A obesidade tem aumentado dramaticamente nos últimos anos, tornando-se o maior fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, vários tipos de câncer, e também do Diabetes mellitus tipo 2 (DM 2). A associação da obesidade com o desenvolvimento do DM 2 pode ser explicada, em parte, pela secreção alterada pelo tecido adiposo de adipocinas, como a adiponectina, um hormônio com propriedades antiinflamatórias e de sensibilização à insulina. O excesso do tecido adiposo regula negativamente a secreção de adiponectina, o que ocorre de 10 a 20 anos antes da hiperglicemia crônica, fazendo com que este hormônio seja um bom indicador para o diagnóstico preditivo de DM 2. A concentração de adiponectina em plasma é usualmente aferida por ELISA, método não amplamente utilizado devido ao seu alto preço, necessidade de pessoal qualificado e material e, dessa maneira, ainda praticamente inacessível à grande parcela da população. Sendo assim, o desenvolvimento de novas metodologias e de ferramentas de diagnóstico confiáveis e de baixo custo (que possam ser implementados pelo Sistema Único de Saúde SUS) é imprescindível. Aqui, desenvolvemos um biossensor simples e de baixo custo para detecção de adiponectina baseado na espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) ou voltametría cíclica (CV) usando plataformas nanoestruturadas contendo receptores transmembrana de adiponectina (AdipoR1 e AdipoR2) ou anticorpos anti-AdipoQ imobilizados em eletrodos de ouro. Os melhores resultados foram obtidos através do uso dos receptores AdipoR1/R2 em conjunto com CV. Neste caso, os biossensores foram capazes de detectar concentrações de adiponectina tão baixas quanto 7 nmol L-1 com uma faixa linear entre 0,01 a 0,75 mol L-1 de adiponectina, R²=0,992. O dispositivo apresentou ótima seletividade, estabilidade e reprodutibilidade (ca. 1,7% para n=3). Além disso, em amostras de plasma humano, o biossensor obteve resultados muito próximos aos obtidos pelo método pardão ELISA, com desvio de 14%. Esperamos que este estudo propicie maior acessibilidade ao diagnóstico preditivo do DM 2 através de dispositivos mais baratos, rápidos e portáteis e que um maior número indivíduos possam ser alertados e orientados, evitando o desenvolvimento posterior da doença. / Obesity has increased dramatically in the last few years, becoming the biggest risk factor for development of cardiovascular diseases, several types of cancer and also the type 2 diabetes mellitus (DM 2). The association between obesity and DM 2 can be partially explained by the altered secretion of adiponectin hormone by the adipose tissue, which presents anti-inflammatory and insulin sensitizing properties. The excess of adipose tissue regulates negatively adiponectin secretion, which occurs 10 to 20 years before chronic hyperglycemia, making this hormone a great biomarker for predictive DM 2 diagnosis. Adiponectin plasma concentration is usually measured by ELISA, a method not widely used due to its high cost, personal and material demand, being, therefore, not accessible to part of the population. Therefore, the development of new diagnostic methodologies and tools trustable and low-cost (that can be implemented by Sistema Único de Saúde SUS) is crucial. Here we developed a simple and low-cost biosensor for adiponectin detection based on electrochemical impedance spectroscopy (EIS) or cyclic voltammetry (CV) using nanostructured platforms containing adiponectin transmembrane receptors (AdipoR1 and AdipoR2) or anti-AdipoQ antibodies immobilized on gold electrodes. The best results were achieved using AdipoR1/R2 receptors among with CV. In this case, biosensors were able to detect adiponectin at concentrations down to 7 nmol L-1 in a linear detection range from 0.01 to 0.75 mol L-1 of adiponectin, R²=0.992. The device displayed great selectivity, stability and reproducibility (ca. 1.7% for n=3). For human plasma samples, analyses using the biosensor and the ELISA technique presented similar results, with deviations of 14%. Therefore, we expect that this study leads to a greater accessibility to predictive DM 2 diagnoses through cheaper, faster and portable devices, so that a higher number of patients may be alerted and oriented, avoiding further disease development.

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Dissertation (Ph.D.).--University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at San Antonio, 2006. / Vita. Includes bibliographical references.

A obesidade tem aumentado dramaticamente nos últimos anos, tornando-se o maior fator de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, vários tipos de câncer, e também do Diabetes mellitus tipo 2 (DM 2). A associação da obesidade com o desenvolvimento do DM 2 pode ser explicada, em parte, pela secreção alterada pelo tecido adiposo de adipocinas, como a adiponectina, um hormônio com propriedades antiinflamatórias e de sensibilização à insulina. O excesso do tecido adiposo regula negativamente a secreção de adiponectina, o que ocorre de 10 a 20 anos antes da hiperglicemia crônica, fazendo com que este hormônio seja um bom indicador para o diagnóstico preditivo de DM 2. A concentração de adiponectina em plasma é usualmente aferida por ELISA, método não amplamente utilizado devido ao seu alto preço, necessidade de pessoal qualificado e material e, dessa maneira, ainda praticamente inacessível à grande parcela da população. Sendo assim, o desenvolvimento de novas metodologias e de ferramentas de diagnóstico confiáveis e de baixo custo (que possam ser implementados pelo Sistema Único de Saúde SUS) é imprescindível. Aqui, desenvolvemos um biossensor simples e de baixo custo para detecção de adiponectina baseado na espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) ou voltametría cíclica (CV) usando plataformas nanoestruturadas contendo receptores transmembrana de adiponectina (AdipoR1 e AdipoR2) ou anticorpos anti-AdipoQ imobilizados em eletrodos de ouro. Os melhores resultados foram obtidos através do uso dos receptores AdipoR1/R2 em conjunto com CV. Neste caso, os biossensores foram capazes de detectar concentrações de adiponectina tão baixas quanto 7 nmol L-1 com uma faixa linear entre 0,01 a 0,75 mol L-1 de adiponectina, R²=0,992. O dispositivo apresentou ótima seletividade, estabilidade e reprodutibilidade (ca. 1,7% para n=3). Além disso, em amostras de plasma humano, o biossensor obteve resultados muito próximos aos obtidos pelo método pardão ELISA, com desvio de 14%. Esperamos que este estudo propicie maior acessibilidade ao diagnóstico preditivo do DM 2 através de dispositivos mais baratos, rápidos e portáteis e que um maior número indivíduos possam ser alertados e orientados, evitando o desenvolvimento posterior da doença. / Obesity has increased dramatically in the last few years, becoming the biggest risk factor for development of cardiovascular diseases, several types of cancer and also the type 2 diabetes mellitus (DM 2). The association between obesity and DM 2 can be partially explained by the altered secretion of adiponectin hormone by the adipose tissue, which presents anti-inflammatory and insulin sensitizing properties. The excess of adipose tissue regulates negatively adiponectin secretion, which occurs 10 to 20 years before chronic hyperglycemia, making this hormone a great biomarker for predictive DM 2 diagnosis. Adiponectin plasma concentration is usually measured by ELISA, a method not widely used due to its high cost, personal and material demand, being, therefore, not accessible to part of the population. Therefore, the development of new diagnostic methodologies and tools trustable and low-cost (that can be implemented by Sistema Único de Saúde SUS) is crucial. Here we developed a simple and low-cost biosensor for adiponectin detection based on electrochemical impedance spectroscopy (EIS) or cyclic voltammetry (CV) using nanostructured platforms containing adiponectin transmembrane receptors (AdipoR1 and AdipoR2) or anti-AdipoQ antibodies immobilized on gold electrodes. The best results were achieved using AdipoR1/R2 receptors among with CV. In this case, biosensors were able to detect adiponectin at concentrations down to 7 nmol L-1 in a linear detection range from 0.01 to 0.75 mol L-1 of adiponectin, R²=0.992. The device displayed great selectivity, stability and reproducibility (ca. 1.7% for n=3). For human plasma samples, analyses using the biosensor and the ELISA technique presented similar results, with deviations of 14%. Therefore, we expect that this study leads to a greater accessibility to predictive DM 2 diagnoses through cheaper, faster and portable devices, so that a higher number of patients may be alerted and oriented, avoiding further disease development.

Orientador: Licio Augusto Velloso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T18:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AndressaCoopedos_M.pdf: 4539361 bytes, checksum: 98f2b9b5765c3bf52139e43d7a347ed0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A adiponectina é uma adipocina que circula no plasma em altas concentrações desempenhando um papel potencializador da ação da insulina e reduzindo a resistência a esse hormônio em humanos e em modelos experimentais de obesidade. Em paralelo às suas clássicas ações em tecidos periféricos, a insulina desempenha uma importante função como controladora da fome e da termogênese ao agir em conjunto com a leptina no sistema nervoso central. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos fisiológicos e os mecanismos moleculares de ação da adiponectina no hipotálamo. Especialmente, avaliou-se a sua capacidade de modular vias importantes de sinalização celular envolvidas no controle da fome e da termogênese. Inicialmente a presença dos receptores AdipoR1 e AdipoR2 foi detectada predominantemente nos núcleos arqueado e lateral do hipotálamo. A seguir, observou-se que em ratos tratados por via intracerebroventricular a adiponectina promoveu uma redução de aproximadamente 40 % da ingestão alimentar, o que foi acompanhado pelo aumento da fosforilação em tirosina do IRS1/2, aumento da fosforilação em serina da Akt e FOXO1, da fosforilação em tirosina da ERK, assim como pela ativação da via JAK/STAT. Estes efeitos foram mediados pelo receptor AdipoR1, pois após sua inibição através de injeções intracerebroventriculares de oligonucleotídeos antisenso os efeitos descritos acima foram revertidos, enquanto o bloqueio do receptor AdipoR2 foi ineficaz em neutralizar os efeitos da adiponectina. Assim, conclui-se que a adiponectina, atuando predominantemente através do receptor AdipoR1, diminui a ingestão alimentar e ativa vias de sinalização classicamente envolvidas com a transdução dos sinais da insulina e da leptina / Abstract: The adipokine adiponectin is present in high concentration in the bloodstream and acts to enhance insulin actions, partially reverting insulin resistance in humans and in animal models of obesity. In parallel to its classical peripheral effects, insulin acts in concert with leptin to control food intake and thermogenesis. The objective of the present study was to determine the physiological outcomes and the molecular mechanisms of action of adiponectin in the hypothalamus. Initially, the expressions of AdipoR1 and AdipoR2 were mapped to the arcuate and lateral hypothalamic nuclei. The intracerebroventricular injection of adiponectin promoted a 40% reduction of spontaneous food intake. This was accompanied by the increased tyrosine phosphorylation of IRS1/2 and ERK, increased serine phosphorylation of Akt and FOXO1 and by the activation of JAK/STAT signaling. These effects were mediated by AdipoR1 since the inhibition of its expression by intracerebroventricular treatment with a specific antisense oligonucleotide completely reversed the effects described above, while the intracerebroventricular treatment with a specific antisense oligonucleotide to AdipoR2 was ineffective to modify the hypothalamic actions of adiponectin. Thus, we conclude that adiponectin acts predominantly through AdipoR1 in the hypothalamus to control food intake and to activate signal transduction through elements classically involved in insulin and leptin signaling / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

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Adiponectin, a hormone that homo-oligomerizes into trimer, hexamer, or higher molecular weight (HMW) species, is involved in maintaining insulin sensitivity in muscle and liver. Interestingly, its functions appear to be oligomer-specific. Recent data suggest that HMW levels are decreased in obesity and insulin resistance, although, the cause for this decrease is not known. Impaired assembly to the octadecamer represents one possible reason for decreased HMW adiponectin in insulin resistance and type 2 diabetes, but mechanisms by which HMW adiponectin assembles are unknown. This dissertation discusses the progress that we have made regarding formation of HMW adiponectin in vitro.I found that disulfide bonds are important in the assembly process to octadecameric adiponectin, but are not required for stability of the octadecamer itself. We showed that hydrogen peroxide accelerated oligomerization to the octadecamer through formation of disulfide bonds, while alkylation of the cysteines led to inhibition of both oligomerization and disulfide bond formation. Using comparative native/denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), dynamic light scattering, and tandem mass spectrometry, we demonstrated that octadecamer is stable in the absence of disulfide bonds by using multiple biochemical and biophysical assays. In addition, oxidized adiponectin oligomerizes to octadecamer far slower than reduced adiponectin. To further evaluate the role of disulfide bonds in the formation to octadecamer, we analyzed the role of reduction potential on adiponectin oligomerization. We observed that under immediate oxidizing conditions, hexamers and trimers form. Oxidized hexamer can form HMW adiponectin through disulfide bond rearrangement using beta-mercaptoethanol (βME) or increasing the total concentration of glutathione under oxidizing conditions. To further understand the role of disulfide bonds, we showed that zinc increased the oligomerization to octadecamer. This effect was associated with decreased initial disulfide bonding during the assembly to the octadecamer. In summary, these data suggest the rate of disulfide bond formation and the ability to undergo disulfide bond isomerization are important in the oligomerization process of HMW adiponectin.