京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13112号 / 論医博第2130号 / 新制||医||1022(附属図書館) / (主査)教授 浅野 雅秀, 教授 瀬原 淳子, 教授 近藤 玄 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24790号 / 医博第4982号 / 新制||医||1066(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 竹内 理, 教授 斎藤 通紀, 教授 生田 宏一 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

O objetivo deste estudo foi caracterizar morfologicamente o desenvolvimento inicial da gestação bovina proveniente de monta natural, com idades compreendidas entre 15 a 70 dias, e de fecundação in vitro (FIV) com 35 dias, com ênfase no desenvolvimento placentário inicial, e diferenciação das estruturas extra embrionárias. Para tanto, foram utilizados 141 conceptos, provenientes de monta natural, e sete conceptos obtidos pela técnica de FIV. Após as coletas, os conceptos foram dissecados, mensurados macroscopicamente e fotodocumentados. As membranas extra-embrionárias foram cortadas em fragmentos de 5 cm2, e, em seguida fixadas em paraformoldeído 4%, para análise por microscopia de luz, e glutaraldeído 2,5%, para utilização em microscopia eletrônica de varredura e transmissão. As membranas extra-embrionárias e fetais apresentaram graus variáveis de desenvolvimento ao longo dos períodos analisados. O aparecimento macroscópico da vascularização do alantóide, sua tentativa de se fundir com o cório e o aparecimento efetivo dos primeiros cotilédones em desenvolvimento, foram eventos observados em embriões a partir de 1,9±0,27 cm de \"Crown-Rump\" (CR) (30 a 40 dias da gestação). O CR médio, o peso do embrião, o peso do saco gestacional e os comprimentos do cório e âmnio aumentaram gradativamente com o evoluir da gestação. O epitélio alantoidiano apresentou um dimorfismo celular a partir de 0,9 cm de CR (15 a 20 dias de gestação), porém, mostrou-se imaturo até o feto atingir o comprimento de 7,2 cm de CR (60 a 70 dias da gestação). O trofoblasto apresentou células mononucleadas e células gigantes binucleadas em diferentes níveis ao longo da gestação. O saco vitelino persistiu até 70 dias de gestação, e o seu epitélio apresentou indícios de atividade funcional até 50 dias de gestação. De todos os parâmetros mensurados na análise macroscópica, somente o comprimento o CR e o saco vitelino apresentaram diferença significativa entre os conceptos de monta natural e de FIV. Nos conceptos de monta natural, o comprimento do saco vitelino foi de 5,53 cm, em média, e nos conceptos de FIV, de apenas 1,07 cm. Todavia, faz-se necessário analisar um número maior de animais submetidos a FIV para corroborar a diferença encontrada nestas medidas. Os resultados sugerem ainda a existência de uma placenta vitelínica ativa, importante para a manutenção da gestação, que se estabelece temporariamente entre a placenta coriovitelínica e alantovitelínica transitória e a placenta cório-alantóide definitiva. / The main goal of this study was to describe morphology and the early gestational development of 15 to 70 day-old bovine embryos obtained by natural mating and 35 day-old bovine embryos obtained by in vitro fertilization (IFV) technique. One hundred and forty-one concepts originated by natural mating and seven by IVF technique were used. All concepts were dissected, macroscopically measured and photographed. Extraembryonic membranes were cut in 5 cm2 fragments and fixed in 4% paraformoldehyde for light and Scanning Electron Microscopy (SEM) and in 2.5% glutaraldehyde for Transmition Electron Microscopy (TEM). Ali membranes showed different stages of development during analyzed periods. The beginning of allantois macroscopic vascularization, the attempt of fusion between allantois and chorium membranes and the effective development of the first cotyledons were observed in 30-to-40 day-old embryos with 1.9± 0.24 cm of Crown-Rump (CR) length. The average CR, the embryos and gestational sac weight, the chorion and amnion length increased during gestation. The allantoic epithelia showed a cellular dimorphism with 0.9 em CR, however, the maturation has not happened until the foetal length of 7.2 em CR. The trophoblast showed different levels of mononucleate cells and binucleate giant cells. The yolk sac persisted until 70 days of gestation and the epithelium seemed functionally activated until 50 days of gestation. The CR and yolk sac size were the only measured macroscopic parameter showingdifference between natural mating and FIV concepts. Yolk sac size presented average values of 5.53 cm and 1.07 cm for natural mating and FIV concepts, respectively. Therefore, it is necessary to analyze a higher number of FIV embryos to corroborate that observed yolk sac size difference. All results obtained in this study suggest the existent of an active vitelline placenta, important to the gestational maintenance and temporarily establish between the transitory choriovitelline placenta and the permanent chorioallantoic placenta.

A membrana amniótica é uma das membranas fetais presentes no período gestacional e que é considerada uma ferramenta potencial no tratamento de diversas patologias, como na cicatrização de feridas de pele e córnea, hérnias, cirurgias reconstrutivas e prevenção de aderências. As células-tronco (CT) obtidas de membrana amniótica apresentam alta taxa de proliferação e plasticidade, além de propriedades imunomoduladoras que participam no processo de tolerância materno-fetal. Devido à dificuldade e a escassez de estudos envolvendo a membrana amniótica humana em diferentes estágios gestacionais, optamos pela escolha do modelo canino, pois pode ser considerado um modelo ideal devido às semelhanças genéticas e fisiológicas com humanos. Baseado no potencial das CT de membrana amniótica, os objetivos deste trabalho foram caracterizar as CT de membrana amniótica canina (MAC) em diferentes estágios gestacionais e avaliar a expressão de genes relacionados à imunomodulação. Para tanto, foram utilizados 20 fetos caninos, sem raça definida com três idades gestacionais, terço inicial (20-30 dias) (n=7), terço médio (31-45 dias) (n=7) e terço-final (46-63 dias) (n=6), oriundos de programas de castrações. As células das MAC foram caracterizadas por meio de testes de viabilidade celular, curva de crescimento, unidade formadora de colônia (UFC-F), diferenciação in vitro, imunofenotipagem celular e potencial pluripotente. Para avaliação dos aspectos imunomoduladores, as células foram submetidas a RT-qPCR, com intuito de determinar a expressão gênica de IDO, HGF, EGF, PGE2, IL-6 e IL10. Como resultados, as células de MAC apresentaram morfologia fibroblastóide e aderência ao plástico com viabilidade celular de 83,3% em terço inicial, 80,1% em terço médio e 75,22% em terço final. Na análise da curva de crescimento, as células apresentaram pico de crescimento em segunda passagem, com posterior queda e uma tendência estacionária. Na UFC-F, obtivemos uma média de 145 colônias em terço inicial, 142,3 colônias em terço médio e 127,3 colônias em terço final. Na diferenciação in vitro, as células se diferenciaram em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas após 21 dias de cultivo celular. Na imunofenotipagem celular, as células de terço inicial obtiveram marcação de CD90 (31,7%), CD105 (5,6%), CD34 (0,3%) e CD45 (0,4%), terço médio de CD90 (36,7%), CD105 (6,3%), CD34 (0,2%0 e CD45 (0,4%), terço final CD90 (67,1%), CD105 (96,4%), CD34 (4,4%) e CD45 (2,0). Na avaliação imunomoduladora, observamos a expressão qualitativa dos genes IDO, HGF, EGF, PGE2 e a não expressão dos genes IL-6 e IL-10. Na expressão quantitativa, houve somente a expressão do gene IDO, com maior expressão em terço médio e final. Neste contexto, concluímos que as células de MAC de diferentes estágios gestacionais apresentam características compatíveis com CT mesenquimais e que a idade gestacional de terço final apresentou melhores resultados. / The amniotic membrane is one of the fetal membranes present during gestation and it is considered a potential tool to treat many pathologies. Stem cells (SC) from the amniotic membrane present a high proliferation and plasticity ratio, in addition to immunomodulatory properties that participate in the mother-fetus tolerance process. Due to high difficulty and lack of research involving human amniotic membrane at different gestational stages we chose to use a canine model, as it can be considered an ideal model due to genetic and physiological similarities to humans. Based on the potential properties of the amniotic membrane SC, the purpose of this research was to characterize the SC from the canine amniotic membrane (CAM) in different gestational stages and determine its immunomodulatory potential in vitro. To do so, we studied 20 canine fetuses with no established race in the first third of gestational stage (20-30 days) (n-7), second third (31-45 days) (n=7) and final third (46-63 days) (n=6), from local castration programs. CAM cells were characterized through cellular viability tests, growth curve, colony-forming unit (CFU), in vitro differentiation and cellular immunophenotyping. To assess the immunomodulatory aspects the cells were submitted to RT-qPCR to determine genic expressions from IDO, HGF, EGF, PGE2, IL-6 and IL-10. As a result, CAM cells presented fibroblastoid morphology, adherence to plastic and cell viability of 83,3% in the first third, 80,1% in the second third and 75,22% in the final third of the gestational stage. In the growth curve analysis, the cells presented a higher growth in the second passage, with subsequent drop and stationary tendency. In the CFU we obtained an average of 145 colonies in the first third, 142,3 in the second third and 127,3 colonies in the final third of the gestational stage. In in vitro differentiation the cells differentiated in adipogenic, osteogenic and chondrogenic strains after 21 days of cellular culture. In cellular immunophenotyping, the cells from the first gestational stage expressed the following markers: CD90 (31,7%), CD105 (5,6%), CD45 (0,4%) and CD34 (0,3%); cells from the second gestational stage expressed CD90 (36,7%), CD 105 (6,3%) CD45 (0,4%) and CD34 (0,2%) and lastly cells from the final gestational stage expressed CD105 (96,4%), CD90 (67,1%), CD34 (4,4%) and CD45 (2,0%). In the immunomodulator evaluation we observed qualitative expression of genes IDO, HGF, EGF, PGE2 and no expression of genes IL-6 and IL-10. In the quantitative expression, we only found IDO gene expressed, with higher expression in the second and final thirds. In this context we can conclude that MAC cells from different gestational stages present characteristics consistent with mesenchymal SC and that the final gestational stage presented better results. We also concluded that gestational age is a key factor that can influence the functional and immunomodulatory properties of cells in cell therapy.

As amostras foram obtidas de éguas adultas, totalizando 42 animais, sendo 30 destinados à descrição e caracterização da placenta e anexos embrionários/fetais. Os outros 12 animais foram destinados ao cultivo celular das membranas vitelinas e amnióticas. Os embriões foram mensurados obtendo Crow-Rump e fixados para descrição morfológica. Os fragmentos vitelínicos e amnióticos foram cultivados em meio α-MEM, suplementado com 20% de soro fetal bovino, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de glutamina e 1% de antibiótico, incubados a 37º C e 5% de CO2. Quanto ao material obtido, o córion é a membrana mais externa ao embrião, morfologicamente constituído por epitélio colunar e mesênquima ricamente vascularizado e rico em fibras colágenas. O alantóide é bem desenvolvido e vascularizado, constituído por epitélio simples pavimentoso e por microvilosidades. O âmnio é uma membrana avascular e delgada constituída por uma única camada de células pavimentosas, membrana basal e mesênquima. O saco vitelino exibe um aspecto amarelado com vasos na superfície, constituído por duas camadas celulares entremeadas por mesênquima vascularizado. A cinta coriônica aparece como um halo ao redor do concepto no ponto onde as membranas do alantóide e saco vitelino se encontram. Em relação aos embriões em geral, notamos a presença do prosencéfalo em formação, arcos branquiais, vesícula óptica pigmentada, neuróporo cranial aberto expondo o chamado 4º ventrículo encefálico, e uma flexura cervical acentuada. Notamos a impressão cardíaca; os membros torácicos e pélvicos apresentam formato de "remo". Nos fetos em geral observamos as cavidades orais e nasais delimitadas externamente; o crescimento do pavilhão auricular e início do crescimento da orelha externa; formação do aparelho ungueal nos membros torácicos e pélvicos. As costelas tornam-se mais proeminentes e algumas estruturas já apresentam ossificações Morfologicamente às células vitelinas e amnióticas exibem morfologia fibroblastóide e epitelióide. As células progenitoras isoladas do saco vitelino e do âmnio, na quinta passagem, demonstraram cariótipo normal (2n=64). A população de células do saco vitelino apresentou um crescimento progressivo, não constante até a quinta passagem, e em P10 um declínio acentuado. Para a membrana amniótica, a população celular apresentou um crescimento constante, não linear, até a oitava passagem, e em P10 um declínio acentuado. À imunocitoquímica, as células do saco vitelino e da membrana amniótica, apresentaram-se imunopositivas para: Oct-4, Nanog, SSEA-3, vimentina, citoqueratina 18 (ck18) e PCNA. Tanto as células do saco vitelino como as da membrana amniótica expressaram os seguintes marcadores: CD 45, CD 105, Oct3/4, Nanog, CD 34 e Stro-1. As duas linhagens celulares demonstraram capacidade de diferenciação em adipócitos, osteócitos e condrócitos e não apresentaram potencial carcinogênico em camundongos NUDE. / The samples were obtained from adult mares, totalizing 42 animals, being 30 for the description and characterization of the placenta and embryonic annexes / fetus. The other 12 animals were used for the cell culture of amniotic membranes and yolk sac. The embryos were measured obtaining Crow-Rump and fixed for morphological description. The vitelline and amniotic fragments were cultured in α-MEM, supplemented with 20% fetal bovine serum, 1% nonessential amino acids, 1% glutamine and 1% antibiotic, incubated at 37 º C and 5% CO2. As for the material obtained, the chorion is the outer embryo membrane, consisting of morphologically columnar epithelium and mesenchyme richly vascularized and rich in collagen fibers. The allantois is well vascularized and developed, consisting of a simple squamous epithelium and with the presence of microvilli. The amnion is an avascular membrane consisting of a single thin layer of squamous cells, basal membrane and mesenchyme. The yolk sac exhibits a yellowish appearance with surface vessels, consisting of two cell layers interspersed with a vascularized mesenchyme. The chorionic girdle appears as a halo around the fetus at the point where the allantoid membranes and the yolk sack meet. Regarding embryos in general, the presence of the forebrain in formation, branchial arches, pigmented optic vesicle, open cranial neuropore exposing the so called 4th encephalic ventricle, and pronounced cervical flexure were noticed. The cardiac impression was observed and the fore and hindlimbs had a \"paddle\" shape. Fetuses in general had the nasal and oral cavities externally defined; presented the growth of the auricular pavilion and early growth of the external ear; and formation of the nail apparatus in fore and hindlimbs. The ribs become more prominent and some structures already presented ossification. Morphologically the yolk and amniotic cells was presented as fibroblastoid and epithelioid. The progenitor cells isolated from the yolk sac and the amnion, in the fifth passage, showed normal karyotype (2n = 64). The cells population in the yolk sac showed a progressive growth, not constant until the fifth passage, and a marked decline in P10. For the amniotic membrane, the cell population showed a constant growth, not linear, until the eighth passage, and a marked decline in P10. In immunocytochemistry, the yolk sac cells and amniotic membranes presented themselves as immunopositive for: Oct-4, Nanog, SSEA-3, vimentin, cytokeratin 18 (CK18) and PCNA. Either the yolk sack as the aminiotic membranes expressed the markers CD 45, CD 105, Oct3 / 4, Nanog, CD 34 and Stro-1. Both cell lines demonstrated the capacity to differentiate into adipocytes, osteocytes and chondrocytes and had no carcinogenic potential in NUDE mice.

A doença renal crônica (DRC) é uma afecção frequente em cães idosos, de alta morbidade e mortalidade, sendo definida como uma injúria renal morfo-funcional irreversível, de um ou ambos os rins, que está intrinsecamente associada à degeneração celular. Seu tratamento é paliativo, sendo que nos estágios mais avançados, o animal pode necessitar de hemodiálise ou transplante renal, prática dificultada e muitas vezes inviável na medicina veterinária. As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido amniótico caracterizam-se por ser uma população de células de alta plasticidade e de grande potencial imunomodulador, sendo capazes de se diferenciar e produzir diferentes tipos celulares necessários num processo de reparação. Os avanços nos estudos das células-tronco podem tornar a terapia celular uma forma viável de tratamento alternativo ou adjuvante dessa doença, uma vez que estas poderiam restaurar a funcionalidade e manter a integridade do rim. O objetivo deste estudo foi avaliar se o tratamento experimental com células-tronco mesenquimais derivadas do âmnio (CTMAs) canino podem reduzir ou estabilizar a taxa de progressão e o quadro clínico da DRC em cães. Para tanto, células-tronco provenientes da membrana amniótica foram cultivadas até a segunda passagem (P2) e criopreservadas para posterior aplicação. Onze cães domésticos, machos e/ou fêmeas, acometidos pela DRC adquirida em graus II ou III segundo classificação da IRIS e sem outra afecção adjacente receberam duas aplicações de CTMAs nos dias D0 e D30, por via endovenosa. Para avaliar a progressão ou estabilização do quadro clínico foram colhidas amostras de sangue total, soro sanguíneo e urina para exames de hemograma, bioquímica sérica e urinaria e urinálise em quatro momentos: D0, D7, D30 e D60. A análise estatística foi realizada através da aplicação do teste ANOVA, para comparação de médias nas diferentes fases de tratamento, seguida pelo teste de Tukey, para comparação das médias entre os grupos. Do ponto de vista clínico, dois animais apresentaram melhora e se mantiveram estáveis durante todo o período de acompanhamento, dois animais apresentaram melhora nos primeiros 30 dias, apresentando novamente sintomatologia da doença após esse período e os demais apresentaram melhora nos primeiros sete dias de tratamento, havendo uma piora geral do quadro após esse período. Contudo, os exames laboratoriais em todos os casos não revelaram uma melhora significativa com o tratamento. Aparentemente, a utilização de células-tronco de origem amniótica não influencia de forma relevante na melhora da doença devido à extensa lesão renal que cães apresentam. / Chronic kidney disease (CKD) is a common condition in older dogs with high morbidity and mortality and is defined as an irreversible morpho-functional renal injury of one or both kidneys, which is intrinsically associated with cell degeneration. Its treatment is palliative, and in the more advanced stages, the animal may need dialysis or kidney transplantation, a practice that is difficult and often not feasible in veterinary medicine. The mesenchymal stem cells derived from amniotic tissue characterized by being a population of high plasticity and high cell immunomodulatory potential, being able to differentiate and produce different cell types required in a repair process. Advances in stem cell studies may make cell therapy a viable alternative or adjunctive treatment for this disease, since it could restore functionality and maintain kidney integrity. The objective of this study was to evaluate if the experimental treatment with the canine amnio- derived mesenchymal stem cells (AMSCs) can reduce or stabilize the rate of progression, and clinical condition of CKD in dogs. For this purpose, stem cells from the amniotic membrane were grown until the second pass (P2) and cryopreserved for later use. Eleven domestic male and / or female dogs, affected by the CKD acquired in grades II or III according to IRIS classification and without another adjacent disease, received two applications on days D0 and D30 intravenously. To evaluate the progression or stabilization of the clinical condition, whole blood, blood serum and urine samples were collected for hemogram, serum and urinary biochemistry and urinalysis at four moments: D0, D7, D30 and D60. Statistical analysis was performed using the ANOVA test, to compare means in the different treatment phases, followed by the Tukey test, to compare the means between the groups. From a clinical point of view, two animals showed improvement and remained stable throughout the follow-up period, two animals showed improvement in the first 30 days, showing again symptoms of the disease after this period and the other showed improvement in the first seven days of treatment, with a general worsening of the condition after this period. However, laboratory tests in all cases showed no significant improvement with treatment. Apparently, the use of stem cells of amniotic origin does not influence in a relevant way the improvement of the pathology due the extensive kidney lesion presented by dogs.

A membrana amniótica é uma das membranas fetais presentes no período gestacional e que é considerada uma ferramenta potencial no tratamento de diversas patologias, como na cicatrização de feridas de pele e córnea, hérnias, cirurgias reconstrutivas e prevenção de aderências. As células-tronco (CT) obtidas de membrana amniótica apresentam alta taxa de proliferação e plasticidade, além de propriedades imunomoduladoras que participam no processo de tolerância materno-fetal. Devido à dificuldade e a escassez de estudos envolvendo a membrana amniótica humana em diferentes estágios gestacionais, optamos pela escolha do modelo canino, pois pode ser considerado um modelo ideal devido às semelhanças genéticas e fisiológicas com humanos. Baseado no potencial das CT de membrana amniótica, os objetivos deste trabalho foram caracterizar as CT de membrana amniótica canina (MAC) em diferentes estágios gestacionais e avaliar a expressão de genes relacionados à imunomodulação. Para tanto, foram utilizados 20 fetos caninos, sem raça definida com três idades gestacionais, terço inicial (20-30 dias) (n=7), terço médio (31-45 dias) (n=7) e terço-final (46-63 dias) (n=6), oriundos de programas de castrações. As células das MAC foram caracterizadas por meio de testes de viabilidade celular, curva de crescimento, unidade formadora de colônia (UFC-F), diferenciação in vitro, imunofenotipagem celular e potencial pluripotente. Para avaliação dos aspectos imunomoduladores, as células foram submetidas a RT-qPCR, com intuito de determinar a expressão gênica de IDO, HGF, EGF, PGE2, IL-6 e IL10. Como resultados, as células de MAC apresentaram morfologia fibroblastóide e aderência ao plástico com viabilidade celular de 83,3% em terço inicial, 80,1% em terço médio e 75,22% em terço final. Na análise da curva de crescimento, as células apresentaram pico de crescimento em segunda passagem, com posterior queda e uma tendência estacionária. Na UFC-F, obtivemos uma média de 145 colônias em terço inicial, 142,3 colônias em terço médio e 127,3 colônias em terço final. Na diferenciação in vitro, as células se diferenciaram em linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas após 21 dias de cultivo celular. Na imunofenotipagem celular, as células de terço inicial obtiveram marcação de CD90 (31,7%), CD105 (5,6%), CD34 (0,3%) e CD45 (0,4%), terço médio de CD90 (36,7%), CD105 (6,3%), CD34 (0,2%0 e CD45 (0,4%), terço final CD90 (67,1%), CD105 (96,4%), CD34 (4,4%) e CD45 (2,0). Na avaliação imunomoduladora, observamos a expressão qualitativa dos genes IDO, HGF, EGF, PGE2 e a não expressão dos genes IL-6 e IL-10. Na expressão quantitativa, houve somente a expressão do gene IDO, com maior expressão em terço médio e final. Neste contexto, concluímos que as células de MAC de diferentes estágios gestacionais apresentam características compatíveis com CT mesenquimais e que a idade gestacional de terço final apresentou melhores resultados. / The amniotic membrane is one of the fetal membranes present during gestation and it is considered a potential tool to treat many pathologies. Stem cells (SC) from the amniotic membrane present a high proliferation and plasticity ratio, in addition to immunomodulatory properties that participate in the mother-fetus tolerance process. Due to high difficulty and lack of research involving human amniotic membrane at different gestational stages we chose to use a canine model, as it can be considered an ideal model due to genetic and physiological similarities to humans. Based on the potential properties of the amniotic membrane SC, the purpose of this research was to characterize the SC from the canine amniotic membrane (CAM) in different gestational stages and determine its immunomodulatory potential in vitro. To do so, we studied 20 canine fetuses with no established race in the first third of gestational stage (20-30 days) (n-7), second third (31-45 days) (n=7) and final third (46-63 days) (n=6), from local castration programs. CAM cells were characterized through cellular viability tests, growth curve, colony-forming unit (CFU), in vitro differentiation and cellular immunophenotyping. To assess the immunomodulatory aspects the cells were submitted to RT-qPCR to determine genic expressions from IDO, HGF, EGF, PGE2, IL-6 and IL-10. As a result, CAM cells presented fibroblastoid morphology, adherence to plastic and cell viability of 83,3% in the first third, 80,1% in the second third and 75,22% in the final third of the gestational stage. In the growth curve analysis, the cells presented a higher growth in the second passage, with subsequent drop and stationary tendency. In the CFU we obtained an average of 145 colonies in the first third, 142,3 in the second third and 127,3 colonies in the final third of the gestational stage. In in vitro differentiation the cells differentiated in adipogenic, osteogenic and chondrogenic strains after 21 days of cellular culture. In cellular immunophenotyping, the cells from the first gestational stage expressed the following markers: CD90 (31,7%), CD105 (5,6%), CD45 (0,4%) and CD34 (0,3%); cells from the second gestational stage expressed CD90 (36,7%), CD 105 (6,3%) CD45 (0,4%) and CD34 (0,2%) and lastly cells from the final gestational stage expressed CD105 (96,4%), CD90 (67,1%), CD34 (4,4%) and CD45 (2,0%). In the immunomodulator evaluation we observed qualitative expression of genes IDO, HGF, EGF, PGE2 and no expression of genes IL-6 and IL-10. In the quantitative expression, we only found IDO gene expressed, with higher expression in the second and final thirds. In this context we can conclude that MAC cells from different gestational stages present characteristics consistent with mesenchymal SC and that the final gestational stage presented better results. We also concluded that gestational age is a key factor that can influence the functional and immunomodulatory properties of cells in cell therapy.

As doenças de disco intervertebrais (DDIV) representam a maior parte de atendimentos neurológicos e são responsáveis pela maioria dos casos de paralisia em cães. Os tratamentos utilizados atualmente não demonstram resultados satisfatórios em pacientes com manifestações neurológicas mais graves. A fim de promover recuperação nervosa e motora, além de melhora na qualidade de vida, o presente trabalho objetivou criar um protocolo, através de um ensaio duplo cego, associando cirurgia descompressiva e transplante alogênico de células-tronco (CT) derivadas da membrana amniótica em cães com DDIV crônica. As mesmas células já foram caracterizadas anteriormente como mesenquimais fetais e apresentaram-se seguras para aplicação. Foram selecionados oito cães, onde quatro já passaram por cirurgia e receberam três aplicações epidurais de células-tronco. Os outros quatro animais foram submetidos à cirurgia descompressiva e divididos aleatoriamente (teste duplo cego) em dois grupos: \"cirurgia + placebo\", o qual recebeu apenas solução fisiológica; e \"cirurgia + CT\", que recebeu a terapia celular. Durante o procedimento cirúrgico, foi realizado a aplicação por gotejamento sobre a lesão, e após quinze e quarenta e cinco dias foram realizadas outras duas aplicações, via epidural. Os animais passaram por acompanhamento quinzenal e foram reavaliados três meses após o procedimento cirúrgico, através de exames funcionais e ressonância magnética. Alguns animais apresentaram melhora neurológica significativa, como a recuperação da nocicepção e capacidade de se manter em estação. Apesar da necessidade de mais estudos, até o presente momento, a terapia celular apresentou-se factível e sem efeitos prejudiciais aos animais. / Intervertebral disc (IVD) diseases represent the majority of neurological attendance and are responsible for the most cases of paralysis in dogs. Treatments currently used do not show satisfactory results in patients with more severe neurological manifestations. In order to promote nerve and motor recovery, as well as improve quality of life, the present study aims to create a protocol, using double-blind test method, associating spinal decompression surgery and allogeneic transplantation of amniotic membrane-derived stem cells (AMSCs) in dogs with chronic IVD diseases. Those were previously characterized as fetal mesenchymal cells and were safe for application. Eight dogs were selected, where four have already gone through surgery and received 3 epidural applications of stem cells. The other four animals were submitted to spinal decompression surgery and randomly divided into two groups (double blind test): \"surgery + placebo\", which received only physiological solution; and \"surgery + AMSCs\", which receive cell therapy. During the surgical procedure, a drip application was performed on the lesion and after fifteen and forty five days another two applications were made via epidural. Animals were monitored biweekly and were reassessed three months after surgery, by functional tests and magnetic resonance exams. Some animals presented significant neurological improvement, such as the recovery of nociception and ability to remain on station. Despites the need further studies, until the present moment, cell therapy has been feasible and has no harmful effects on animals.

<p>Amniocentesis (AC) and chorionic villus sampling (CVS) are the principal methods for fetal karyotyping. The aim of this thesis was to evaluate psychological reactions and risks associated with the procedures.</p><p>A semi-randomised study was made on 321 women, where AC (147) and CVS (174) at 10-13 weeks’ gestation were done trans-abdominally. Spontaneous fetal loss occurred in 6.8% and 1.7% of the women in the AC and CVS groups, respectively. Repeat testing was required more often in the AC (19.0%) than in the CVS (5.2%) group.</p><p>A subgroup of 94 women answered a questionnaire prior to the procedure. Anxiety was stated as reason for invasive testing in 38% of the women. Mean scores according to the Hospital Anxiety and Depression Scale for anxiety and depression were low. Likewise, mean scores for the Impact of Event Scale, evaluating the psychological distress evoked by the procedure, were low. Yet, a number of women had higher scores, indicating a risk of clinical anxiety and depression or psychological distress. The women worried most about miscarriage, fetal injury by the procedure and waiting for the result.</p><p>Fetal, infant and maternal outcomes were evaluated in a cohort of 71 586 women aged 35 to 49 years old, with single births in Sweden during 1991 to 1996. Altogether, 21 748 were exposed to AC and 1984 to CVS. Women exposed to AC and CVS were compared with non-exposed. Outcomes were extracted from the Swedish Medical Birth Register, the Swedish Hospital Discharge Register, and the Swedish Malformation Register. An increased risk of musculo-skeletal deformities, such as club foot (OR=1.45) and hip dislocation (OR=1.22), and respiratory disturbances such as neonatal pneumonia (OR=1.29), was found for infants born in the AC group. Risk increased with earlier gestation at the procedure. Fewer women in the AC group had a normal delivery and more had a Caesarean section. Complications related to the amniotic cavity and membranes (OR=1.15), hypotonic uterine dysfunction (OR=1.12) and instrumental vaginal deliveries (OR=1.11) were more common in the AC group. No significant differences were found for the CVS group.</p><p>CVS is the method of choice for prenatal karyotyping in the first trimester. AC should not be performed before 15 weeks’ gestation. Further research to develop methods to better identify women at increased risk of chromosomal abnormal pregnancies and to develop non-invasive tests for prenatal diagnosis is needed. Thereby, the number of women exposed to invasive procedures and the adverse effects caused by these procedures can be minimised.</p>

Amniocentesis (AC) and chorionic villus sampling (CVS) are the principal methods for fetal karyotyping. The aim of this thesis was to evaluate psychological reactions and risks associated with the procedures. A semi-randomised study was made on 321 women, where AC (147) and CVS (174) at 10-13 weeks’ gestation were done trans-abdominally. Spontaneous fetal loss occurred in 6.8% and 1.7% of the women in the AC and CVS groups, respectively. Repeat testing was required more often in the AC (19.0%) than in the CVS (5.2%) group. A subgroup of 94 women answered a questionnaire prior to the procedure. Anxiety was stated as reason for invasive testing in 38% of the women. Mean scores according to the Hospital Anxiety and Depression Scale for anxiety and depression were low. Likewise, mean scores for the Impact of Event Scale, evaluating the psychological distress evoked by the procedure, were low. Yet, a number of women had higher scores, indicating a risk of clinical anxiety and depression or psychological distress. The women worried most about miscarriage, fetal injury by the procedure and waiting for the result. Fetal, infant and maternal outcomes were evaluated in a cohort of 71 586 women aged 35 to 49 years old, with single births in Sweden during 1991 to 1996. Altogether, 21 748 were exposed to AC and 1984 to CVS. Women exposed to AC and CVS were compared with non-exposed. Outcomes were extracted from the Swedish Medical Birth Register, the Swedish Hospital Discharge Register, and the Swedish Malformation Register. An increased risk of musculo-skeletal deformities, such as club foot (OR=1.45) and hip dislocation (OR=1.22), and respiratory disturbances such as neonatal pneumonia (OR=1.29), was found for infants born in the AC group. Risk increased with earlier gestation at the procedure. Fewer women in the AC group had a normal delivery and more had a Caesarean section. Complications related to the amniotic cavity and membranes (OR=1.15), hypotonic uterine dysfunction (OR=1.12) and instrumental vaginal deliveries (OR=1.11) were more common in the AC group. No significant differences were found for the CVS group. CVS is the method of choice for prenatal karyotyping in the first trimester. AC should not be performed before 15 weeks’ gestation. Further research to develop methods to better identify women at increased risk of chromosomal abnormal pregnancies and to develop non-invasive tests for prenatal diagnosis is needed. Thereby, the number of women exposed to invasive procedures and the adverse effects caused by these procedures can be minimised.