Les leucémies aigües se caractérisent par une prolifération incontrôlée et par l'augmentation accrue de cellules hématopoïétiques immatures dans la circulation sanguine conduisant à l'infiltration de nombreux organes. Un certain nombre de mécanismes tels que la protéolyse matricielle, l'adhérence cellulaire et l'angiogénèse participent à ce processus d'infiltration extramédullaire et favorisent l'apparition de rechute suite au traitement chimio-thérapeutique. Notre projet s'intéresse à l'éthoxyfagaronine, une benzo(c)phénantridine dérivée de la fagaronine. Au cours de notre étude, nous avons mis en évidence la capacité de l'Etxfag à réduire le potentiel invasif des cellules L1210 impliquant une diminution de l'expression de la MT-MMP à la membrane plasmique ainsi qu'une inhibition du système activateur du plasminogène. Nous mettons également en évidence la capacité de l'Etxfag à diminuer l'adhérence des cellules L1210 au peptide de fibronectine WQPPRARI. Cette diminution implique une déstructuration des radeaux lipidiques empêchant le clustering des intégrines beta1 et leur interaction avec le peptide de fibronectine. Nous montrons également la diminution de l'activation des voies de signalisation dépendantes des intégrines telles que FAK, PYK2 et la PI3-kinase. Notre étude a également porté sur les effets anti-angiogéniques de l'Extfag. Nous montrons la capacité de l'Extfag à réduire l'angiogénèse par l'utilisation de modèle in vitro, ex vivo et in vivo. Cet effet anti-angiogénique semble être lié à une altération des propriétés migratoires des cellules endothéliales. L'ensemble de ces résultats souligne le potentiel anti-leucémique de l'Extfag qui pourrait représenter un nouvel agent chimio-thérapeutique capable de prévenir la dissémination des cellules leucémiques. / Acute leukemias are characterized by uncontrolled proliferation and increased immature hematopoietic cells in the bloodstream leading to the infiltration of many organs. A number of mechanisms such as matrix proteolysis, cell adhesion and angiogenesis are involved in extramedullary infiltration process and promote the appearance of relapse after chemotherapeutic treatment. Our project focuses on the ethoxyfagaronine (Extfag), a benzo(c)phenanthridine derivative of fagaronine. In our study, we demonstrated the ability of the Extfag to reduce the invasive potential of L1210 cells by decreasing MT1-MMP expression to the plasma membrane and by inhibiting the plasminogen activator system. We also demonstrated the ability of Extfag to reduce the adhesion of L1210 cells to fibronectin peptide WQPPRARI. This reduction implies a disorganization of lipid rafts preventing clustering of beta1 integrins and their interaction with fibronectin peptide. We also have shown a decrease of integrin-dependent signaling pathways activation such as FAK, PYK2 and PI3-kinase. We have also studied the anti-angiogenic effects of Extfag. We have shown the ability of the Extfag to reduce angiogenesis by using in vitro, ex vivo and in vivo model. This antiangiogenic effect seems to be related to altered migratory properties of endothelial cells. Taken together, these results highlight the anti-leukemic potential of Extfag which could represent a new chemotherapeutic agent capable of preventing leukemic cells dissemination.

Depuis 2011, des mutations hétérozygotes germinales du gène GATA2 ont été identifiées chez des patients et familles, associées à des maladies hématologiques (myélodysplasie (MDS), leucémie aiguë myéloblastique (LAM)), immunologiques (déficit en cellules B, NK et monocytes (DMLC syndrome)) et vasculaires (syndrome d'Emberger, associant MDS et lymphœdème) 1-3. Le gène GATA2 code pour un facteur de transcription comportant 2 doigts de zinc, essentiel dans la régulation de la prolifération et de la différenciation des cellules progénitrices et des cellules souches hématopoïétiques (CSH). De nombreuses mutations différentes du gène GATA2 ont été identifiées (mutations ponctuelles non-sens ou faux sens, larges délétions, délétions focales d'un enhancer dans l'intron 4) sans claire corrélation entre le génotype et le phénotype. Nous avons d'abord retrouvé, par séquençage des phases codantes (exome) au sein d'une famille de 4 patients suivis à Toulouse, une mutation GATA2 R396Q. Dans un second temps, l'analyse d'une cohorte nationale a permis d'identifier des patients porteurs de mutations GATA2 présentant des phénotypes cliniques de type DMLC, LAM et/ou MDS 4. Actuellement, plus de 80 patients ont été identifiés au niveau national. Au niveau fonctionnel, nous avons initié l'analyse de 2 mutations ayant des conséquences clairement distinctes : la mutation R204X qui conduit à un codon stop dans le domaine précédant le premier doigt de zinc et la mutation ponctuelle R396Q, faux sens, située à la fin du deuxième doigt de zinc. Les modèles de différenciation in vitro en milieu semi-solide à partir de progéniteurs hématopoïétiques transduits par un vecteur rétroviral ont montré que les cellules transduites avec le mutant R396Q restent bloquées à un stade précoce de différenciation granulo-monocytaire, confirmé par l'analyse cytologique (aspect de myéloblastes). Le mutant R204X ne montre aucun effet différentiel en comparaison des cellules transduites par GATA2 sauvage. Le mutant R396Q, à la différence du mutant R204X, peut induire une transformation leucémique des cellules in vitro lors de réensemencements sériels des progéniteurs transduits. Ces cellules peuvent être cultivées indéfiniment en milieu liquide sans cytokines, initiant une lignée leucémique. La localisation cellulaire de ces 2 protéines mutantes est distincte, nucléaire pour le mutant R396Q (identique à la protéine normale) et cytoplasmique pour le mutant R204X par perte probable du signal de localisation nucléaire. L'analyse transcriptomique a retrouvé un ensemble de gènes différentiellement exprimés entre le mutant R396Q et le gène sauvage. Différents modèles animaux sont développés. Deux modèles murins, un de reconstitution hématopoïétique après transduction et un modèle knock-in inductible, sont en cours. La première expérience de reconstitution hématopoïétique n'a pas permis de mettre en évidence de phénotype leucémique après 6 mois de suivi, par probable rétention intramédullaire et différenciation terminale des cellules transduites. Nous avons également initié une collaboration permettant d'analyser l'effet des mutations de GATA2 ou équivalents ontogéniques (serpent, pannier) dans la drosophile. Les protéines GATA sont ainsi très conservées au cours de l'évolution et dans la drosophile, les protéines de la famille GATA ont un rôle essentiel dans la différenciation du système hématopoïétique de cet animal. / Since 2011, heterozygous germline GATA2 mutations have been identified in patients and families associated with hematological (myelodysplasia (MDS), acute myelogenous leukemia (AML)), immunological (B cells, NK cells and monocytes deficiency (DMLC syndrome)) and vascular diseases (Emberger syndrome, combining MDS and lymphedema) 1-3. The GATA2 gene encodes a transcription factor containing two zinc fingers critical for the regulation of the proliferation and differentiation of progenitor and hematopoietic stem cells (HSCs). Many different GATA2 mutations were identified (nonsense or missense point mutations, large deletions, focal deletions of an enhancer in intron 4) without clear correlation between genotype and phenotype. We first identified a R396Q mutation of GATA2 by sequencing the coding frames (exome) of cells in a family of 4 patients followed in Toulouse. Then the analysis of a national cohort identified additional patients carrying GATA2 mutations with various clinical phenotypes such as DMLC, AML and/or MDS 4. Currently, over 80 patients have been identified at the national level. Functionally, we initiated the analysis of 2 specific mutations with very distinct consequences: R204X a mutation leading to a stop codon before the first zinc finger and the R396Q a missense mutation located at the end of the second zinc finger. In vitro differentiation in semi-solid medium of hematopoietic progenitors transduced with a retroviral vector have shown that the cells transduced with the mutant R396Q remain blocked at an early stage of granulo-monocytic differentiation confirmed by cytological analysis (myeloblasts). The R204X mutant shows no differential effect compared to cells transduced with wild type GATA2. The R396Q mutant, unlike the R204X, can induce leukemic transformation of cells in vitro after serial re-seeding of transduced progenitors. These cells may be grown in liquid media without cytokines indefinitely, initiating a leukemia cell line. The cellular localization of these two mutant proteins is distinct, nuclear for the R396Q mutant (identical to the wild type protein) and cytoplasmic for the R204X mutant by probable loss of the nuclear localization signal. Transcriptomic analyses have shown differential gene expression between R396Q mutant and the normal gene. Various animal models are developed. Two mice models, one of hematopoietic reconstitution after retroviral transduction and one inducible knock-in model, are ongoing. The first hematopoietic reconstitution experiment failed to demonstrate leukemic phenotype after 6 months of follow-up, likely by intramedullary retention and terminal differentiation of transduced cells. We have also initiated collaboration to analyze the effect of mutations of GATA2 or equivalent ontogenetic genes (serpent, pannier) in Drosophila. GATA proteins are very well conserved during evolution and in Drosophila, the GATA family proteins have a critical role in the differentiation of the hematopoietic system.

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont un ensemble d’hémopathies clonales de la cellule souche. Ils touchent les sujets âgés et se caractérisent par une hématopoïèse inefficace, une différenciation anormale et une transformation fréquente en leucémie aiguë myéloblastique (LAM). La prise en charge thérapeutique a considérablement évolué ces dix dernières années, principalement avec l’arrivée de la 5-azacytidine (Aza) dans les SMD de haut risque. Malheureusement, il existe fréquemment un échec ou une perte de réponse rapide au traitement responsable d’une survie médiane globale de seulement quelques mois. La compréhension des mécanismes d’action des agents hypométhylants, la mise en évidence des facteurs biologiques impliqués dans la résistance à l’Aza ou encore l’identification de nouvelles associations de molécules constitue donc un enjeu majeur. Plusieurs équipes, dont la nôtre, ont démontré que l’erlotinib (Erlo) (inhibiteur de l’activité kinase de l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)) possède des effets antinéoplasiques dans les SMD/LAM. Compte tenu de sa toxicité modérée, cet inhibiteur de tyrosine kinase est actuellement en essai clinique en France et aux États-Unis dans les SMD en échec d’Aza. Dans ce travail, nous avons tenté de comprendre les mécanismes d’action impliqués dans l’activité de l’Aza et de l’Erlo seuls ou en association. Nous avons observé que l’Aza et la décitabine (un autre agent hypométhylant) induisent la déphosphorylation et la translocation dans le noyau du facteur de transcription FOXO3A où il réactive l’expression de gènes cibles tels que les facteurs pro apoptotiques PUMA et BIM. Cet effet observé rapidement, suggère un effet « off target » non lié à une reprogrammation épigénétique. La phosphorylation constitutive de FOXO3A étant considérée comme un facteur de mauvais pronostic dans les LAM, cette observation soulève l’intérêt potentiel des agents hypométhylants dans cette pathologie. Nous avons également identifié deux nouvelles cibles de l’Erlo : les SRC-kinases et la voie mTOR/p70S6K dont l’inhibition par des inhibiteurs biochimiques induit un arrêt du cycle cellulaire en G0/G1 sans apoptose ni différenciation confirmant l’hypothèse d’une action « multikinase » de l’Erlo. Par ailleurs, nous avons mis en évidence une activité synergique sur l’apoptose de l’association Aza et Erlo sur des lignées cellulaires de SMD/LAM et sur des cellules de patients. Cet effet n’a pas été retrouvé avec la décitabine ni les autres inhibiteurs de tyrosine kinase testés. La potentialisation de l’apoptose semble liée à plusieurs mécanismes associant l’augmentation de la concentration intracellulaire d’Aza via l’inhibition des transporteurs ABC, un arrêt de la prolifération, une activation des voies apoptotiques caspases-dépendantes et indépendantes et une activation des dommages à l’ADN. En conclusion, ce travail a permis l’identification de nouvelles cibles de l’Erlo et de l’AZA et a révélé un effet synergique entre ces deux molécules. Ces résultats précliniques encourageants suggèrent que cette association pourrait apporter un potentiel bénéfice chez les patients atteints de SMD/LAM, notamment ceux devenus réfractaires à l’Aza. / Myelodysplasic syndromes (MDS) constitute a diverse group of malignant clonal disorders that typically occur in elderly people. MDS are characterized by ineffective hematopoiesis, refractory cytopenias, morphologic dysplasia and increased potential to transform into acute myeloid leukemia (AML). Treatment of MDS has progressed considerably in recent years with the emergence of new approval agents such as azacytidine (aza)(a hypomethylating agent (HMA)) in higher-risk MDS. However, there are still a significant proportion of patients who do not respond to therapy with aza. Therefore, understanding the mechanisms of action of HMAs, identifying predictive factors for aza resistance and combining HMAs with other active compounds in MDS represent a challenging area to improve MDS/AML treatment. Previous works showed that erlotinib (an inhibitor of the epidermal growth factor receptor (EGFR)) exhibits antineoplastic effects in MDS/AML. Due to its limited toxicity profile, this tyrosine kinase inhibitor is currently being evaluated after failure of aza in two clinical trials. In this project, we aimed at understanding the molecular mechanisms involved in the activity of aza and erlo alone or in combination. We observed that aza and decitabine (another HMA related to aza) induces dephosphorylation and translocation to nucleus of the transcriptional regulator FOXO3A promoting the upregulation of the pro-apoptotic factors PUMA and BIM. This effect could be an “off target” effect and could contribute the bebenfical role of HMA in AML as constitutive phosphorylation of FOXO3A has been shown to be an adverse prognostic factor. We discovered new target for erlo, Src-kinase kinases and mTOR that are implicated in the cell-cycle arrest but not in the induction of apoptosis or differentiation confirming the “multikinase” activity of erlo. We found that the combination of aza and erlo demonstrated synergistic induction of apoptosis in MDS/AML cell lines and in some patient cells. This effect was not observed with decitabine or other tyrosine kinase inhibitors frequently used in onco-hematology. We demonstrated that potentiation of cell death is associated with different mechanisms such as intracellular accumulation of aza (via inhibition of ABC transporters), cell cycle arrest with inhibition of leukemic cells growth, caspase-dependent and -independent induction of apoptosis and DNA damage level. In conclusion, this work identified new targets of aza and erlo and revealed a synergistic induction of apoptosis upon co-treatment suggesting that this drug combination might be promising for SMD/AML treatment SMD/AML, especially the resistant patients.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont caractérisées par la prolifération maligneincontrôlée de précurseurs lymphoïdes T bloqués dans la différenciation. Les stades d’arrêt dematuration observés dans les LAL-T reproduisent fidèlement les différentes étapes de la maturationthymique humaine. Ainsi nous avons montré que le facteur de transcription myéloïde CEBPA, expriméuniquement dans les précurseurs thymiques les plus immatures (ETP), est réprimé par un mécanismed’hyperméthylation dans les LAL-T à l’exception des formes les plus immatures. Il est aujourd’huicommunément admis que les LAL-T constituent une pathologie dite « multi-hits » où les oncogènesde type A affectent la différenciation tandis les oncogènes de type B sont impliqués dans la régulationdu cycle cellulaire, l’auto-renouvellement et/ou l’engagement dans la lignée T. La voie de signalisationde NOTCH, cruciale pour le développement lymphoïde T, est constitutivement activée par la survenuede mutations des gènes NOTCH1 et/ou FBXW7 (N/F) dans environ 60% des LAL-T. La valeurpronostique de ces mutations est controversée. Dans notre travail, nous avons montré que lesmutations de N/F sont plus fréquentes dans les LAL-T arrêtées à un stade de maturation cortical etconfèrent un bon pronostic qui semble toutefois dépendre de la chimiothérapie administrée. Grâce àl’étude de cette large cohorte de LAL-T nous avons pu également établir la fréquence de l’anomalieoncogénique CALM-AF10. Cette dernière est très fréquente dans les LAL-T qui se développent àpartir des ETP dites de mauvais pronostic. Nous avons montré que c’est la présence de l’anomalieCALM-AF10 qui confère le pronostic défavorable à ce sous-type de LAL-T. Contrairement à lalittérature nous n’avons pas retrouvé de valeur pronostique liée à la surexpression des gènes ERG etBAALC. L’étude des anomalies génétiques des LAL-T permet de mieux comprendre l’oncogénèse etd’identifier les anomalies avec une valeur pronostique. L’intérêt de ces travaux est d’apporter une aideaux cliniciens pour une stratification thérapeutique adaptée afin de donner les meilleures chances desurvie aux patients. / T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) are lymphoid neoplasms characterized by theproliferation of malignant T lymphoblasts arrested at early stages of maturation. Maturation arrest in TALLmirrors normal lymphopoiesis. Thus we have shown that the myeloid transcription factor CEBPA,expressed only in the most immature thymic precursors (ETP), is commonly repressed byhypermethylation in T-ALL with the exception of the most immature subset. It is now widely acceptedthat T-ALL is a “multi-hits” disease where the type A oncogenes affect the differentiation while type Boncogenes are involved in cell cycle regulation, self-renewal and T-cell commitment. The Notchsignaling pathway, crucial for T cell development, is constitutively activated by the occurrence ofmutations in NOTCH1 and /or FBXW7 (N / F) genes in approximately 60% of T-ALL. The prognosticvalue of these mutations is controversial. In our study, we showed that N/F mutations are morefrequently observed in T-ALL arrested at a cortical stage of maturation and confer a good prognosiswhich seems to be influenced by the therapeutic regimen. In this large cohort of T-ALL we could alsodetermine the frequency of the CALM-AF10 oncogenic abnormality. The latter is very common in TALLdeveloped from ETP wich are of very poor prognosis. We have shown that this is the presence ofCALM-AF10 which confers the poor prognosis in this subtype of T-ALL. Contrary to the litterature wedid not find any prognostic value associated with the overexpression of ERG and BAALC genes. Thestudy of genetic abnormalities in T-ALL provides a better understanding of oncogenesis and identifyabnormalities with prognostic value. The interest of this work is to assist clinicians for an efficienttherapeutic stratification to overcome the poor outcome of T-ALL patients.

La prise en charge de l’aphasie en phase aiguë de l’accident vasculaire cérébral a été au centre de mon activité d’orthophoniste à l’assistance publique pendant 20 ans. Au cours de ces années, j’ai pu développer une activité de recherche en parallèle de mon activité clinique. En particulier, je me suis intéressée à l’évaluation et à la prise en charge très précoce de l’aphasie dans le contexte d’AVC en phase très aiguë. Un outil d’évaluation de l’aphasie a pu être élaboré dans le service, et a ensuite été le centre de plusieurs travaux : son adaptation dans d’autres langues, la comparaison de l’aphasie et le l’hémiplégie, la détermination de profils aphasiologiques types… Le champ de l’aphasiologie est très vaste et il reste de nombreux axes de recherche à approfondir. Notre outil d’évaluation de phase aiguë pourrait participer à apporter la preuve du bénéfice d’une prise en charge précoce de l’aphasie, et pourrait également permettre de proposer une nouvelle classification des aphasies. / The management of aphasia in the acute phase of stroke has been the focus of my speech therapist activity in a public hospital for 20 years. During these years I have been able to develop a research activity in parallel with my clinical activity. In particular, I was interested in the assessment and the treatment of aphasia in the context of the very acute phase of stroke. An assessment tool for aphasia has been developed in the stroke unit, and was then the center of several studies: its adaptation into other languages, the comparison of aphasia and hemiplegia, determining aphasiological profiles kinds...The field of aphasiology is very broad and there are still many areas of research to pursue. Our screening tool of aphasia could participate to prove the benefit of an early treatment of aphasia, and could also allow proposing a new classification of aphasia.

Ces travaux de thèse ont porté sur le développement de formulations innovantes et nanoparticulaire, destinées à améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémie aigüe myéloïdes (LAM). Cette amélioration de la qualité de vie peut passer par le développement d’une formulation orale de décitabine.Trois stratégies de formulations différentes ont été développées : deux formulations de nanocapsules lipides (LNCs) avec encapsulation ou de décitabine, ou d’une prodrogue de décitabine (décitabine(C12)2) . La troisième stratégie a été le développement de particules de type liposomal, dans lesquelles la décitabine a été encapsulée. Après avoir été caractérisée sur des critères physicochimiques, chacune des stratégies basées sur les LNCs a été évaluée par des essais in vitro pour évaluer la perméabilité intestinale de la décitabine lorsqu’elle a été encapsulée. Une des stratégies a permis d’accroitre la perméabilité, in vitro, de la décitabine. L’activité sur la prolifération cellulaire a ensuite été évaluée sur des cellules humaines de LAM. Il a été démontré que l’encapsulation dans les LNCs améliore l’activité de la décitabine et de la décitabine (C12)2. Après l’ensemble de ces essais, en vue d’évaluer le potentiel avantages de ces formulations pour augmenter la demi-vie plasmatique de la décitabine, leurs stabilités dans du plasma humain a été évaluée. La décitabine (C12)2 libre et encapsulée permettent de limiter la dégradation rapide de la décitabine. Finalement, une étude de pharmacocinétique a été mise en place. L’encapsulation de la décitabine, en synthétisant au préalable une prodrogue permet d’augmenter les concentrations maximales atteintes. / The aim of this phD work was to develop nanoparticle formulations to improve patients’quality of life in case of acute myeloid leukemia (AML). These formulations could, for example, allow an oral administration of decitabine. Three different formulations were developed: two were based on lipid nanocapsules (LNCs) with an encapsulation of decitabine or a decitabine prodrug (decitabine(C12)2). The third strategy was aliposomal formulation with a decitabine encapsulation. After being characterized on physico-chemical parameters, in vitro intestinal permeability studies were performed on LNCs strategies. One strategy was able to enhance decitabine permeability. Cell proliferation studies performed on human AMLcell lines showed that encapsulations into LNCs improve decitabine and decitabine(C12)2 activities. In order to evaluate the potential of these formulations to enhance decitabine plasma half-life, their stabilities in human plasma were then assayed. Free decitabine(C12)2 or encapsulated into LNCs has been shown to limit the rapid decitabine degradation. Finally, pharmacokinetic studies were performed. Decitabine encapsulation into LNCs with a previous decitabine prodrug synthesis was able to increase maximal plasma concentrations.

Notre groupe a montré que l’hypoxie sévère (0.1% O2) induit un arrêt du cycle cellulaire en G0 des cellules humaines CD34+ et des cellules murines FDCP mix. Peu d’études ont exploré l’existence de Cellules Initiatrices de Leucémie (CIL) dans les LAL et leur rôle dans les rechutes. Notre projet s’est focalisé sur l’effet de l’hypoxie sévère sur la quiescence des CIL dans les LAL, qui pourrait être responsable d’un pourcentage de rechutes. En effet dans la niche hématopoïétique, ou sont localisées les Cellules souches hématopoïétiques et probablement les CIL, la concentration d’oxygène avoisinerait 0,1%.Nous avons utilisé la lignée de LAL NALM6 pour explorer les effets de l’hypoxie sévère sur leur survie, leur cycle cellulaire et leur chimiorésistance. Nos résultats ont mis en évidence qu’une culture à 0.1% O2 durant 7 jours de la lignée NALM6: - inhibe leur prolifération sans surmortalité, - révèle une population restreinte de CIL quiescentes et chimiorésistantes capables d’induire une leucémie dans des souris. Nous avons recherché les relations entre l’hypoxie sévère et quelques caractéristiques des cellules primaires de patients atteints de LAL : existence et rôle de CIL résistantes à l’hypoxie et aux agents thérapeutiques conventionnels des LAL ; localisation de ces cellules résiduelles dans la moelle osseuse des souris xénogreffées. Nos résultats suggèrent que certaines rechutes de LAL pourraient être dues à la persistance à long terme de « quiescent/dormant » CIL dans les niches hypoxiques de la moelle osseuse. Ce modèle est intéressant pour explorer les mécanismes in vitro et in vivo de chimiorésistance dans les LAL et le rôle de l’environnement dans ce phénomène. / Our group showed that severe hypoxia (0.1% O2) induces G0 cell-cycle-arrest of human CD34+ cells and of murine FDCP-mix Cells. Few studies explored the existence of quiescent Leukemia Initiating Cells (LIC) in ALL and their role in primary chemoresistance and relapses. Our project is focused on the effect of very low O2 concentrations in the maintenance of quiescent LIC in ALL, that could be responsible of a percentage of relapses. Indeed in bone marrow niches, where hematopoietic stem cells and probably LIC are located, the O2 concentrations are below 0.1%.In the present study we used the NALM-6 ALL cell line to explore the effects of culture at 0.1% O2 on their survival, cell cycle and chemoresistance. Our results evidence that a 7 days culture of NALM-6 cells at 0.1% O2: - inhibits their proliferation without major cell death; - reveals a restricted LIC population of quiescent and chemoresistant LIC; - maintains quiescent chemoresistant LIC that induce leukemia when injected in immunodeficient mice. We investigated the relationships between severe hypoxia and some characteristics of ALL primary cells obtained from patients: existence and role of quiescent chemoresistant LICs in ALL relapses; location of these residual cells inside the bone marrow of engrafted mice. Our results suggest that some ALL relapses could be due to the long term persistence of “quiescent / dormant” LIC in hypoxic bone marrow niches. This model is of interest for exploring the in vitro and in vivo (xenograft) mechanisms of chemoresistance in ALL and the role of the bone marrow environment in this phenomenon.

Les leucémies sont une famille de cancers issus de la prolifération maligne des cellules hématopoïétiques. La leucémie myéloïde aigüe (AML) représente 30% des leucémies chez les adultes et menace surtout les personnes âgées de 64 ans et plus. Actuellement, la chimiothérapie est la méthode principale de prise en charge de l’AML, mais celle-ci comporte des effets secondaires importants ainsi qu’un risque de récidive qui freinent son développement. Le redéploiement de molécules déjà utilisées pour d’autres maladies est une stratégie émergente dans le traitement du cancer. Par exemple, la chlorpromazine (CPZ), un antipsychotique, démontre une activité contre les lignées cellulaires issues d’AML, mais son activité au niveau du système nerveux central entraine des effets indésirables. Compte tenu de l’activité de CPZ contre les cellules leucémiques, nous avons mis au point un système de vectorisation des médicaments original pour le traitement de l’AML. La CPZ est d’abord incluse dans une cyclodextrine (CD) : molécule cage à base de glucose et ce complexe est ensuite encapsulé dans un liposome : vésicules à contenu aqueux délimitées par une ou plusieurs bicouches phospholipidiques. Ce système de “drug-in-CD-in-liposomes” (DCL) est conçu pour circuler longtemps dans le sang après injection intraveineuse mais ne pas passer la barrière hémato-encéphalique (BHE).Il a été nécessaire d’optimiser la formulation avec ses trois composants principaux : CD, CPZ et phospholipides. Ainsi, une évaluation physico-chimique approfondie a été réalisée pour les interactions CD/CPZ, CD/phospholipides et CPZ/phospholipides. La calorimétrie de titration isotherme (ITC) a permis de déterminer la stœchiométrie et la constante d’association pour les complexes d’inclusion CD/CPZ, démontrant les associations les plus importantes avec la Sugammadex ou la SBE-β-CD. La spectroscopie RMN 2D ROESY a mis en évidence des géométries d’inclusion différentes selon la taille et le type de substitution des CDs. Par ailleurs, l’inclusion de la CPZ dans les CDs accélère légèrement la photodégradation de l’antipsychotique. Quant à l’interaction CD/phospholipides, la SBE-Et-β-CD déstabilise les liposomes multilamellaires (MLVs) composés de palmitoylstearoylphosphatidylcholine (PSPC) pour des concentrations supérieures à 25 mM, tandis que les autres CDs sont sans effet. En outre, des études de turbidité ont démontré que les liposomes unilamellaires (SUV) ne sont pas perturbés en présence de la plupart des CDs. Une étude de l’interaction entre CPZ et PSPC a démontré que la quantité maximale qu’il est possible d’encapsuler était égale à 3,75 mol%. Par la suite, des DCL contenant CPZ ont été préparés par la méthode « dehydration-rehydration vesicles » (DRV) mais le pourcentage du principe actif encapsulé (EE) s’avérait faible (environ 10%). Ainsi la méthode DRV combinée à l’utilisation d’un gradient de concentration de sulfate d’ammonium a été mise en œuvre, ce qui a permis d’augmenter l’EE à 27% tout en gardant une taille compatible avec l’administration IV. Par la suite, la cytotoxicité de ces formulations a été évaluée sur 4 lignées cellulaires humaines issues d’AML (HL-60, MOLM13, MV4-11 and OCI-AML). Les liposomes contenant la CPZ ont tous démontré un effet cytotoxique tandis que les liposomes vides avaient tendance à stimuler la croissance cellulaire et les CD seules étaient sans effet. Pourtant, l’activité des DRVs avec CD était inférieure à celle des DRV/CPZ, selon l’ordre suivant : DRV-SGM/CPZ < DRV-SBE-β-CD/CPZ < DRV-HP-γ-CD/CPZ. L’activité était inversement proportionnelle à la constante d’affinité, suggérant une libération retardée. Cette hypothèse a été confortée par le fait que l’activité des DRV CD/CPZ était plus importante après une exposition de 72h qu’après 24h.Ces résultats sont prometteurs pour la mise au point de systèmes à libération contrôlée de CPZ pour le traitement d’AML. / Leukemia is a group of cancers caused by malignant clonal proliferation of hematopoietic stem cells. Accounting for 30% of all leukemias in adults, acute myeloid leukemia (AML) is especially a threat for older people with a median age of 64 years. Presently, chemotherapy is the main therapeutic method for AML but severe side-effects and possibility of relapse have hampered its development. “Repurposing” of drugs used in other diseases is a current trend for the treatment of cancer. For example, chlorpromazine (CPZ), a widely used anti-psychotic drug, shows effective activity in AML cell lines, but can also cause side effects in the central nervous system.Basing on the inhibiting capability of CPZ against leukemia-related cell lines, we have designed and developed a novel nanometric drug delivery system for AML treatment. CPZ is first entrapped in the hydrophobic internal cavity and forms inclusion complexes with cyclodextrin (CD), a cask-like molecule composed of glucose units, then the CD/CPZ inclusion complexes are encapsulated in liposomes, phospholipid vesicles consisting of a series of lipid bilayers enclosing aqueous compartments. The “drug-in-CD-in-liposomes” (DCL) system provides a promising strategy which is capable of achieving long circulation time in the blood after intravenous administration while circumventing the blood-brain barrier (BBB). It was necessary to optimize the formulation for its three main components: CD, CPZ and phospholipid. Therefore, a comprehensive physicochemical investigation of the interaction between CD/CPZ, CD/lipid and CPZ/lipid was performed. Isothermal titration calorimetry (ITC) was used to obtain the stoichiometry and association constant of the CPZ-CD inclusion complexes, showing that sugammadex and SBE-β-CD has the highest complexation ratio. 2D ROESY NMR revealed different inclusion processes depending on the size and chemical modification of CDs. Photodegradation experiments indicated that CDs can slightly accelerate CPZ's photodegradation. As far as liposome stability was concerned, SBE-Et-β-CD was found to have an obvious interaction with palmitoyl stearoyl phosphatidylcholine (PSPC) multilamellar liposomes (MLVs) above 25 mM, while the other CDs were without effect. However, turbidity measurements indicated that small unilamellar liposomes (SUVs) remain intact in presence of CDs. A study of the interaction between CPZ and PSPC showed that the maximum proportion of CPZ that could be incorporated into the lipid membrane was 3.75 mol%. Subsequently, DCL systems containing CPZ was prepared by the dehydration-rehydration vesicles (DRV) method. However, low drug encapsulation efficiency (EE) was obtained (about 10% of added drug). Therefore, an active loading strategy, the ammonium sulphate gradient method, was used in combination with the DRV method. As a result, the EE of CPZ increased to about 27% and yielded liposomal formulations with suitable size for IV administration.Finally, the cytotoxicity of CPZ, CDs, empty liposomes and liposomes containing CD/CPZ complexes was evaluated against a panel of leukemia cell lines. CPZ was found to show a growth-inhibiting effect on the human leukemia cell lines (HL-60, MOLM13, MV4-11 and OCI-AML), while empty liposomes were observed to slightly promote their growth and CDs alone had no significant cytotoxicity. However, a difference in activity was observed with the DRV containing CD/CPZ complexes, which were less active than DRV containing free CPZ, with the order: DRV-SGM/CPZ < DRV-SBE-β-CD/CPZ < DRV-HP-γ-CD/CPZ. The activity was inversely proportional to the formation constant of CD/CPZ complexes obtained by ITC, suggesting a delayed release from the complexes. This was confirmed by varying the exposure time; the activity of DRV CD/CPZ being relatively higher in a longer incubation.These results suggest that the DCL system could provide controlled release of CPZ for the treatment of AML.

Objectifs. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’influence du groupe pronostique auquel le patient est attribué au moment du diagnostic et du protocole de traitement sur le développement d’anomalies dentaires et leur sévérité chez les enfants traités pour la leucémie aigüe lymphoblastique (LAL). L’étude comporte un objectif secondaire : confirmer les résultats des études précédentes ayant montré un nombre et une sévérité plus élevée d'anomalies dentaires chez le groupe 0-5 ans. Hypothèse. Chez des enfants ayant été traités pour la LAL, la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires seront plus élevées chez ceux ayant fait partie du groupe pronostique de très haut risque, ayant reçu une combinaison de chimiothérapie, de radiothérapie et de greffe de moelle osseuse et ayant eu leur diagnostic avant l’âge de 6 ans. Méthodes. Des patients âgés entre 14 et 25 ans et ayant reçu un diagnostic de LAL avant l’âge de 11 ans ont été recrutés au Centre Hospitalier Universitaire Sainte-Justine. Un examen dentaire et radiologique ont été effectués. Des données concernant le diagnostic, le groupe pronostique et le type de traitement reçu ont été notées à partir du dossier médical des participants. Résultats. Des défauts dentaires ont été observés chez 26 (50,98%) des 51 sujets, la microdontie étant l’anomalie la plus prévalente (39,22%). Les participants des catégories haut risque et très haut risque ayant reçu de la chimiothérapie haute dose étaient significativement plus à risque de présenter une anomalie dentaire comparé à ceux de la catégorie risque standard ayant reçu la chimiothérapie conventionnelle (p=0.046). Un âge ≤ 5 ans au diagnostic augmentait significativement la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires (p<0.001). Conclusion. Le traitement de la LAL pédiatrique affecte l’odontogénèse. Le groupe pronostique et le protocole de traitement ont augmenté le risque de développer au moins une anomalie dentaire. L’âge au diagnostic a affecté la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires. / Objective. The main objective of this study is to assess the influence of the risk group to which the patient is assigned at diagnosis and the treatment protocol on the development and severity of dental anomalies in children treated for acute lymphoblastic leukemia (ALL). The secondary aim was to confirm the results of previous studies that showed an increased number and severity of dental defects in children aged 0 to 5 years old at diagnosis. Hypothesis. In children treated for ALL, the prevalence and severity of dental anomalies will be the highest in those who were in the very high risk prognostic group, who received a combination of chemotherapy, total body irradiation and hematopoietic stem cell transplantation and who were diagnosed before the age of 6 years old. Methods. Patients aged between 14 and 25 years old who received diagnosis of ALL before the age of 11 years were recruited at the Sainte-Justine Mother and Child University Hospital Center. Dental and radiographic examinations were performed. Data about the diagnosis, risk group and type of treatment received were collected from medical records. Results. Dental anomalies were recorded in 26 (50.98%) out of 51 subjects and microdontia was the most prevalent dental defect (39.22%). Participants in the high risk and very high risk categories receiving high-dose chemotherapy were significantly more likely to show a dental anomaly compared to those in the standard risk group receiving conventional chemotherapy (p=0.046). Age ≤5 years at diagnosis significantly increased the prevalence of dental anomalies and the severity rating (p<0.001). Conclusion. Therapy for childhood ALL affects the developing dentition. Risk group and treatment protocol influenced the odds of developing at least one dental anomaly. Age at diagnosis affected both the prevalence and severity of dental defects.

Stimuler le système immunitaire est un enjeu majeur dans le traitement des leucémies aigües. Nous avons centré notre étude sur la leucémie aigüe myéloïde (LAM) et la leucémie à cellules dendritiques plasmacytoïdes (LAPDC). Dans une première partie, nous avons étudié les médicaments immunomodulateurs (IMiDs) utilisés dans le traitement du myélome multiple et des syndromes myélodysplasiques à délétion 5q. Les IMiDs présentent des propriétés anti-angiogéniques, anti-prolifératives, pro-apoptotiques, et immunomodulatrices en particulier sur les cellules NK (Natural Killer). Nous avons évalué les effets anti-leucémiques des IMiDs (lenalidomide et pomalidomide) dans le but d’améliorer l’activité cytotoxique des NK dans la LAM. Nous avons mis en évidence une altération de la survie des blastes de LAM par les IMiDs in vitro, et dans un modèle in vivo de greffe dans les souris immunodéficientes NOD/SCID/IL2rg-/- (NSG). Nous avons également montré une sensibilisation par les IMiDs des blastes de LAM à la lyse par les NK allogéniques, indépendamment de la cible moléculaire connue, le cereblon. Le traitement des blastes de LAM par IMiDs stimule les fonctions NK. Enfin, nous avons décrit des modifications phénotypiques induites par les IMiDs sur les récepteurs NK, et une diminution d’expression de HLA-classe I sur les cellules de LAM. Ces résultats encouragent la poursuite du développement des IMiDs dans la LAM, en particulier les associations stimulant les fonctions NK. Dans une seconde partie, nous avons développé un modèle murin de LAPDC dans la souris NSG. Cet outil préclinique est indispensable dans l’élaboration de stratégies d’immunothérapie dans les leucémies aigües. / Boosting the Immune System is a major challenge in the treatment of acute leukemias. We focused our study on acute myeloid leukemia (AML) and plasmacytoid dendritic cell leukemia (BPDCN). In the first part, we studied immunomodulatory drugs (IMiDs) that are currently used in the treatment of patients with myeloma and myelodysplastic syndrome with 5q deletion. IMiDs exhibit anti-angiogenesis, anti-proliferative, pro-apoptotic, and immunomodulatory properties especially on NK cells and T lymphocytes. We investigated the anti-leukemic effects of two IMiDs (lenalidomide and pomalidomide) in order to improve NK cell cytotoxic activity in AML. We have shown that IMiDs impaired survival of AML blasts in vitro, and in vivo in NOD/SCID/IL2rg-/- (NSG) murine model. In addition, IMiDs treatment sensitized AML blasts to allogeneic NK cell mediated lysis, independently of Cereblon, the known molecular target of IMiDs. IMiDs treatment of AML blasts enhanced NK cell functions such as degranulation and cytokine production. Finally, we have described phenotypic changes induced by IMiDs on NK receptors, and a down-regulation of HLA-class I on AML blasts. These results encourage continuing investigation for the use of IMiDs in AML, especially in combination with immunotherapies based on NK cells. In a second part, we have developed a murine model of plasmacytoid dendritic cell leukemia (BPDCN) in NSG mice. Murine model of leukemia are essential preclinical tools in the development of new immunotherapies in acute leukemias.