/ou CGS-21680 (0,5 mg/kg, i.p.). As atividades ectonucleotidásicas foram determinadas em plaquetas de ratos, linfócitos de linfonodos mesentéricos de camundongos e preparações de membranas renais de camundongos. A análise da expressão das ectonucleotidases foi realizada através de RT-PCR. Os resultados demonstraram uma diminuição na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP em plaquetas de ratos após a indução da endotoxemia (28%, 28%, 30% e 26%, respectivamente). A contagem e a agregação plaquetária também foram diminuídas (40% e 55%, respectivamente). Em linfócitos de camundongos, houve um aumento na hidrólise de ATP, ADP, AMP e 5'TMP 24 horas após a injeção de LPS (178%, 111%, 207% e 62%, respectivamente) e 48 horas após a indução do modelo (135%, 178%, 121% e 116%, respectivamente). Quando o agonista do receptor A2A de adenosina, CGS-21680, foi co-administrado com o LPS, esse aumento foi revertido para as hidrólises de ATP, AMP e 5'-TMP. Em membranas renais de camundongos, os resultados demonstraram um aumento na hidrólise de ATP e 5'-TMP 48 horas após a injeção de LPS (48% e 47%, respectivamente) e a hidrólise do AMP foi diminuída 24 horas após a indução do modelo (40%). Os níveis extracelulares de ATP e adenosina foram diminuídos nos grupos tratados quando comparados ao controle em preparações de membranas renais. Os resultados deste trabalho indicam que as ectonucleotidases são moduladas pela endotoxemia em diferentes frações biológicas, sugerindo que as alterações observadas são conseqüência da resposta inflamatória. Em linfócitos esse efeito foi revertido pela ativação dos receptores A2A. Esses dados demonstram a interação cruzada entre a ativação dos receptores A2A de adenosina e as enzimas que modulam a produção do agonista desse receptor, bem como que a influência da ativação dos receptores A2A sobre as ectonucleotidases pode ser um dos mecanismos relacionados com as ações anti-inflamatórias e a resposta imune mediada por esse receptor. / Extracellular ATP mainly functions as a proinflammatory mediator and adenosine has been reported to exert anti-inflammatory properties. A role for this nucleoside in the control of inflammation has been suggested acting mainly on adenosine A2A receptors. The ecto-enzymes responsible for the control of extracellular nucleotides and nucleosides levels are ectonucleotidases. This group of ectoenzymes is composed by the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) family, the ecto-pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP) family and the ecto-5’-nucleotidase. Considering the roles that the nucleotides and nucleosides play during inflammatory events, and the importance of ectonucleotidases for the maintenance of extracellular levels of the former, we investigated the effect of endotoxemia model on ectonucleotidase activities in different cells and cellular fractions. The involvement of A2A receptor under these parameters was also analyzed, utilizing CGS-21680, a specific A2A receptor agonist, in order to better understand the involvement of purinergic system in this process. For endotoxemia model induction, rats were injected intraperitoneally (i.p.) with 2 mg/kg LPS and mice were injected with 12 mg/kg and/or 0.5 mg/kg CGS-21680. Nucleotidase activities were determined in rat platelets, mice lymphocytes from mesenteric lymph nodes and mice kidney membrane preparations. Analysis of ectonucleotidase expression was carried out by a semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Results demonstrated a decrease on ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis in rat platelets (28%, 28%, 30% and 26%, respectively), platelet account and aggregation (40% and 55%, respectively) after induction of endotoxemia model. In mice lymphocytes, we observed an increase in ATP, ADP, AMP and 5'TMP hydrolysis 24 hours after LPS injection (178%, 111%, 207% and 62%, respectively) and 48 hours after LPS injection (135%, 178%, 121% and 116%, respectively). When CGS-21680 was administered concomitant with LPS, this increase was reversed for ATP, AMP and 5'-TMP hydrolysis. In kidney membrane preparations of mice, results showed an increase on ATP and 5'-TMP hydrolysis 48 hours after LPS injection (48% and 47%, respectively) and 24 hours after LPS exposure there was a decrease on AMP hydrolysis (40%). The extracellular levels of ATP and adenosine were decrease in treated groups in kidney membrane preparations. These results indicate that endotoxemia modulates ectonucleotidases in different biological fractions, suggesting that these alterations are consequence of inflammatory response. The effect promoted by CGS-21680 in lymphocytes indicates a cross-talk between the A2A activation and the enzymes responsible for adenosine generation, but also that the influence of A2A receptor activation on ectonucleotidases might be one of the mechanisms related with its anti-inflammatory properties.

A asfixia perinatal está entre as principais causas diretas de óbito neonatal, sendo um grande determinante de morbidade e comprometimento neurológicos. Sua origem é associada à inadequada perfusão e oxigenação tecidual. Assim, o tipo de dano causado pela asfixia tem relação com o tempo de duração e com a fase do desenvolvimento fetal. Respostas fisiológicas adaptativas, tais como o direcionamento do fluxo sanguíneo para órgãos vitais e o aumento do metabolismo anaeróbico, nem sempre são suficientes para evitar a ocorrência de alterações significativas nas reservas energéticas, na atividade da enzima Na+/K+-ATPase e na concentração de glutamato extracelular. Fêmeas de ratos Wistar, no 22° dia de prenhes foram submetidas à cesariana para a remoção dos dois cornos uterinos. Naquele com menor número de fetos foi realizada a incisão imediata para obtenção dos animais controles. O outro corno uterino foi isolado e mantido em solução salina a 37°C por 15 min para ocasionar a asfixia intra-uterina. Alguns controles foram decapitados imediatamente (controle agudo) enquanto outros foram estimulados a respirar e mantidos a 34°C, por 60 min, em normóxia (controle com recuperação). Ao término da asfixia, alguns neonatos foram imediatamente decapitados (asfixiado agudo) e os restantes foram mantidos a 34°C, por 60 min, em normóxia (asfixiado com recuperação). No presente estudo, foram determinados os níveis de lactato plasmático, de glicemia, a quantidade de glicogênio no fígado, no músculo esquelético, no córtex cerebral e no hipocampo. Também foram avaliados os níveis de ATP no córtex cerebral e a captação de glutamato no córtex cerebral. A avaliação da atividade da Na+/K+-ATPase foi realizada somente no córtex cerebral, nos sinaptossomas obtidos deste tecido e no hipocampo dos grupos agudo. Os resultados indicam que a asfixia perinatal causou aumento significativo na lactacidemia e na glicemia dos animais asfixiados do grupo agudo e do grupo asfixiado com recuperação. Houve redução significativa na quantidade de glicogênio do fígado e do músculo esquelético dos demais grupos em relação ao grupo controle agudo. No córtex cerebral, foi identificada redução significativa de glicogênio no grupo asfixiado agudo e no grupo asfixiado com recuperação em relação aos respectivos grupos controle. Não foi encontrada redução significativa nos níveis de glicogênio do hipocampo nos grupos asfixiado agudo e com recuperação, em relação aos grupos controle. A concentração de ATP diminuiu significativamente no grupo asfixiado e no grupo asfixiado com recuperação em relação ao controle agudo. Não houve diferença significativa na captação de glutamato, no córtex cerebral dos asfixiados agudo e com recuperação. A atividade da enzima Na+/K+-ATPase não foi alterada significativamente nos grupos asfixiado agudo. Conclui-se que a asfixia perinatal causou alterações no metabolismo dos animais, as quais perduraram após 60 min de recuperação. Os resultados sugerem que o córtex cerebral possui uma grande capacidade adaptativa frente à asfixia, o que poderia explicar a manutenção do transporte de glutamato mesmo com uma redução significativa nos níveis de ATP neste tecido. Estudos adicionais serão necessários para identificar estes mecanismos adaptativos que parecem causar diferentes efeitos após a asfixia no córtex cerebral e no hipocampo. / Perinatal asphyxia is among the major direct causes of neonatal death, being a great determinant of morbidity and neurological impairment. Its origin is associated with inadequate tissue oxygenation and perfusion. Thus, the type of damage caused by asphyxia is related to its duration and stage of fetal development. Physiological responses promote adaptation across the perinatal asphyxia, such as the blood flow’s shunting to vital organs and anaerobic metabolism increasing. However, sometimes adaptive responses are not enough to compensate effects of asphyxia, causing significant changes in energy reserves, Na+/K+-ATPase enzyme activity and glutamate extracellular concentration. Female Wistar rats on day 22° of pregnant were subjected to cesarean section and both uterine horns were removed. Control animals fetuses were obtained through immediate incision of one uterine horn. The other one was isolated and maintained in 0.9 % saline solution at 37°C, for 15 min, to obtain asphyxiated neonates. Some controls were immediately decapitated (acute control), while others were stimulated to breathe and kept at 34°C, for 60 min, in normoxia (control with recovery). At the end of asphyxia, some neonates were immediately decapitated (acute asphyxia) and the remaining were kept at 34°C, for 60 min, in normoxia (asphyxia with recovery). In this study, the levels of lactate, glucose, the amount of glycogen in the liver, skeletal muscle, cerebral cortex and hippocampus were determined. ATP levels so as glutamate uptake in the cerebral cortex were also evaluated. Then, the Na+/K+-ATPase activity assay from acute groups was performed in hippocampal tissue, cerebral cortex and synaptosomes obtained from cerebral cortex. These results indicate that perinatal asphyxia caused in acute asphyxia group and asphyxia with recovery group significant increases plasmatic lactate and glucose. In cerebral cortex, acute asphyxia and asphyxia with recovery group showed significant glycogen reduction compared to respective control groups. Differently, it was not observed in hippocampus. ATP concentrations decreased in acute asphyxia and asphyxia with recovery group compared to acute control. There was no significant difference in glutamate uptake of cerebral cortex in acute asphyxia and asphyxia with recovery. Na+/ K+-ATPase enzyme activity was not altered in acute asphyxia related to acute control group. In conclusion, perinatal asphyxia caused changes in animal metabolism, which persisted after 60 min of recovery. Moreover, cerebral cortex after asphyxia, even with a significant reduction in ATP levels, is more capable to maintain glutamate transport compared to hippocampus. More studies are necessary to identify mechanisms that cause different effects in cerebral cortex and hippocampus.

A hipertensão arterial é um problema de saúde pública no Brasil, pois aproximadamente 20 % da população adulta desenvolve hipertensão essencial, cujas causas ainda não são conhecidas. No entanto, sua gênese pode estar relacionada com disfunção nas áreas do sistema nervoso central (SNC) que regulam o sistema cardiovascular. O núcleo do trato solitário (NTS) e o bulbo ventrolateral são áreas importantes no controle neural da pressão arterial. Os receptores de adenosina A2a (rA2a) são encontrados em todo o SNC e estão relacionados com estudos terapêuticos de diversas doenças. No NTS a estimulação dos rA2a provoca ajustes pontuais em outros sistemas de neurotransmissão, além de diminuir a pressão arterial. A nicotina é uma molécula com uma vasta faixa de efeitos modulatórios em nosso organismo. Entre esses efeitos se destacam a capacidade de interagir com diversos sistemas de neurotransmissão nas áreas do bulbo relacionadas com a regulação da pressão arterial e de antecipar e/ou intensificar o desenvolvimento da hipertensão em sujeitos com pré-disposição genética. Desta forma, o objetivo do presente trabalho é avaliar o efeito modulatório da nicotina sobre o rA2a em cultura mista de neurônios e células gliais da porção dorso-medial do bulbo de ratos geneticamente hipertenso (SHR) e normotensos (WKY). Para isso, utilizaram-se técnicas como a de PCR em tempo real, Western Blotting e análise de ligação do receptor. Nossos resultados demonstraram que: 1) em condição basal células de ratos normotensos apresentam maior ligação do rA2a do que células de ratos hipertensos; 2) tratamento com nicotina resultou na diminuição da ligação do receptor em ambas as cepas, com um efeito de maior magnitude em células de ratos WKY; 3) nas duas linhagens o tratamento com nicotina alterou os níveis protéicos do rA2a, assim como o RNAm do receptor; 4) a linhagem e o tratamento separadamente, como a interação entre ambos influenciaram na expressão do RNAm , níveis protéicos e ligação do rA2a nas células dos ratos WKY e SHR. Por fim, os resultados apresentados aqui indicam que o rA2a em células de ratos hipertensos tem sua função deprimida em comparação com as células de ratos normotensos; e que a nicotina foi capaz de modular o funcionamento do rA2a, o qual pode influenciar no controle da pressão arterial. Esses dados são bastante interessantes, pois abrem novas perspectivas de análise dos mecanismos intracelulares envolvidos na modulação dos rA2a pela nicotina, assim como a importância desse sistema no desenvolvimento da hipertensão / Hypertension is one of the most common worldwide diseases afflicting humans. Because of the associated with morbidity and mortality and the cost to the society, it became an important public health challenge in Brazil. The mechanisms involved in development of hypertension still remain unclear However, hypertension can result from neuronal network imbalance in areas of the central nervous system that control blood pressure. The nucleus tractus solitarius (NTS) plays an important role in cardiovascular control. Within the NTS there are several neurotransmitters and neuromodulatory substances, such as adenosine, which acts on purinoreceptors A2a (A2ar). The A2ar modulates neurotransmission in the NTS and its activation may induce decrease in blood pressure by different mechanisms. Nicotine is a molecule that cross the blood-brain barrier and acts in several areas of central nervous system including the NTS. In this nucleus, nicotine is able to interact with some neurotransmitter systems and contributes for the development of hypertension in subjects with genetic predisposition to this disease. The goal of this study was to analyze the modulatory effects of nicotine on A2ar in cultured neurons and glial cells from medulla oblongata of normotensive (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR). By means of real time PCR, Western Blotting and binding receptor assay. We have demonstrated that in basal condition cells of WKY presents increased binding of A2ar than the cells of SHR. Nicotine treatment induced a decrease in the binding of A2ar in both strains, however, this response was more pronounced in cells of WKY than SHR. Changes in mRNA and protein levels of A2ar was also observed in response to nicotine treatment. The strains and treatment separately, as well as the interaction between them influenced mRNA expression, protein level and binding of A2ar in NTS cells of WKY and SHR rats. Finally, these results show for the first time changes in A2ar mRNA expression, protein level and binding in cells from the medulla oblongata of WKY and SHR rats, as well as, the nicotine modulation upon this system, which might influence cardiovascular control. These data open up new approaches for the study of intracellular mechanisms involved in the modulation of adenosine A2a receptor by nicotine, as well as the importance of this interaction in the development of hypertension.

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La fibril·lació auricular (FA) és l'arritmia cardíaca més freqüent. La mateixa FA genera modificacions fisiològiques i anatòmiques que afavoreixen la seva persistència. La seva presencia degrada la qualitat de vida del pacient i provoca un augment sostingut als gastos públics de salut. De moment, el tractament de la FA passa per l'ús d'antiarrímics que reverteixen el ritme a sinusal i procediments ablatius igualment acompanyats de medicaments antiarrítmics. Però aquests fàrmecs tenen efectes proarrímics a llarg terme en un alt porcentatge de pacients. És per aixó que l'objectiu principal d'aquesta tesi és la millora del coneixement dels mecanismes que porten a la inducció i la perpetuació de la FA. Concretament, aquesta tesi es basa en el paper que juguen els canvis patològics en la regulació del calci intracel·lular en miòcits auriculars humans que contribueixen al desenvolupament de la FA. El nostre laboratori ha sigut el primer a mostrar l'associació de la FA i l'alliberament espontanis de calci, en pacients amb FA. Tanmateix, hem mostrat que l'activació dels receptors d'adenosina A2A (A2A) estimula l'alliberament espontani de calci en miòcits auriculars humans, suggerint que el nivell d'expressió i/o l'activitat d'aquest receptor podrien intervenir a l'arritmogènesis auricular i aquesta tesi es basa en aquest descobriments. Els resultats mostren que la modulació de l'alliberament espontani de calci via PKA regula l'estabilitat de la resposta batec-batec. Així, la inhibició selectiva de PKA o de l'A2AR elimina l'alliberament espontani de calci basal i afavoreix una resposta batec-batec uniforme, mentre que l'activació dels A2AR augmenta l'alliberament espontani de calci afavorint respostes no uniformes. Els resultats apunten al A2AR com una nova diana en el tractament de la FA.Paraules clau: Receptors d'adenosina, fibril·lació auricular, miócits auriculars humans, alternança electro-mecànica. / La fibrilación auricular (FA) es la arritmia cardíaca más frecuente. La FA afecta al 0.4% de la población general y su prevalencia aumenta con la edad, siendo afectados por esta arritmia el 4-5% de las personas mayores de 65 años y el 10% de los mayores de 75 años. Esta arritmia predispone a la trombosis y está asociada con fenómenos embólicos, desarrollo de insuficiencia cardíaca y deterioro de la función ventricular. La misma FA genera modificaciones fisiológicas y anatómicas que favorecen su persistencia: dilatación auricular, fibrosis miofibrilar, acortamiento de los períodos refractarios auriculares y de la velocidad de conducción. Además, su presencia degrada la calidad de vida del paciente y provoca un aumento sostenido en los gastos públicos de salud. Por el momento, el tratamiento para la FA pasa por el uso de antiarrítmicos que la revierten a ritmo sinusal y por procedimientos ablativos que conllevan mucho riesgos y complicaciones: taponamiento cardíaco, estenosis de las venas pulmonares, fístulas atrio-esofágicas, trombo-embolismos, arritmias y además van igualmente acompañados de tratamientos farmacológicos antiarrítmicos. Pero estos fármacos pueden tener efectos proarrítmicos a largo plazo y la FA se vuelve a manifestar en un número elevado de pacientes. Por ello, el objetivo principal de esta tesis doctoral es una mejora del conocimiento de los mecanismos que conducen a la inducción y perpetuación de la FA. Concretamente, esta tesis se centra en el papel que juegan los cambios patológicos en la regulación del calcio intracelular en miocitos auriculares humanos que contribuyen al desarrollo de la FA. Nuestro laboratorio ha sido el primero en mostrar la asociación de la fibrilación auricular a una mayor liberación espontánea de calcio, en miocitos auriculares aislados de pacientes con esta arritmia. Asimismo, recientemente hemos mostrado que la activación de receptores de adenosina A2A (A2AR) estimula la liberación espontánea de calcio en miocitos auriculares humanos, sugiriendo que el nivel de expresión y/o la actividad de este receptor podrían intervenir en la arritmogénesis auricular y los tres estudios experimentales de esta tesis se basan en estos hallazgos.A pesar de las dificultades técnicas y metodológicas que conllevan los estudios con cardiomiocitos humanos, toda la investigación realizada en esta tesis doctoral se ha realizado con miocitos auriculares humanos, para facilitar la traslación de los resultados obtenidos. Asimismo, los estudios se han basado en técnicas electrofisiológicas que permiten analizar los mecanismos que regulan el calcio intracelular de forma cuantitativa, como son las técnicas de patch-clamp y la visualización del calcio intracelular por microscopía confocal. Los resultados muestran que un control de la actividad los A2AR permite controlar la liberación espontánea de calcio en miocitos auriculares humanos. Específicamente, la inhibición de los A2AR reduce la elevada incidencia de liberación espontánea de calcio en pacientes con FA a niveles observados en miocitos de pacientes sin la FA. Además, el manejo de calcio del SR (junto con la ICa) también juega un papel importante en la estabilización de la respuesta latido-latido en miocitos auriculares humanos sometidos a crecientes frecuencias de estimulación. De acuerdo con estos hallazgos, los resultados muestran que la modulación de la liberación espontánea de calcio mediado por PKA regula la estabilidad de la respuesta latido-latido. Así, la inhibición selectiva de la PKA o del A2AR elimina la liberación espontánea de calcio basal y favorece una respuesta uniforme latido-latido, mientras la activación de los A2AR aumenta la liberación espontánea de calcio favoreciendo respuestas latido-latido no uniforme. Conjuntamente, los resultados de esta tesis apuntan al A2AR como una nueva diana molecular en el tratamiento de la FA.Palabras clave: Receptores de adenosina, fibrilación auricular, miocitos auriculares humanos, alternancia electro-mecánica / Atrial fibrillation (AF) is the more frequent arrhythmia. AF affects 0.4 per cent of the general population and its prevalence increases with age, affecting 4-5% of the people older than 65 years and 10% older than 75 years. This arrhythmia predisposes the thrombosis and is associated with phenomena embolism, development of heart failure and ventricular function deterioration. AF also generates physiological and anatomical modifications favoring its persistence: auricular dilation, myofibril fibrosis, shortening of the atrial refractory periods and the velocity of conduction. In addition, AF degrades the quality of life of the patient and causes a sustained increase in public expenditure on health. At this moment, treatment of AF includes the use of antiarrhythmics that reverse back to sinus rhythm and ablative procedures that involve many risks and complications as cardiac tamponade, pulmonary veins stenosis, atrium-esophageal fistulas, thrombus-embolisms, arrhythmias that are usually accompanied by antiarrhythmics drugs. Ironically these drugs can have long-term proarrhythmic effects; resulting in AF manifesting in a large number of patients. Therefore, the main objective of this doctoral thesis is to expand the knowledge of the mechanisms leading to the induction and perpetuation of AF. Specifically, this thesis is focused on the role of the pathological changes in intracellular calcium regulation that contribute to AF development in human atrial myocytes.Our laboratory has been the first to show an association of atrial fibrillation to increased spontaneous calcium release in atrial myocytes isolated from patients with atrial arrhythmias. Moreover, we have recently shown that the activation of adenosine A2A receptors (A2AR) stimulates spontaneous calcium release in human atrial myocytes, suggesting that the level of expression and/or the activity of these receptors might intervene in atrial arrhythmogenesis. The three experimental studies of this thesis are based on these findings. Despite the technical and methodological difficulties that involve studies with human cardiomyocytes, all the investigation carried out in this thesis has been done with atrial human cardiomyocytes, in order to facilitate the translation of the results. Our studies have been based on electrophysiological techniques that allow analysis of the mechanisms that regulate the intracellular calcium on a quantitative basis, specifically using the patch-clamp technique and confocal calcium imaging. The results show that the control of the A2ARs activity can control the spontaneous SR calcium release in human atrial cardiomyocytes. Specifically, the A2AR inhibition reduce the high SR calcium release incidence in patients with AF to the basal levels observed in the myocytes of patients without AF. Moreover, the SR calcium handling (along with ICa) play a main role on the beat-to-beat response stabilization in human atrial myocytes submitted to high stimulation frequencies. According with this findings, the results show that the spontaneous calcium release modulation mediated by PKA regulates the stability of the beat-to-beat response. Effectively, selective PKA or A2AR inhibition eliminates the basal spontaneous calcium release and favors the uniform beat-to-beat response, while A2AR activation increase the spontaneous calcium release that favors non-uniform beat-to-beat responses.Then together, the results of this thesis points to A2AR as a new molecular therapeutic target in AF treatment. Key words: Adenosine receptors, atrial fibrillation, human atrial myocytes, electro-mechanical alternant.

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The levels of these molecules are regulated by ectonucleotidases, especially nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDases) and ecto-5'-nucleotidase, which constitute the extracellular cascade for ATP hydrolysis to adenosine. Adenosine can be subsequently deaminated to inosine by action of adenosine deaminase (ADA). ATP is coreleased with other neurotransmitters, including acetylcholine, and has been demonstrated that adenosine can control the release of acetylcholine. Cholinergic system is characterized by the action of acetylcholine (ACh) on muscarinic and nicotinic receptors. The level of this molecule is regulated by acetylcholinesterase (AChE), which catalyzes degradation of ACh into choline and acetate. Since there are few reports relating these enzyme activities and the action mechanism of benzodiazepines, the aim of this study was evaluated the in vitro and ex vivo effects of classical benzodiazepines, such as diazepam and midazolam, on NTPDase, ecto-5'nucleotidase, ADA, and AChE activities in zebrafish brain and gene expression pattern in treatments that induced changes in enzyme activity in the ex vivo experiments. In order to elucidate whether diazepam or midazolam has direct effects on these enzymes, we performed in vitro experiments. Diazepam, at 500 μM, promoted a decrease on ATP hydrolysis (66%), whereas this drug, at 10-500 μM, reduced ADP hydrolysis (40-54%, respectively). Midazolam also decreased ATP (16-71% for 10-500 μM, respectively) and ADP hydrolysis (48-73% for 250-500 μM, respectively), and ecto-ADA activity (26-27. 5% for 10-500 μM, respectively). Diazepam and midazolam did not induce significant changes on ecto-5´-nucleotidase activity at the concentrations tested. Concerning to AChE activity, 500 μM diazepam promoted a decrease on ACh hydrolysis (19%), whereas midazolam, at 50-500 μM, reduced AChE activity (18-79%, respectively). For ex vivo experiments, diazepam or midazolam exposures did not alter NTPDase activities in zebrafish brain membranes. AMP hydrolysis was decreased in animals treated with of 0. 5 and 1mg/L midazolam (31. 5% and 36. 1%, respectively) when compared to the control group. However, diazepam was unable to alter ecto-5’-nucleotidase. Both drugs significantly decreased the ecto-ADA activity, whereas diazepam and midazolam reduced the adenosine hydrolysis at a concentration of 1. 25 mg/L (30. 85%) and 1 mg/L (32. 8%), respectively. Diazepam did not alter cytosolic-ADA activity; however, the exposure to 0. 1 mg/L midazolam induced a significant increase in cytosolic-ADA (39. 9%) when compared with the control group. The gene expression pattern demonstrated that the CD73 transcript levels were increased (41. 7%) after treatment with 0. 5 mg/L midazolam. Moreover, the changes caused by diazepam and midazolam in the ADA activity are not related to the transcriptional control. Concerning the cholinerg signaling, diazepam decreased ACh hydrolysis at 1. 25 mg/L (30. 7%) when compared to the control group. Similarly, the exposure to 0. 5 mg/L midazolam also changed the enzymatic activity of 9 AChE promoting an increase in the ACh hydrolysis (36. 7%). It is possible to suggest that these drugs can induce a direct effect on the enzyme activities, since we observed a decreased on nucleotide and nucleoside hydrolysis after in vitro exposure. In addition, the alteration on AMP hydrolysis, ADA and AChE activities suggest a modulation of extracellular adenosine and ACh levels induced by benzodiazepine exposure. / Fármacos benzodiazepínicos, como diazepam e midazolam, são muito usados na prática clínica para o tratamento da ansiedade, possuindo propriedades ansiolíticas, hipnóticas e anticonvulsivantes. O uso do zebrafish (Danio rerio) como modelo para avaliar mecanismos farmacológicos tem ganhado grande importância devido ao rápido desenvolvimento e alta sensibilidade a drogas que essa espécie possui. Estudos têm demonstrado que parâmetros comportamentais mostraram-se alterados em zebrafish após tratamento com benzodiazepínicos. Muitos sistemas de neurotransmissão foram identificados nessa espécie, incluindo os sistemas purinérgico e colinérgico. O sistema purinérgico é caracterizado pela ação do ATP e adenosina (ADO) nos purinoreceptores P2 e P1, respectivamente. Os níveis dessas moléculas são regulados pela ação das ectonucleotidases, especialmente as nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (NTPDases) e a ecto-5’-nucleotidase, que catalisam a hidrólise do ATP a adenosina. A adenosina pode ser desaminada a inosina pela ação da adenosina desaminase (ADA). O ATP é coliberado com outros neurotransmissores, entre eles a acetilcolina, e tem sido demonstrado que a adenosina pode controlar a liberação de acetilcolina. O sistema colinérgico é caracterizado pela ação da acetilcolina (ACh) nos receptores muscarínicos e nicotínicos. O nível dessa molécula é regulado pela acetilcolinesterase (AChE), que catalisa a degradação da ACh em colina e acetato. Uma vez que existem poucos relatos relacionando esses sistemas enzimáticos e a ação de fármacos benzodiazepínicos, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito in vitro e ex vivo do tratamento com fármacos benzodiazepínicos, tais como diazepam e midazolam, sobre a atividade das NTPDases, ecto-5'-nucleotidase, ADA and AChE no encéfalo de zebrafish e o padrão de expressão gênica nos tratamentos que induziram alterações na atividade enzimática nos experimentos ex vivo. A fim de elucidar se o diazepam e o midazolam têm efeitos diretos nessas enzimas, experimentos in vitro foram realizados. Na concentração de 500 μM, o diazepam diminuiu a hidrólise de ATP (66%) e, nas concentrações de 10-500 μM, este fármaco reduziu a hidrólise de ADP (40-54%, respectivamente). O midazolam também diminuiu a hidrólise do ATP (16-71% para 10-500 μM, respectivamente), ADP (48-73% para 250-500 μM, respectivamente) e a atividade da ecto-ADA (26-27,5% para 10-500 μM, respectivamente). Diazepam e midazolam não induziram alterações significativas sobre a atividade da ecto-5´-nucleotidase nas concentrações testadas. Com relação à atividade da AChE, o diazepam, 500 μM, promoveu uma diminuição na hidrólise de ACh (19%) e o midazolam, nas concentrações de 50-500 μM, reduziu a atividade da AChE (18-79%, respectivamente). Nos experimentos ex vivo, as exposições ao diazepam e midazolam não alteraram a atividade enzimática das NTPDases em membranas cerebrais de zebrafish. A hidrólise do AMP diminuiu em animais tratados com 0. 5 mg/L e 1 mg/L de midazolam (31. 5% e 36. 1%, respectivamente) quando comparados com o grupo controle. Entretanto, o diazepam foi incapaz de alterar a atividade da ecto-5’-nucleotidase. Ambos os fármacos diminuíram significativamente a atividade da ecto-ADA, sendo que o diazepam e o midazolam reduziram a hidrólise da adenosina na concentração de 1. 25 mg/L (30. 85%) e 1 mg/L (32. 8%), respectivamente. O diazepam não alterou a atividade da ADA citosólica, no entanto a exposição a 0. 1 mg/L de midazolam induziu um significativo aumento na atividade dessa enzima (39. 9%) quando comparado ao grupo controle. O padrão de expressão gênica demonstrou que os níveis 7 de transcritos do CD73 apresentaram-se reduzidos (41,7%) após o tratamento com 0. 5 mg/L de midazolam. Com relação a sinalização colinérgica, diazepam diminuiu a hidrólise da ACh na concentração de 1. 25 mg/L (30. 7%) quando comparado ao grupo controle. Similarmente, a exposição à concentração de 0. 5 mg/L de midazolam também alterou a atividade enzimática da AChE, promovendo um aumento na hidrólise da ACh (36. 7%). É possível sugerir que essas drogas podem induzir um efeito direto na atividade enzimática, uma vez que foi observada uma diminuição na hidrólise de nucleotídeos e nucleosídeos após a exposição in vitro. Além disso, as alterações na hidrólise do AMP e atividade da ADA e da AChE sugerem uma modulação dos níveis extracelulares de adenosina e acetilcolina induzidos pela exposição aos fármacos benzodiazepínicos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000401915-Texto+Completo-0.pdf: 528070 bytes, checksum: d3061dc4db639040f254d5c17da71d31 (MD5) Previous issue date: 2008 / The purinergic system, especially adenosine, can play a role in the pathophysiology of schizophrenia. Activation of adenosine A1R inhibits the release of several neurotransmitters, such as glutamate, dopamine, serotonin and acetylcholine, and decreases neuronal activity by pos-synaptic hyperpolarization. Adenosine deaminase (ADA) paticipates in purine metabolism by converting adenosine into inosine. The most frequent functional polymorphism of ADA (22 G→A) (ADA1 *2) exhibits 20-30% lower enzymatic activity in individuals with the G/A genotype than individuals with the G/G genotype. We evaluated this polymorphism in 152 schizophrenic patients and 111 healthy controls. We observed a significant decrease in frequency of the low-activity ADA1 *2 allele in schizophrenic patients (7 – 4. 6%) relative to controls (13 – 11. 7%, p= 0. 032, OR=2. 6). These results suggest that ADA1 *2 allele associated with low ADA activity, and putatively with higher adenosine levels, is less frequent among schizophrenic patients. / O sistema purinérgico, especialmente a adenosina, pode desempenhar um papel na patofisiologia da esquizofrenia. A ativação dos receptores de adenosina A1 inibe a liberação de vários neurotransmissores como o glutamato, a dopamina, a serotonina e a acetilcolina, e diminui a atividade neuronal pela hiperpolarização pós-sináptica. A adenosina (ADA) participa no metabolismo da adenosina convertendo-a em inosina. O polimorfismo funcional mais freqüente da ADA (22 G→A) (ADA1 *2) exibe 20-30% menos atividade enzimática em indivíduos com o genótipo G/A do que em indivíduos com o genótipo G/G. Esse polimorfismo foi avaliado em 152 pacientes esquizofrênicos e 111 controles saudáveis. Nós observamos uma diminuição significativa na freqüência do alelo de baixa atividade ADA1 *2 em pacientes esquizofrênicos (7 – 4,6%) em relação aos controles (13 – 17%, p= 0,032, OR= 2,6). Esses resultados sugerem que o alelo ADA1 *2 associado à baixa atividade da ADA, e conseqüentemente a altos níveis de adenosina, é menos freqüente entre os pacientes esquizofrênicos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000448604-Texto+Completo-0.pdf: 1148296 bytes, checksum: ca8ff4b1f0199484ac8c3e8b70d970b8 (MD5) Previous issue date: 2013 / According to data from the World Health Organization (WHO), stress affects more than 90% of the world's population and is considered a global epidemy. Stress has become an integral part of human life and organisms are constantly subjected to stressful stimuli that change various physiological processes, representing a risk factor for many diseases, such as cancer, cardiovascular, metabolic, infectious and gastrointestinal deseases and depression. The zebrafish (Danio rerio) has many similarities with mammalian in terms of overall organization and the functioning of their stress regulatory systems. The zebrafish hypothalamic-pituitary-interrenal (HPI), analogous to the mammalian hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA), has been found in zebrafish and the activation of this pathway is essential for the maintenance of vital functions in response to stressful events. Despite extensive knowledge regarding stress responses in mammals, data on the relationship between chronic unpredictable stress and its effects on purinergic signaling is limited. Purinergic signaling is mediated by ATP and adenosine receptor activation through P2 and P1, respectively. The catabolism of extracellular ATP to adenosine is promoted by the ectonucleotidases, such as Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-5 '-nucleotidases (E-5´NT). Adenosine is deaminated by adenosine deaminase (ADA) producing inosine. Thus, these enzymes control the levels of extracellular nucleotides and nucleosides, exerting an influence on purinergic signaling. Considering some models of stress can affect the signalling systems, the objective of this study was to verify whether the unpredictable chronic stress changes ectonucleotidases and adenosine deaminase activities in zebrafish brain. In addition, we analyzed the metabolism of ATP as well as the expression of genes related to ADA, ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi and the effects of agonists and antagonists of adenosine receptors in an unpredictable chronic stress model in zebrafish. Our results demonstrated that there are no changes on ATP (P = 0. 1499), ADP (P = 0. 3615) and AMP (P = 0. 8987) hydrolysis in zebrafish brain membranes submitted to unpredictable chronic stress. In contrast, ecto-ADA activity significantly decreased (26. 8%; 8,164 ± 0. 78 NH3 min − 1 mg− 1 of protein; p 0. 05; n = 5 <) in brain membranes of animals exposed to the unpredictable chronic stress when compared to the control group (11. 15 ± 2. 16 NH3 min − 1 mg − 1 of protein; p 0. 05; n = 5). However, the activity of cytosolic ADA was not changed after the unpredictable chronic stress. Quantitative analysis by RT-qPCR did not show significant changes after chronic unpredictable stress exposure on gene expression in the genes ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi. ATP metabolism in brain membrane preparations of zebrafish in the control group and stressed was measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) and showed a significant increase of adenosine in stressed animals. Considering adenosine A1 receptor agonists have an anxyolitic activity and the A2A receptor antagonists can exert neuroprotective effects, we investigated the effect of administration of an agonist of A1 receptor, N⁶-ciclopentiladenosine (CPA), and an antagonist of A2A receptors, (ZM241385) on behavioral parameters of animals submitted to unpredictable chronic stress to check a possible relationship between the adenosinergic system and the stress. As a result we showed that these compounds have not been able to reverse the anxiogenic effect caused by unpredictable chronic stress. Since adenosine has neuromodulatory and anxiolytic effects, changes in its levels could play a role in counteracting the stress, which could be related to a compensatory mechanism in order to restore the homeostasis. / De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), atualmente o estresse afeta mais de 90% da população mundial, sendo considerado uma epidemia global. O estresse tornou-se parte integrante da vida humana e os organismos são constantemente submetidos a estímulos estressantes que alteram vários processos fisiológicos, sendo um fator de risco para diversas patologias, como câncer, doenças cardiovasculares, metabólicas, infecciosas, gastrointestinais e depressão. O peixe-zebra (Danio rerio) tem muitas semelhanças com mamíferos em termos de organização geral e o funcionamento dos respectivos sistemas reguladores do estresse. O eixo hipotálamo-pituitária-interrenal (HPI), um sistema análogo ao eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA), foi descrito em zebrafish e a ativação desta via é essencial para a manutenção das funções vitais como resposta a eventos estressantes. Apesar do amplo conhecimento das respostas do estresse em mamíferos, os dados sobre a relação entre o estresse crônico imprevisível e seus efeitos na sinalização purinérgica são limitados. A sinalização purinérgica é mediada por ATP e adenosina por meio da ativação dos receptores P2 e P1, respectivamente. O catabolismo de ATP extracelular até adenosina é promovido pelas ectonucleotidases, como as Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (E-NTPDases) e Ecto-5’- nucleotidases (E-5´NT). A adenosina produzida pode ser desaminada pela adenosina desaminase (ADA), produzindo inosina. Assim, estas enzimas controlam os níveis de nucleosídeos e nucleotídeos extracelulares, exercendo uma influência na sinalização purinérgica. Considerando que alguns modelos de estresse podem afetar os sistemas de sinalização, o objetivo deste estudo foi verificar se o estresse crônico imprevisível altera as atividades ectonucleotidásicas e adenosina desaminase em cérebro de zebrafish. Além disso, analisamos o metabolismo do ATP, bem como a expressão de genes relacionados à ADA, ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi e os efeitos de agonistas e antagonistas de receptores de adenosina em zebrafish submetidos a um modelo de estresse crônico imprevisível. Nossos resultados demonstraram que não há alterações na hidrólise de ATP (P = 0. 1499), ADP (P = 0. 3615) e AMP (P = 0. 8987) em membranas cerebrais de zebrafish submetidos ao estresse crônico imprevisível. Em contraste, a atividade da ecto- ADA diminuiu significativamente (26,8%; 8. 164 ± 0,78 NH3 min−1 mg−1 de proteína; p < 0,05; n = 5) em membranas de cérebro de animais expostos ao estresse crônico imprevisível quando comparado ao grupo controle (11. 15 ± 2,16 NH3 min−1 mg−1 de proteína; p < 0,05; n = 5). No entanto, a atividade da ADA citosólica não foi alterada. A análise quantitativa por RT-qPCR não apresentou alterações significativas após a exposição do estresse crônico imprevisível na expressão gênica nos genes ada1, ada2. 1, ada2. 2, adaL, adaasi. O metabolismo do ATP em preparações de membrana de cérebro de zebrafish no grupo controle e estressado foi medido por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e mostrou um aumento significativo de adenosina nos animais estressados. Considerando que os agonistas de receptores A1 têm uma atividade ansiolítica e os antagonistas dos receptores A2A podem exercer efeitos neuroprotetores, investigamos o efeito da administração de um agonista do receptor A1, N⁶-ciclopentiladenosina (CPA), e de um antagonista de receptores A2A, (ZM241385) em parâmetros comportamentais de animais submetidos ao estresse crônico imprevisível, para verificar uma possível relação entre o sistema adenosinérgico e o estresse. Como resultado, observamos que esses compostos não foram capazes de reverter o efeito ansiogênico causado pelo estresse crônico imprevisível. Uma vez que a adenosina tem efeitos neuromodulatórios, as alterações nos níveis de adenosina podem desempenhar um papel nos mecanismos relacionados ao estresse, representando um mecanismo de compensação a fim de restaurar a homeostase.

Na presente tese, nós estudamos os efeitos do estresse crônico repetido (CRS) e do estresse crônico imprevisível moderado (UCMS) sobre comportamentos do tipo- ansioso e do tipo- depressivo na tentativa de estabelecer possíveis diferenças comportamentais sobre os modelos de estresse. Além disso, verificar os efeitos de ambos os modelos sobre parâmetros bioquímicos como a atividade da enzima Na+, K+-ATPase e o binding dos receptores de adenosina A1 (A1Rs) e A2A (A2ARs) no hipocampo e estriado, respectivamente, de ratos machos adultos Wistar. Nos dois trabalhos apresentados neste estudo, os animais foram submetidos ao CRS e ao UCMS durante 40 dias e subsequentemente foram avaliados em uma série de tarefas comportamentais para estudo de comportamentos do tipo- ansioso e do tipo- depressivo. O primeiro artigo demonstrou que ratos submetidos ao CRS e UCMS apresentaram comportamento do tipo- ansioso, analisado pela diminuição na permanência nos quadrados centrais na tarefa do campo aberto. Além disso, foi demonstrada uma diminuição da atividade da enzima Na+, K+-ATPase na amígdala desses ratos, não sendo, todavia, observado alteração do imunoconteúdo da enzima. Adicionalmente, com o objetivo de elucidar as possíveis causas da diminuição da atividade da Na+, K+-ATPase,medimos diversos parâmetros de estresse oxidativo, porém não obtivemos qualquer diferença significativa nessas medidas, capaz de explicar, ao menos em parte, uma possível causa dessa diminuição da Na+, K+-ATPase na amígdala dos ratos estressados cronicamente. No segundo trabalho, somente o UCMS foi capaz de induzir comportamento do tipo- depressivo, verificado pelo aumento no tempo de imobilidade no teste do nado forçado. Este comportamento tem sido interpretado como desamparo aprendido. Desse modo, utilizamos somente o UCMS como variável para o consumo de solução de sacarose 1%. Este consumo foi monitorado semanalmente, durante oito semanas. De fato, UCMS foi capaz de induzir diminuição no consumo de solução de sacarose, comportamento entendido como anedonia, perda de motivação em situações prazerosas. Uma vez estabelecidas as diferenças comportamentais entre CRS e UCMS, verificamos alterações no sisterma adenosinérgico ao analisarmos os A1Rs e os A2ARs. Demonstramos uma similaridade no binding de A1Rs, aumentando Bmax com aumento do imunoconteúdo dos A1Rs tanto no CRS quanto no UCMS. Interessantemente, quanto ao binding de A2ARs, o grupo UCMS mostrou-se diferente do CRS, com aumento de Bmax para A2AR. Em suma, concluímos que os dois modelos de estresse crônico causaram alterações similares na atividade da Na+, K+-ATPase na amígdala de ratos, e ambos os grupos estressados aumentaram o comportamento do tipo- ansioso e sensibilização (up-regulation) de A1Rs no hipocampo. Por outro lado, somente UCMS foi capaz de induzir desamparo aprendido, anedonia e aumento no binding de A2ARs no estriado. Enfim, acreditamos que estas alterações neuroquímicas e comportamentais expostas na presente tese possam servir no refinamento do conhecimento básico para posteriores interesses no melhoramento de terapias farmacológicas sobre psicopatologias. / The aim of this dissertation was to study the effects of Chronic Restraint Stress (CRS) and Unpredictable Chronic Mild Stress (UCMS) upon anxiety-like and depressive-like behaviors in order to establish possible behavioral differences between CRS and UCMS. In addition, we aimed to verify effects of both stress models upon biochemical parameters such as Na+, K+-ATPase activity and binding of the A1 (A1Rs) e A2A (A2ARs) adenosine receptors in hippocampus and striatum, respectively, in adult male Wistar rats. In all studies, the animals were submitted to CRS and UCMS during 40 days; the control group was no submitted to any kind of stress, and subsequently all groups were submitted to behavioral tasks to evaluate anxiety-like and depressive-like behaviors. The first paper demonstrated that both stress models (CRS and UCMS) were able to increase anxiety-like behavior evaluated as the time in the central area of the open field task. Additionally, there was decreased Na+, K+-ATPase activity in amygdala of stressed rats. Besides that, there were no alterations in α 3 subunit immuncontent. We tried next to elucidate possible causes for the decreased Na+, K+-ATPase activity, and we measured several oxidative stress parameters, however no important differences were detected in this analysis, that could explain, at least in part, the possible causes of a decrease in Na+, K+-ATPase activity in amygdala of chronically stressed rats. On the other hand, only the UCMS group was able to induce depressive-like behavior, displayed by increased immobility time on the forced swimming test, which has been interpreted as learning helplessness. Therefore, we next studied if UCMS could lead to altered consumption of sucrose 1%, and this consumption was monitored weekly during eight weeks. Indeed, UCMS was able to induce decreased consumption of sucrose solution, a response that was considered as anhedonia, lost of motivation for pleasant situations. Once these behavioral differences between CRS and UCMS were detected, we studied possible alterations on the adenosinergic system, analyzing A1Rs e A2ARs We showed similarities on the effects of both types of chronic stress on A1Rs binding, since both increased Bmax as well as A1Rs immunocontent. Interestingly, when we analyzed A2ARs binding, only UCMS increased A2ARs Bmax. Finally, we concluded that CRS and UCMS were capable of inducing similar alterations in Na+, K+-ATPase activity in amygdala of rats. Additionally, both stressed groups increased anxiety-like behavior and showed up-regulation in hippocampal A1Rs. Besides, UCMS was able to induce learned helplessness, anhedonia and up-regulation in striatal A2ARs. It is expected that the behavioral and biochemical changes presented in this dissertation could refine the basic knowledge in this area, improving pharmacological therapies to treat psychopathologies.