A doença de Lyme é uma doença causada pelas bactérias do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato que são transmitidas por carrapatos do complexo Ixodes ricinus. A distribuição geográfica dessas bactérias é confirmada no Hemisfério Norte (America do Norte, Europa e Ásia). Suspeita-se que uma enfermidade, compatível com doença de Lyme no Brasil, esteja provavelmente relacionada a uma espécie de Borrelia diferente das espécies causadoras de doença de Lyme no hemisfério Norte e que o vetor sejam carrapatos do gênero Amblyomma. Por estas razões, a doença brasileira passou a ser chamada de Doença de Lyme-Símile (DLS). A borreliose aviária é causada pela Borrelia anserina, que apresenta distribuição cosmopolita. É transmitida por carrapatos argasideos do gênero Argas. O presente trabalho foi dividido em dois capítulos: o primeiro investigou a presença de Borrelia spp em áreas onde foram relatados casos humanos de DLS no Estado de São Paulo. No segundo capítulo, é relatado o primeiro isolamento em meio BSK e a caracterização molecular de uma cepa de espiroqueta aviária presumidamente identificada como B. anserina, no Brasil. Para o primeiro capítulo, foram processados um total de 349 carrapatos Amblyomm cajennense adultos coletados em áreas com suspeita de DLS, nove amostras de sangue ou tecidos de pacientes humanos com diagnóstico clínico e sorológico de DLS, duas amostras de caldas de meio BSK previamente inoculado com tecidos ou sangue de pacientes com suspeita de DLS, e três amostras de caldas de meio BSK previamente inoculado com carrapatos coletados de áreas com suspeita de DLS. Essas amostras tiveram seu DNA extraído e testado pela nested-PCR com primers específicos para porções do gene flagelina B (flaB), aptos a amplificar porções deste gene de qualquer espécie de Borrelia. Todas as amostras foram negativas pela nested-PCR, não evidenciando a presença de Borrelia sp nas amostras avaliadas. Para o segundo capítulo, foi utilizada uma amostra de espiroqueta aviária originária de carrapatos Argas miniatus, colhidos em um galinheiro no Município de Pedro Leopoldo, MG. O isolamento in vitro e caracterização molecular da espiroqueta aviária foi feito a partir da inoculação de soro infectado, contendo espiroquetas viáveis, em meio BSK. O soro, baço, fígado e o próprio cultivo foram utilizado para amplificação na PCR para os genes rrs e flaB, seguido de seqüenciamento dos mesmos. O isolamento da espiroqueta foi obtido com sucesso, com várias passagens realizadas. A análise genética das seqüências do isolado mostrou 99.8% (483 de 484-bp) e 98.7% (754 de 764-bp) de similaridade às seqüências correspondentes dos genes rrs e flaB de B. anserina, respectivamente, disponíveis no GenBank. Pela análise filogenética inferida pela seqüência parcial do gene flaB, a cepa Brasileira agrupou-se com a seqüência de B. anserina dos EUA. Os resultados indicam a cepa brasileira estudada, designada de cepa PL, pertence à espécie B.anserina. / Lyme disease is caused by bacteria belonging to the complex Borrelia burgdorferi sensu lato, which are transmitted by ticks of the Ixodes ricinus complex. The distribution of these bacteria are restricted to the northern hemisphere (North America, Europe, and Asia). Lyme disease-like cases have been reported in Brazil, but it is possible that another Borrelia species is involved in these cases, and ticks of the genus Amblyomma have been implicated as vectors. Due to these reasons, the disease in Brazil has been referred as Lyme Disease-Simile (LDS). Borrelia anserina, the agent of avian spirochetosis, has a wordwide distribution, where it is transmitted primarily by ticks of the genus Argas. The present study was divided in two chapters: the first one evaluated the presence of Borrelia spp in areas of the state of São Paulo where LDS have been reported. The second chapter reports the first in vitro isolation in BSK medium and molecular characterization of a spirochete strain from Brazil, presumably identified as B. anserina. For the first chapter, a total of 349 adult ticks (Amblyomma cajennense) collected in areas where LDS cases have been reported were processed. In addition, nine human blood or tissue samples from patients with clinical and serological diagnostic of LDS, two samples from BSK medium previously inoculated with samples of skin or blood of LDS patients, and three samples of BSK medium previously inoculated with tick samples were also processed. All these samples were processed for DNA extraction and then tested by nested-PCR employing primers targeting a portion of the flagelin B gene (flaB),which amplify a flaB fragment in all known Borrelia species. All samples were negative by this nested-PCR, showing no evidence of Borrelia sp in the tested samples. The second chapter evaluated an avian spirochete strain originated from Argas miniatus ticks from Pedro Leopoldo municipality, state of Minas Gerais. DNA fragments of the rrs (16S rRNA) and flab genes were amplified by PCR and sequenced to determine phylogenetic similarities. The resulting sequences were 99.8% (483 of 484) and 98.7% (754 of 764) similar to GenBank corresponding sequences of B. anserina rrs and flaB genes, respectively. By neighbor-joining phylogenetic analysis, the flaB sequence of the Brazilian strain clustered in a monophyletic group with the sequence of B. anserina under 100% bootstrap support. The isolate was successfully isolated in BSK medium, with seven passages performed. The spirochete crude antigen, fixed in glass slides, showed strong immunfluorescence reactivity with sera from chickens previously inoculated with the isolate. The spirochete strain isolated in the present study was genetically identified as B. anserina, labeled as strain PL.

A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é uma zoonose que tem como agente patogênico bactérias da espécie Rickettsia rickettsii, que são transmitidas por carrapatos da espécie Amblyomma aureolatum na Região Metropolitana de São Paulo, onde a letalidade da doença pode chegar a 80 por cento . Carrapatos dessa espécie realizam seu ciclo no interior das matas e cães domésticos - principais hospedeiros do estágio adulto desse carrapato em áreas degradadas - podem auxiliar na manutenção do ciclo da doença, ao transferir carrapatos infectados das matas para o ambiente antrópico. Este estudo teve como objetivo, analisar a relação entre fragmentação florestal, e sua possível influência na distribuição da soroprevalência de R. rickettsii em cães domésticos, na zona de contato entre Mata Atlântica e ambiente antrópico. Nove áreas com diferentes perfis ambientais foram selecionadas para o estudo: duas áreas em São Paulo, três áreas em Santo André, duas áreas em São Bernardo do Campo, uma área em Ribeirão Pires e uma área em Diadema. Uma amostra única de sangue foi coletada em trinta cães por área de estudo, num total de 270 cães amostrados. Todas as amostras foram submetidas a teste sorológico de imunofluorescência indireta para determinação do título de anticorpos contra R. rickettsii e todos os cães do estudo foram inspecionados em busca de carrapatos, que quando encontrados, foram levados ao laboratório para devida identificação de espécies e posterior pesquisa de riquétsias por PCR. Os dados de parasitismo por carrapatos em cães foi determinado pelo cálculo de abundância e intensidade parasitaria média. A soroprevalência encontrada variou de 0 a 37 por cento , e quando comparada aos dados ambientais, resultantes de análise multivariada de componentes principais, demonstrou que áreas mais preservadas, com maior área de mata e borda reduzida tem menores chances de ocorrência de casos de FMB do que áreas com área de mata reduzida e grande quantidade de borda. Somente as espécies A. aureolatum e R. sanguineus foram encontradas parasitando os cães do estudo, sendo que nenhum espécime foi considerado reagente na PCR. Os resultados sugerem que existe uma relação entre a soroprevalência de infecção por R. rickettsii em cães e as características de paisagem de cada região. A análise de estrutura de paisagem - parâmetro que pode favorecer a transmissão da bactéria R. rickettsii, uma vez que favorece o contato de cães e carrapatos vetores é uma ferramenta que pode auxiliar na determinação de áreas de maior ou menor risco para ocorrência de casos humanos de FMB, sendo útil na vigilância da doença. / The Brazilian Spotted Fever (BSF) is a zoonotic disease whose pathogen is the bacteria Rickettsia rickettsii, transmitted by Amblyomma aureolatum ticks in the Metropolitan Region of São Paulo, where the lethality of the disease can reach 80 per cent . The life cycle of those tiks occour in the forest and domestic dogs - main hosts of the adult stage of this tick in modify areas - can maintain the disease cycle, transferring infected ticks from the forest to the anthropic environment. This study aimed to analyze the relationship between forest fragmentation and its possible influence on the seroprevalence distribution of R. rickettsii in domestic dogs living at the contact zone between the Atlantic Forest and anthropic environment. Nine areas with different landscape profiles were selected for the study: two areas in São Paulo, three areas in Santo André, two areas in São Bernardo do Campo, an area in Ribeirão Pires and an area in Diadema. A single blood sample was collected in thirty dogs in each study area, with a total of 270 sampled dogs. All samples were submitted to serological test of indirect immunofluorescence to determine the antibodies titers against R. rickettsii, and all study animals were inspected for ticks, that when found, were taken to the laboratory for proper identification of species and further Ricketsia research through PCR reaction. Parasitism data of ticks on dogs was determined by the mean abundance and mean intensity. The seroprevalence found ranged from 0 to 37 per cent , and when compared to environmental data, resulted from the principal component analysis, showed that the most preserved areas, with larger amount of forest and less edge has lower chances of BSF occurrence, than areas with less forest and greather amount of edge. Only the species A. aureolatum and R. sanguineus were found parasitizing the study dogs, and no specimen was considered positive in the PCR reaction. The results suggest a relationship between the seroprevalence of infection with R. rickettsii in dogs and the landscape features on each region. The landscape structure analysis - parameter that can facilitate the transmission of the bacteria R. rickettsii, since it favors the contact between dogs and ticks - can assist in determining areas of higher or lower risk for the occurrence of human cases of BSF, being useful in monitoring the disease.

Em janeiro de 2005, foram coletados 31 carrapatos adultos da espécie Amblyomma triste em uma propriedade rural da CESP, localizada no município de Paulicéia, Estado de São Paulo. Três carrapatos foram positivos para o teste de hemolinfa, demonstrando estruturas compatíveis com riquétsias no interior de hemócitos. Dois desses carrapatos foram submetidos à tentativa de isolamento de riquétsias em células Vero, através da técnica de Shell vial. Um isolado foi obtido com sucesso, estando já estabelecido em cultivo celular, com várias passagens e partidas congeladas. Do restante do carrapato utilizado para este isolamento, foi extraído o DNA e este foi submetido a PCR para um fragmento do gene ompA de Rickettsia spp. Foi realizada a caracterização molecular do isolado, através do sequenciamento genético de quatro genes de Rickettsia spp: gltA, htrA, ompA e ompB e os genes apresentaram 99,8 a 100% de identidade com as seqüências correspondentes de Rickettsia parkeri no GenBank. Todos os 31 carrapatos tiveram o DNA extraído, sendo processados pela PCR para um fragmento do gene gltA e para um fragmento do gene ompA. Três (9,7%) foram positivos a PCR para o gene gltA e os mesmos 3 carrapatos foram positivos para o ompA, sendo exatamente os 3 carrapatos previamente positivos ao teste de hemolinfa). O material amplificado destes 3 carrapatos para o fragmento de gene ompA foi processado para o sequenciamento automático de nucleotídeos resultando em 100% de identidade com a seqüência correspondente de Rickettsia parkeri no GenBank. Este trabalho relata pela primeira vez a bactéria R. parkeri no Brasil, o que foi confirmado pelo isolamento do agente em cultivo de células / In January 2005, 31 adult free-living ticks of the species Amblyomma triste were collected in the CESP rural farm located in the city of Paulicéia, state of São Paulo, Brazil. In the laboratory, 3 of these ticks were positive by the hemolymph test, showing structures compatible with Rickettsia within the hemocytes. Attempts to isolate Rickettsia were performed in two hemolymph-positive ticks by the Shell-vial technique. One isolate was successful obtained, being established in Vero cell culture, with several passages performed. DNA extracted from infected cells was submitted to PCR targeting fragments of four Rickettsia genes: gltA, htrA, ompA and ompB. DNA sequences obtained from PCR products of these four genes showed 99.8 to 100% of similarity with corresponding sequences of Rickettsia parkeri in the Genbank. DNA was extracted from all 31 ticks and processed by PCR targeting a fragment of the rickettsial gltA gene and a fragment of ompA gene. Three (9.7%) ticks were positive for both genes, being the same ticks previously positive by the hemolymph test. PCR products of these ticks were sequenced, being 100% identical to the corresponding sequence of Rickettsia parkeri in GenBanK. This study perfoms the first report of R. parkeri in Brazil, confirmed by the isolation of the agent in cell culture

Amblyomma cajennense é a principal espécie de carrapato incriminada na transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da febre maculosa brasileira (FMB), no Brasil e outros países da América do Sul. O presente trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar e quantificar a ocorrência das transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii em A. cajennense, verificando o efeito da infecção nos parâmetros biológicos do carrapato, e finalmente, a capacidade de larvas, ninfas e adultos transmitirem a bactéria para vertebrados. Para tal, cobaias (Cavia porcellus) infectadas experimentalmente com R. rickettsii foram infestadas com larvas e ninfas, para alimentação dos adultos de A. cajennense foram utilizados coelhos infectados. A biologia desses carrapatos expostos à R. rickettsii foi acompanhada até a geração seguinte de ninfa. Amostras de cada estágio evolutivo (larva, ninfa, adulto, ovo, larva, ninfa) foram testadas por PCR em tempo real para determinar a freqüência de carrapatos infectados por Rickettsia. Também foram quantificadas as transmissões transovariana e transestadial de R. rickettsii no carrapato A. cajennense. Cobaias e coelhos não infectados, utilizadas para infestação de cada um dos estágios parasitários do carrapato, foram avaliadas clinicamente e por sorologia, a fim de verificar a ocorrência da transmissão de R. rickettsii para esses animais. Em todas as infestações com carrapatos expostos previamente a R. rickettsii dentro de uma mesma geração, os animais adoeceram com febre alta (temperatura retal >40oC), lesão escrotal e alta letalidade, indicando a transmissão transestadial de R. rickettsii nos carrapatos, sendo esta confirmada por PCR e sorologia dos animais. Quanto à transmissão transovariana, esta ocorre em baixa quantidade nos grupos GL (infectado na fase de larva) e GN (infectado na fase de ninfa), pois das 12 cobaias (seis do grupo GL e seis do grupo GN), apenas três apresentaram sinais clínicos, e somente uma veio a óbito. Um total de oito animais foram positivos à RIFI (reação de imunofluorescência indireta), porém destes, seis apresentaram títulos baixos, entre 128 e 512, provavelmente devido a um pequeno desafio imunológico. As cobaias infestadas com larvas oriundas de fêmeas pertencentes ao grupo GA (infectado na fase adulta) não se apresentaram clinicamente alteradas nem sorologicamente reativas. Sugerindo que transmissão transovariana no grupo GA seja algo raro, pois apesar da progênie de uma das fêmeas ter sido positiva à PCR, nenhuma das cobaias infestadas com larvas ou ninfas de segunda geração manifestou quaisquer evidências do contato com R. rickettsii. Paralelamente, carrapatos não expostos a R. rickettsii (grupo controle GC) foram mantidos nas mesmas condições dos carrapatos infectados, para avaliar a existência de um possível efeito deletério da infecção por R. rickettsii na biologia do carrapato, os quais foram evidenciados com a maior mortalidade de larvas infectadas do grupo GL na primeira e na segunda gerações, além de alterações nos parâmetros biológicos das fêmeas ingurgitadas dos grupos expostos a R. rickettsii. Os resultados encontrados comprovam que a R. rickettsii é maléfica ao A. cajennense, bem como a existência de transmissão transestadial e transmissão transovariana, porém esta ultima em baixa quantidade. Isto ressalta a importância de hospedeiros amplificadores e de outros carrapatos na epidemiologia da Febre Maculosa Brasileira. / Amblyomma cajennense is the main tick species incriminated in the transmission of Rickettsia rickettsii, the etiological agent of Brazilian spotted fever, in Brazil and in other South American countries. The present work aimed to evaluate and quantify the transovarial and transstadial of R. rickettsii in A. cajennense, verifying the effect of the infection on biological parameters of the tick, and finally, to evaluate the capacity of larvae, nymphs, and adults to transmit the bacterium to vertebrates. For these purposes, guinea pigs (Cavia porcellus), experimentally infected with R. rickettsii, were artificially infested with uninfected larvae and nymphs, while adult ticks were allowed to infest experimentally-infected rabbits (Oryctolagus cuniculus). The biology of these R. rickettsii-exposed ticks was accomplished until the next generation of nymphs, always having samples of each developmental stage (F1 larva, nymph, and adult, and F2 egg, larva, and nymph) tested by real-time PCR to determine the frequency of infected ticks. In parallel, uninfected control ticks were exposed simultaneous to the same protocols. Infested guinea pigs and rabbits were evaluated clinically and for serology, to verify the occurrence of transmission of R. rickettsii to these animals. In all infestations with ticks previously exposed to R. rickettsii, within the same generation, there were infested animals that presented high fever (rectal temperature >40oC), scrotal lesion, and high lethality, indicating transstadial transmission of R. rickettsii in the ticks, confirmed by PCR on ticks and serology of the animals. Regarding transovarial transmission, it occurred at low levels in females that had been exposed to R. rickettsii during the larval stage (GL) and during the nymphal stage (GN), since only 3 out of 12 guinea pigs (six from GL, and six from GN) infested with F2 larvae presented clinical alterations, with a single lethality. However, eight animals became seropositive by IFA (immunofluorescence assay), from which six had low titers anti-R. rickettsii, between 128 and 512, possibly due to weaker immunological challenges. Guinea pigs exposed to larvae derived from GA females (exposed to R. rickettsii during the adult stage) did not ´present any clinical alteration nor became serologically positive, indication that transovarial transmission is rare in this group. Despite of a single progeny that became PCR-positive, out of others that were all negative, no guinea pig infested with F2 larvae or nymphs from GA females showed evidence that they were in contact with R. rickettsii, similarly to the control group. In relation to a possible effect of R. rickettsii in the tick survival and developmental, there were a higher mortality of infected larvae from the GL group in both first and second laboratory generations, and lower reproductive performance of engorged females from the infected groups. The results show that R. rickettsii has deleterious effects to A. cajennense. There are both trasstadial and transovarial transmissions of R. rickettsii in A. cajennense, however transovarial transmission is at low rates, highlighting the importance that amplifier hosts and other tick species should have in the epidemiology Brazilian spotted fever.

Febre Maculosa Brasileira (FMB), doença causada por riquétsias do grupo da febre maculosa (RGFM) transmitidas por Amblyomma cajennense, é geralmente fatal quando não tratada precocemente. Métodos laboratoriais usuais (cultura em células Vero e RIFI) não permitem diagnósticos conclusivos da maioria dos casos verificados no Estado de São Paulo, onde o agente ainda não está devidamente caracterizado. Através da PCR e Southern blotting, foram pesquisados genes riquetsiais (gltA, ompA e ompB), em 20 amostras de coágulos sanguíneos humanos sintomáticos (São Paulo), 19 com resultados prévios negativos por métodos convencionais. Cerca de 95% dos pacientes foram positivos pela PCR. A seqüência de bases do gene ompB, a amostra 3, apresentou similaridade de 98% com Rickettsia ricketsii. Dos 75 lotes de A. cajennense (n=1483), coletados na mesma região endêmica, 09 resultaram positivos em células Vero e, em 22 detectou-se o gene ompA (RGFM). Sequenciamento e análise das amostras amplificadas poderão contribuir para o completo esclarecimento do ciclo das riquétsias na região. / Brazilian spotted fever (BSF), a disease caused by spotted fever group rickettsiae (SFGR) transmitted by Amblyomma cajennense, is generally fatal when not early treated. Common laboratory methods (Vero cell culture and immunofluorescence indirect assay) are not efficient on the diagnosis in most of the cases observed in State of São Paulo, where the agent is not well characterized yet. By means of PCR and Southern Blotting rickettsial genes (gltA, ompB and ompA) were searched in samples of coagulum sanguineous from 20 presenting symptom patients (São Paulo), from these, 19 of them have presented negative results by conventional methods. About 95% of the patients were positive and the ompB base pair sequences amplified showed 98% of similarity with Rickettsia ricketsii. From the 75 lots of A. cajennense (n=1483), collected at the same endemic region, 9 were positive in Vero cell cultures and in 22 it was possible to detect the ompA gene (SFGR). Sequencing and analysis of the amplified samples can contribute to the complete understanding of the rickettsiae biological cycle.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-01-11T12:09:07Z No. of bitstreams: 1 2016 - Joao Bosco Varela.pdf: 1890246 bytes, checksum: 359c15e2f52f2ea873d394cbbfa5479c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-11T12:09:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Joao Bosco Varela.pdf: 1890246 bytes, checksum: 359c15e2f52f2ea873d394cbbfa5479c (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / The study of ticks and tick-borne disease is increasingly dependent upon the use of molecular biological techniques that are employed in pathogen detection and for the accurate identification of ticks, particularly immature stages. The successful application of molecular methods, principally the polymerase chain reaction (PCR), can only be achieved if the DNA present in the tick was effectively preserved and could be extracted efficiently. The current study compared three fixatives (RNAlater, zinc salts (ZN) and isopropanol) for the ability to preserve the nuclear and mitochondrial (mt) DNA of larvae and nymphs of Amblyomma parvum and larvae of Amblyomma scultptum. DNA was extracted from ticks at times between 72h to 12 months post fixation using a phenol-chloroform procedure and examined using PCR assays for nuclear (internal transcribed spacer 2; ITS2) and mitochondrial (12S rDNA, subunit 1 of cytochrome c oxidase (COI) and D-loop) sequences. The efficiency of amplification was analyzed quantitatively (number of samples which produced amplicon) and qualitatively (relative intensity of bands observed on agarose gels). It was observed that the ITS2 sequence could be amplified in the majority (93,39%, n= 283/303) of the samples, in each of the three fixatives, although qualitative differences were observed, particularly with A. sculptum preserved in ZN. In contrast, fixation in isopropanol effectively abolished the ability to amplify the mitochondrial marker sequences of A. parvum and also resulted in inferior amplification (qualitative), of the D-loop target with A. sculptum. Those effects were observed in samples fixed for as little as 72h. The detrimental effects of isopropanol were also observed in samples extracted using an alkaline lysis method (Hotshot). Samples of A. parvum larvae preserved in RNAlater for 30 months showed an amplification efficacy of 100% in the ITS2 and COI assays, irrespective of the extraction method. Mitochondrial sequences are a central component of the majority of molecular studies of ticks. The findings of this study indicate that isopropanol should be avoided as a fixative for immature stages of ticks. Instead, the use of RNAlater is recommended in order to permit the consistent recovery of amplifiable mtDNA / O estudo de carrapatos e doen?as transmitidas por eles ? cada vez mais dependente da utiliza??o de t?cnicas de biologia molecular que s?o empregadas na detec??o de pat?genos, e a acurada identifica??o desses artr?podes, em particular os est?gios imaturos. A aplica??o bem-sucedida dos m?todos moleculares, principalmente, a rea??o em cadeia da polimerase (PCR), s? pode ser alcan?ada se o DNA presente no carrapato foi eficazmente preservado e extra?do de forma eficiente. O estudo comparou tr?s fixadores (RNAlater, sais de zinco (ZN) e isopropanol) avaliando a sua capacidade de preservar DNA mitocondrial (mtDNA) e nuclear de larvas e ninfas de Amblyomma parvum e larvas de Amblyomma scultptum. O DNA foi extra?do dos carrapatos, em tempos entre 72h e 12 meses ap?s a fixa??o por meio da t?cnica de fenol-clorof?rmio e lise alcalina (?Hot Shot?) e examinadas usando ensaios de PCR para sequ?ncias nucleares (espa?ador interno transcrito 2; ITS2) e mitocondriais (12S rDNA, subunidade 1 do citocromo c oxidase (COI) e D-loop). A efici?ncia de amplifica??o foi analisada quantitativamente (n?mero de amostras que produziram ?amplicon?) e qualitativamente (intensidade relativa das bandas observadas em g?is de agarose). Foi observado que a sequ?ncia ITS2 foi amplificada na maioria (93,39%, n= 283/303) das amostras em cada um dos tr?s fixadores, embora tenham sido observadas diferen?as qualitativas, particularmente com A. sculptum preservado em ZN. Em contraste, a fixa??o em isopropanol afetou negativamente a capacidade de amplificar as sequ?ncias dos marcadores mitocondriais de A. parvum e tamb?m resultou na amplifica??o inferior (qualitativa), do alvo D-loop com A. sculptum. Esses efeitos foram observados em amostras fixadas por apenas 72 horas. Os efeitos prejudiciais de isopropanol tamb?m foram observados igualmente em amostras extra?das usando um m?todo de lise alcalina (?HotShot?). As amostras de larvas de A. parvum preservadas em RNAlater durante 30 meses, mostrou uma efic?cia de amplifica??o de 100% nos ensaios para ITS2 e COI, independentemente do m?todo de extra??o usado. Sequ?ncias mitocondriais s?o um componente central da maioria das pesquisas moleculares com carrapatos. Os resultados deste estudo indicam que isopropanol deve ser evitado como um fixador para fases imaturas de carrapatos. Em vez disso, o uso de RNAlater ? recomendado, a fim de permitir a recupera??o consistente de mtDNA amplific?ve

Foi conduzido um estudo sobre a ecologia da Febre Maculosa Brasileira, causada pela bactéria Rickettsia rickettsii, em uma área endêmica, no distrito de Taiaçupeba, Município de Mogi das Cruzes, SP. Para o melhor entendimento de quais animais silvestres são os hospedeiros das formas imaturas do carrapato vetor, Amblyomma aureolatum, foram capturados entre janeiro e dezembro de 2005, 243 animais silvestres em dois fragmentos de mata. Foram utilizadas estações de pitfall para captura de roedores e pequenos didelfídeos e armadilhas tomahawk para captura de Didelphis aurita, além da colocação de redes de neblina (14m x 3m cada) para captura de aves. Os animais foram sacrificados e tiveram sangue, baço e fígado extraídos. O baço de cada animal foi submetido a testes moleculares e bioensaios para pesquisa de bactérias do gênero Rickettsia. Os carrapatos capturados dos animais foram submetidos à identificação taxonômica morfológica ou molecular e à pesquisa de bactérias do gênero Rickettsia. Foram colhidos carrapatos dos gêneros Amblyomma, Haemaphysalis e Ixodes. Imaturos do carrapato Amblyomma aureolatum foram colhidos parasitando três indivíduos da espécie de Passeriforme Pyriglena leucoptera. Não foram encontrados exemplares desta espécie de carrapato parasitando roedores ou didelfídeos. Nenhum animal foi identificado sendo infectado por riquétsias, enquanto que três espécies de riquétsias, sendo duas do grupo da febre maculosa, foram identificadas infectando carrapatos das espécies Amblyomma longirostre, Ixodes aragaoi e Ixodes loricatus. Nenhum carrapato foi encontrado naturalmente infectado com a bactéria R. rickettsii. O estudo mostrou detalhes do ciclo de vida do carrapato A. aureolatum que podem auxiliar o entendimento do ciclo enzoótico da febre maculosa brasileira. / Brazilian Spotted Fever (BSF) is a tick-borne-disease caused by the bacterium Rickettsia rickettsii. An ecological study was conducted in a BSF-endemic area in Taiaçupeba County, Mogi das Cruzes Municipality, State of São Paulo. With the purpose to determine natural hosts of the immature stages of the tick vector Amblyomma aureolatum, a total of 243 wild animals were captured in two fragments of Atlantic Forests between January and December of 2005. Pitfall trap stations were used for capture of rodents and small didelphids while tomahawk traps were used for Didelphis aurita capture. Mist nets (14m x 3m each) were used for bird capture. Captured animals were scarified and blood, spleen and liver were extracted. Spleen samples were submitted to molecular and bioassay tests for rickettsia research. Captured ticks were submitted to morphological or molecular taxonomic identification and to rickettsia research. Ticks from the genera Amblyomma, Haemaphysalis and Ixodes were collected. Immature tick stages of A. Aureolatum were collected on three individuals of the bird species Pyriglena leucoptera, but no other A. Aureolatum tick was found infesting neither rodents or didelphids. No animal was found infected by rickettsiae whereas three rickettsiae, two of them belonging to Spotted Fever Group, were found infecting the ticks Amblyomma longirostre, Ixodes aragaoi and Ixodes loricatus. No tick was found infected by R. Rickettsii, the agent of BSF. The present study revealed details about the A. Aureolatum life cycle in natural conditions, contributing for a better understanding about the enzootic cycle of BSF.

A doença de Lyme é uma doença causada pelas bactérias do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato que são transmitidas por carrapatos do complexo Ixodes ricinus. A distribuição geográfica dessas bactérias é confirmada no Hemisfério Norte (America do Norte, Europa e Ásia). Suspeita-se que uma enfermidade, compatível com doença de Lyme no Brasil, esteja provavelmente relacionada a uma espécie de Borrelia diferente das espécies causadoras de doença de Lyme no hemisfério Norte e que o vetor sejam carrapatos do gênero Amblyomma. Por estas razões, a doença brasileira passou a ser chamada de Doença de Lyme-Símile (DLS). A borreliose aviária é causada pela Borrelia anserina, que apresenta distribuição cosmopolita. É transmitida por carrapatos argasideos do gênero Argas. O presente trabalho foi dividido em dois capítulos: o primeiro investigou a presença de Borrelia spp em áreas onde foram relatados casos humanos de DLS no Estado de São Paulo. No segundo capítulo, é relatado o primeiro isolamento em meio BSK e a caracterização molecular de uma cepa de espiroqueta aviária presumidamente identificada como B. anserina, no Brasil. Para o primeiro capítulo, foram processados um total de 349 carrapatos Amblyomm cajennense adultos coletados em áreas com suspeita de DLS, nove amostras de sangue ou tecidos de pacientes humanos com diagnóstico clínico e sorológico de DLS, duas amostras de caldas de meio BSK previamente inoculado com tecidos ou sangue de pacientes com suspeita de DLS, e três amostras de caldas de meio BSK previamente inoculado com carrapatos coletados de áreas com suspeita de DLS. Essas amostras tiveram seu DNA extraído e testado pela nested-PCR com primers específicos para porções do gene flagelina B (flaB), aptos a amplificar porções deste gene de qualquer espécie de Borrelia. Todas as amostras foram negativas pela nested-PCR, não evidenciando a presença de Borrelia sp nas amostras avaliadas. Para o segundo capítulo, foi utilizada uma amostra de espiroqueta aviária originária de carrapatos Argas miniatus, colhidos em um galinheiro no Município de Pedro Leopoldo, MG. O isolamento in vitro e caracterização molecular da espiroqueta aviária foi feito a partir da inoculação de soro infectado, contendo espiroquetas viáveis, em meio BSK. O soro, baço, fígado e o próprio cultivo foram utilizado para amplificação na PCR para os genes rrs e flaB, seguido de seqüenciamento dos mesmos. O isolamento da espiroqueta foi obtido com sucesso, com várias passagens realizadas. A análise genética das seqüências do isolado mostrou 99.8% (483 de 484-bp) e 98.7% (754 de 764-bp) de similaridade às seqüências correspondentes dos genes rrs e flaB de B. anserina, respectivamente, disponíveis no GenBank. Pela análise filogenética inferida pela seqüência parcial do gene flaB, a cepa Brasileira agrupou-se com a seqüência de B. anserina dos EUA. Os resultados indicam a cepa brasileira estudada, designada de cepa PL, pertence à espécie B.anserina. / Lyme disease is caused by bacteria belonging to the complex Borrelia burgdorferi sensu lato, which are transmitted by ticks of the Ixodes ricinus complex. The distribution of these bacteria are restricted to the northern hemisphere (North America, Europe, and Asia). Lyme disease-like cases have been reported in Brazil, but it is possible that another Borrelia species is involved in these cases, and ticks of the genus Amblyomma have been implicated as vectors. Due to these reasons, the disease in Brazil has been referred as Lyme Disease-Simile (LDS). Borrelia anserina, the agent of avian spirochetosis, has a wordwide distribution, where it is transmitted primarily by ticks of the genus Argas. The present study was divided in two chapters: the first one evaluated the presence of Borrelia spp in areas of the state of São Paulo where LDS have been reported. The second chapter reports the first in vitro isolation in BSK medium and molecular characterization of a spirochete strain from Brazil, presumably identified as B. anserina. For the first chapter, a total of 349 adult ticks (Amblyomma cajennense) collected in areas where LDS cases have been reported were processed. In addition, nine human blood or tissue samples from patients with clinical and serological diagnostic of LDS, two samples from BSK medium previously inoculated with samples of skin or blood of LDS patients, and three samples of BSK medium previously inoculated with tick samples were also processed. All these samples were processed for DNA extraction and then tested by nested-PCR employing primers targeting a portion of the flagelin B gene (flaB),which amplify a flaB fragment in all known Borrelia species. All samples were negative by this nested-PCR, showing no evidence of Borrelia sp in the tested samples. The second chapter evaluated an avian spirochete strain originated from Argas miniatus ticks from Pedro Leopoldo municipality, state of Minas Gerais. DNA fragments of the rrs (16S rRNA) and flab genes were amplified by PCR and sequenced to determine phylogenetic similarities. The resulting sequences were 99.8% (483 of 484) and 98.7% (754 of 764) similar to GenBank corresponding sequences of B. anserina rrs and flaB genes, respectively. By neighbor-joining phylogenetic analysis, the flaB sequence of the Brazilian strain clustered in a monophyletic group with the sequence of B. anserina under 100% bootstrap support. The isolate was successfully isolated in BSK medium, with seven passages performed. The spirochete crude antigen, fixed in glass slides, showed strong immunfluorescence reactivity with sera from chickens previously inoculated with the isolate. The spirochete strain isolated in the present study was genetically identified as B. anserina, labeled as strain PL.

Considered the most abundant carnivore in the world, the domestic dog can cause negative impacts when he is present in forested areas. Dogs can develop different roles in the environment in which they live as hunter, shepherd, guardian, companion and even more affective relationships in which the dog is seen like a family member. These roles are closely linked to the way of life of their owners. In Caraguatatuba City, dogs that live in the vicinity of Serra do Mar, an important Atlantic Rainforest Conservation Unit, are commonly parasitized by Amblyomma ovale. From data obtained through three years of monitoring in three different areas around the Serra do Mar State Park Caraguatatuba City, it has been possible to generate results that help in understanding the causes and consequences of the dog presence in the surroundings of the forest as well as its participation in the epidemiology of riquetsiosis and rangeliosis. Comparing the lifestyle of the owners and the role of their dogs in the environment in which they are inserted, it has been possible to estimate the risk of transmission of Rickettsia parkeri to these dogs. In addition, through the molecular analysis of the A. ovale individuals collected on dogs and also in free life, it has been possible to infer about the population structure and genetics of this parasite in Serra do Mar, which is an important ecological corridor for the Atlantic Rainforest wild fauna. / Considerado o carnívoro mais abundante do mundo, o cão doméstico pode causar impactos negativos quando presente em áreas florestadas. Cães podem desenvolver diferentes papéis no ambiente em que vivem desde caçador, pastor, guardião, companheiro e até mesmo relações mais afetivas em que o cão é visto como um membro da família. Estes papéis estão intimamente ligados ao modo de vida de seus proprietários. Em Caraguatatuba, cães que vivem no entorno da Serra do Mar, uma importante Unidade de Conservação da Mata Atlântica, são comumente parasitados por Amblyomma ovale. A partir de dados obtidos através de três anos de monitoramento em três diferentes áreas do entorno do Parque Estadual Serra do Mar Núcleo Caraguatatuba, foi possível gerar resultados que auxiliam no entendimento das causas e consequências da presença do cão no entorno da floresta e sua participação na epidemiologia da riquetsiose e rangeliose. Comparando o estilo de vida dos proprietários e o papel do cão no ambiente em que ele está inserido, foi possível estimar o risco de transmição de Rickettsia parkeri para estes cães. Além disso, através da análise molecular dos indivíduos de A. ovale coletados em cães e também coletados em vida livre, foi possível inferir sobre a estrutura e genética populacional deste parasita na Serra do Mar em Caraguatatuba, importante corredor ecológico para a fauna silvestre da Mata Atlântica.

Juntamente com o estágio larval, o estágio ninfal de carrapatos do gênero Amblyomma é o mais agressivo para seres humanos que adentram áreas habitadas por animais silvestres e alguns domésticos. No entanto, devido à inexistência de descrição morfológica do estágio ninfal de muitas das espécies de Amblyomma que ocorrem no Brasil, juntamente com a falta de uma chave taxonômica para esses carrapatos, muito pouco se sabe sobre a biologia e ecologia das ninfas de Amblyomma spp que parasitam humanos e animais no país. A grande maioria dos estudos tem se concentrado no estágio adulto de Amblyomma spp, por se tratar do único em que há descrições morfológicas e chave taxonômica para todas as espécies conhecidas. No presente estudo, a descrição morfológica do estágio ninfal, com características importantes ilustradas através da microscopia eletrônica de varredura, foi realizada para ninfas das seguintes 15 espécies de carrapatos do gênero Amblyomma que ocorrem no Brasil, para as quais o estágio ninfal permanecia sem descrição: Amblyomma aureolatum (Pallas, 1772), Amblyomma auricularium (Conil, 1878), Amblyomma calcaratum Neumann, 1899, Amblyomma coelebs Neumann, 1899, Amblyomma fuscum Neumann, 1907, Amblyomma humerale Koch, 1844, Amblyomma incisum Neumann, 1906, Amblyomma latepunctatum Tonelli-Rondelli, 1939, Amblyomma naponense (Packard, 1869), Amblyomma nodosum Neumann, 1899, Amblyomma ovale Koch, 1844, Amblyomma pacae Aragão, 1911, Amblyomma pseudoconcolor Aragão, 1908, Amblyomma scalpturatum Neumann, 1906, Amblyomma varium Koch, 1844. Em adição, o estágio ninfal das seguintes 12 espécies de Amblyomma, que haviam sido previamente descritas, foram redescritas: Amblyomma brasiliense Aragão, 1908, Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787), Amblyomma dissimile Koch, 1844, Amblyomma dubitatum Neumann, 1899, Amblyomma longirostre (Koch, 1844), Amblyomma oblongoguttatum Koch, 1844, Amblyomma parkeri Fonseca e Aragão, 1952, Amblyomma parvum Aragão, 1908, Amblyomma romitii Tonelli-Rondelli, 1939, Amblyomma rotundatum Koch, 1844, Amlyomma tigrinum Koch, 1844, Amblyomma triste Koch, 1844. As descrições e redescrições totalizaram 27 espécies, não contemplando apenas duas (Amblyomma geayi Neumann, 1899 e Amblyomma goeldii Neumann, 1899) das 29 espécies de Amblyomma que ocorrem de forma estabelecida no Brasil. As ninfas utilizadas para a descrição ou redescrição morfológica foram provenientes de colônias de laboratório, iniciadas com fêmeas adultas previamente identificadas e colhidas na natureza. A única exceção foi A. parkeri, que foi redescrita a partir de um único exemplar disponível em coleção. Para cada espécie, são apresentadas ilustrações obtidas através de microscopia eletrônica de varredura de pelo menos quatro regiões anatômicas dos carrapatos: capítulo dorsal, capítulo ventral, escudo dorsal e coxas I, II, III, IV. Por fim, foi construída uma chave dicotômica para auxílio na identificação taxonômica do estágio ninfal de 27 espécies de Amblyomma estabelecidas no Brasil. / Together with the larval stage, the nymphal stage of ticks of the genus Amblyomma are the most aggressive ticks for humans entering in areas inhabited by wild life and some domestic animals. However, due to the inexistence of morphological description of the nymphal stage of many Amblyomma species that occur in Brazil, together with the lack of a taxonomic key for these ticks, little or nothing is known about the biology and ecology of Amblyomma spp nymphs that parasitize humans and animals in the country. The great majority of the studies have concentrated in the tick adult stage, for which morphological descriptions and taxonomic keys are available for all known species. In the present study, the morphological description of the nymphal stage, illustrating important characters through scanning electron microscopy, was performed for nymphs of following 15 Amblyomma species that occur in Brazil, for which the nymphal stage had never been described: Amblyomma aureolatum (Pallas, 1772), Amblyomma auricularium (Conil, 1878), Amblyomma calcaratum Neumann, 1899, Amblyomma coelebs Neumann, 1899, Amblyomma fuscum Neumann, 1907, Amblyomma humerale Koch, 1844, Amblyomma incisum Neumann, 1906, Amblyomma latepunctatum Tonelli-Rondelli, 1939, Amblyomma naponense (Packard, 1869), Amblyomma nodosum Neumann, 1899, Amblyomma ovale Koch, 1844, Amblyomma pacae Aragão, 1911, Amblyomma pseudoconcolor Aragão, 1908, Amblyomma scalpturatum Neumann, 1906, Amblyomma varium Koch, 1844. In addition, the nymphal stage of the following 12 Amblyomma species, which had been previously described, were redescribed: Amblyomma brasiliense Aragão, 1908, Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787), Amblyomma dissimile Koch, 1844, Amblyomma dubitatum Neumann, 1899, Amblyomma longirostre (Koch, 1844), Amblyomma oblongoguttatum Koch, 1844, Amblyomma parkeri Fonseca e Aragão, 1952, Amblyomma parvum Aragão, 1908, Amblyomma romitii Tonelli-Rondelli, 1939, Amblyomma rotundatum Koch, 1844, Amblyomma tigrinum Koch, 1844, Amblyomma triste Koch, 1844. The descriptions and redescriptions totalized 27 species. Only two species (Amblyomma geayi Neumann, 1899 and Amblyomma goeldii Neumann, 1899) out of the 29 Amblyomma species established in Brazil were not included in the present study. Nymphal specimens used for morphological descriptions or redescriptions were derived from laboratory colonies that were started with field-collected adult ticks, previously identified to species. The only exception was A. parkeri, which was redescribed from a single nymphal specimen that was available in a tick collection. For each tick species, scanning electron microscopy-photographs are presented for at least four anatomic regions: dorsal capitulum, ventral capitulum, dorsal scutum, and coxae I, II, III, IV. Finally, a dichotomic key was constructed to support taxonomic identification of the nymphal stage of 27 Amblyomma species established in Brazil.