A planta daninha Amaranthus palmeri é nativa dos Estados Unidos, porém foi pela primeira vez relatada no Brasil no ano de 2015. Embora comprovadamente com resistência múltipla aos herbicidas inibidores da ALS e da EPSPS, até o momento não foram investigadas as bases moleculares da resistência. Além disso, por causa da recente introdução da planta daninha no país, alternativas de manejo com culturas tolerantes a herbicidas necessitam ser estudadas. Sendo assim, os objetivos desse trabalho são de caracterizar a espécie de planta daninha introduzida no país, identificar os mecanismos de resistência aos herbicidas inibidores da ALS e da EPSPS presentes no biótipo, e propor abordagens de manejo em ambientes dos novos eventos transgênicos resistentes a herbicidas. Um bioensaio utilizando marcadores genéticos foi desenvolvido para confirmar que a população coletada no estado do Mato Grosso (BR-R) é A. palmeri, e não A. tuberculatus, outra espécie dióica do gênero Amaranthus. Os resultados de experimentos de curvas de dose-resposta e acúmulo de chiquimato indicaram que a BR-R possui alto nível de resistência, com DL50 de 4.426 e 3.400 g glyphosate ha-1 no primeiro e segundo experimento, respectivamente, mais que o dobro da dose típicamente recomendada para o controle da espécie e, adicionalmente, observou se acúmulo mínimo de chiquimato a concentração de 1 mM nos tecidos das plantas tratadas com o herbicida. BR-R também foi resistente a herbicidas dos grupos químicos das sulfoniluréias e imidazolinonas. O mecanismo de resistência ao glyphosate encontrado nesta população foi a super expressão gência, através do aumento no número de cópias do gene da EPSPS no genoma da planta BR-R, entre 50 e 179 cópias adicionais. Além disso, duas substituições de aminoácidos foram observadas na sequência da ALS, W574L e S653N, conferindo resistência tanto a sulfoniluréias quanto a imidazolinonas. No experimento utilizandos os herbicidas correspondentes às culturas geneticamente modificadas com novos traits de tolerância a herbicidas observou se, de uma forma geral, que as associações de herbicidas apresentaram níveis de controle mais satisfatórios. Assim, esta pesquisa confirma a introdução de da espécie A. palmeri no Brasil, assim como a resistência múltipla aos herbicidas inibidores da EPSPS e da ALS. Seu manejo é mais eficaz através da associação de herbicidas, garantindo assim o uso racional das novas tecnologias de culturas geneticamente modificadas com tolerância a herbicidas. / Palmer Amaranth (Amaranthus palmeri) is a weed species native to the United States, but it was reported in Brazil for the first time in 2015. Despite this population being resistant to EPSPS and ALS inhibitors, the molecular basis of its multiple resistance is unknown up to date. Because of this species introduction to Brazil, alternatives of management with the new herbicide-tolerant crops technologies need to be studied. The objectives of this research are to characterize the weed species introduced to Brazil, identify the mechanisms conferring resistance to ALS and EPSPS inhibitors herbicides, and to propose management approaches in environments with the new genetically modified herbicide-tolerant crops. A genotyping bioassay using genetic markers was developed to confirm that the species collected in the state of Mato Grosso (BR-R) is indeed A. palmeri and not A. tuberculatus, another dioceous species in the Amaranthus genus. Dose-response experiments and shikimate accumulation bioassay data indicate high level of resistance, with LD50 of 4,426 and 3,400 g glyphosate ha-1 in the first and second experiments, respectively, higher than the double rate tipically recommended to control it, and minimal accumulation in BR-R with 1 mM of glyphosate in treated plants in the leaf disks assay. BR-R also was resistanto to sulfonilurea and imidazolinone herbicides. The mechanism conferring resistance to glyphosate identified in this population was gene amplification, with increased EPSPS copy number - between 50 and 179 more copies in BR-R. Besides, two target-site mutations were identified in the ALS gene sequencing, W574L and S653N, conferring resistance to sulfonilureas and imidazolinones. The weed control experiment, overal, herbicide tank mixtures achieved higher levels of control. Therefore, this research confirms the introduction of A. palmeri to Brazil, as well as its multiple resistance to EPSPS and ALS inhibitor herbicides. Its control is more efficient with herbicide mixtures, which guarantees more susteinable use of the new herbicide-tolerant crop technologies.

A amplificação gênica pode ser compreendida como um mecanismo de regulação de expressão protéica em Leishmania. A exposição a concentrações não letais de diferentes drogas isoladamente, como o metotrexato, a primaquina, cloroquina e antimônio levam à amplificação de regiões específicas como as localizadas no cromossomo 6 e no cromossomo 23. Essas linhagens tornam-se resistentes a estas drogas e eventualmente apresentam resistência cruzada a outras. A terbinafina é uma substância sintética utilizada como antifúngico que age pela inibição da esqualeno epoxidase impedindo a síntese de ergosterol, componente da membrana celular de Leishmania. A exposição do parasita à terbinafina leva à amplificação da região H. A fragmentação da região H permitiu delimitar a resistência a 2,8 kb; fragmento T1. Por mutagênese insercional o gene de resistência à terbinafina foi definido e nomeado HTBF. A proteína codificada pelo HTBF possui uma extremidade N-terminal hidrofílica e C-terminal hidrofóbica com quatro alfa-hélices sendo, supostamente, uma proteína integral de membrana. Possui semelhança com a proteína Yip de Saccharomyces cerevisiae, que participa do transporte vesicular do retículo endoplasmático para o complexo de Golgi. O gene HTBF foi detectado em linhagem sensível de L. major e de outras espécies de Leishmania e seu transcrito em linhagens sensíveis e resistentes de L. major. Levantou-se a hipótese de se tratar de locus de resistência a múltiplas drogas já que as regiões amplificadas, mesmo que induzidas por uma determinada droga, podem levar a resistência a outras. A co-transfecção do gene de resistência ao antimonial MRPA no transfectante portador do HTBF levou à diminuição em até cinco vezes da capacidade de resistência ao antimônio. Apesar dos genes de resistência amplificarem juntos na região H, foi constatado que possuem ação contrária. Sendo que a terbinafina interfere na integridade da membrana celular, levantou-se hipótese na qual a resistência envolveria o mecanismo de reparo de membrana. A perda do fenótipo de resistência pela falta de cálcio sugerindo a inativação desse mecanismo é um fenômeno previsto corroborando a hipótese. / Gene amplification can be recognized as a protein regulation mechanism in Leishmania. Exposure to non-lethal concentrations of different drugs in isolated manner, such as, methotrexate, primaquine, chloroquine and antimony drives the amplification of specific regions. Examples for amplified regions are contained in chromosomes six and 23. The strains become resistant to these drugs and eventu-ally to other drugs as well. Terbinafine is a synthetic substance used as an antifungal agent. Its mechanism of action is by squalene epoxidase inhibition, blocking ergosterol synthesis, a cell membrane component in Leishmania. Parasite exposure to terbinafine elicits H region amplification. H region fragmentation allowed resistance delimitation to 2.8kb, T1 fragment. By insertional mutagenesis terbinafine resistance gene was defined and termed HTBF. HTBF coded protein has a hydrophilic N-terminal and a hydrophobic C-terminal containing four alpha-helixes, putatively, an integral membrane protein. It possesses homology to Saccharomyces cerevisiae Yip protein, which takes part in the vesicular transport from the endoplasmic reticulum to Golgi apparatus. HTBF gene was detected in sensitive L. major strains and other Leishmania species and its transcript was detected in both resistant and sensitive L. major strains. We raised the hypothesis of a multiple drug resistance locus, since amplified regions induced by one drug could elicit resistance to a second drug. Co-transfection of MRPA to the HTBF transfectant led to a five-fold decrease to antimonial resistance level. Even though these resistance genes amplify together in the H region, they have antagonizing mechanisms of action. Since terbinafine action disrupts membrane integrity, we raised a hypothesis in which resistance involves enhancement of membrane repair machinery. Loss of phenotype caused by the lack of calcium suggests the inactivation of this machinery is a predicted phenomenon, corroborating the hypothesis.

A planta daninha Amaranthus palmeri é nativa dos Estados Unidos, porém foi pela primeira vez relatada no Brasil no ano de 2015. Embora comprovadamente com resistência múltipla aos herbicidas inibidores da ALS e da EPSPS, até o momento não foram investigadas as bases moleculares da resistência. Além disso, por causa da recente introdução da planta daninha no país, alternativas de manejo com culturas tolerantes a herbicidas necessitam ser estudadas. Sendo assim, os objetivos desse trabalho são de caracterizar a espécie de planta daninha introduzida no país, identificar os mecanismos de resistência aos herbicidas inibidores da ALS e da EPSPS presentes no biótipo, e propor abordagens de manejo em ambientes dos novos eventos transgênicos resistentes a herbicidas. Um bioensaio utilizando marcadores genéticos foi desenvolvido para confirmar que a população coletada no estado do Mato Grosso (BR-R) é A. palmeri, e não A. tuberculatus, outra espécie dióica do gênero Amaranthus. Os resultados de experimentos de curvas de dose-resposta e acúmulo de chiquimato indicaram que a BR-R possui alto nível de resistência, com DL50 de 4.426 e 3.400 g glyphosate ha-1 no primeiro e segundo experimento, respectivamente, mais que o dobro da dose típicamente recomendada para o controle da espécie e, adicionalmente, observou se acúmulo mínimo de chiquimato a concentração de 1 mM nos tecidos das plantas tratadas com o herbicida. BR-R também foi resistente a herbicidas dos grupos químicos das sulfoniluréias e imidazolinonas. O mecanismo de resistência ao glyphosate encontrado nesta população foi a super expressão gência, através do aumento no número de cópias do gene da EPSPS no genoma da planta BR-R, entre 50 e 179 cópias adicionais. Além disso, duas substituições de aminoácidos foram observadas na sequência da ALS, W574L e S653N, conferindo resistência tanto a sulfoniluréias quanto a imidazolinonas. No experimento utilizandos os herbicidas correspondentes às culturas geneticamente modificadas com novos traits de tolerância a herbicidas observou se, de uma forma geral, que as associações de herbicidas apresentaram níveis de controle mais satisfatórios. Assim, esta pesquisa confirma a introdução de da espécie A. palmeri no Brasil, assim como a resistência múltipla aos herbicidas inibidores da EPSPS e da ALS. Seu manejo é mais eficaz através da associação de herbicidas, garantindo assim o uso racional das novas tecnologias de culturas geneticamente modificadas com tolerância a herbicidas. / Palmer Amaranth (Amaranthus palmeri) is a weed species native to the United States, but it was reported in Brazil for the first time in 2015. Despite this population being resistant to EPSPS and ALS inhibitors, the molecular basis of its multiple resistance is unknown up to date. Because of this species introduction to Brazil, alternatives of management with the new herbicide-tolerant crops technologies need to be studied. The objectives of this research are to characterize the weed species introduced to Brazil, identify the mechanisms conferring resistance to ALS and EPSPS inhibitors herbicides, and to propose management approaches in environments with the new genetically modified herbicide-tolerant crops. A genotyping bioassay using genetic markers was developed to confirm that the species collected in the state of Mato Grosso (BR-R) is indeed A. palmeri and not A. tuberculatus, another dioceous species in the Amaranthus genus. Dose-response experiments and shikimate accumulation bioassay data indicate high level of resistance, with LD50 of 4,426 and 3,400 g glyphosate ha-1 in the first and second experiments, respectively, higher than the double rate tipically recommended to control it, and minimal accumulation in BR-R with 1 mM of glyphosate in treated plants in the leaf disks assay. BR-R also was resistanto to sulfonilurea and imidazolinone herbicides. The mechanism conferring resistance to glyphosate identified in this population was gene amplification, with increased EPSPS copy number - between 50 and 179 more copies in BR-R. Besides, two target-site mutations were identified in the ALS gene sequencing, W574L and S653N, conferring resistance to sulfonilureas and imidazolinones. The weed control experiment, overal, herbicide tank mixtures achieved higher levels of control. Therefore, this research confirms the introduction of A. palmeri to Brazil, as well as its multiple resistance to EPSPS and ALS inhibitor herbicides. Its control is more efficient with herbicide mixtures, which guarantees more susteinable use of the new herbicide-tolerant crop technologies.

A amplificação gênica pode ser compreendida como um mecanismo de regulação de expressão protéica em Leishmania. A exposição a concentrações não letais de diferentes drogas isoladamente, como o metotrexato, a primaquina, cloroquina e antimônio levam à amplificação de regiões específicas como as localizadas no cromossomo 6 e no cromossomo 23. Essas linhagens tornam-se resistentes a estas drogas e eventualmente apresentam resistência cruzada a outras. A terbinafina é uma substância sintética utilizada como antifúngico que age pela inibição da esqualeno epoxidase impedindo a síntese de ergosterol, componente da membrana celular de Leishmania. A exposição do parasita à terbinafina leva à amplificação da região H. A fragmentação da região H permitiu delimitar a resistência a 2,8 kb; fragmento T1. Por mutagênese insercional o gene de resistência à terbinafina foi definido e nomeado HTBF. A proteína codificada pelo HTBF possui uma extremidade N-terminal hidrofílica e C-terminal hidrofóbica com quatro alfa-hélices sendo, supostamente, uma proteína integral de membrana. Possui semelhança com a proteína Yip de Saccharomyces cerevisiae, que participa do transporte vesicular do retículo endoplasmático para o complexo de Golgi. O gene HTBF foi detectado em linhagem sensível de L. major e de outras espécies de Leishmania e seu transcrito em linhagens sensíveis e resistentes de L. major. Levantou-se a hipótese de se tratar de locus de resistência a múltiplas drogas já que as regiões amplificadas, mesmo que induzidas por uma determinada droga, podem levar a resistência a outras. A co-transfecção do gene de resistência ao antimonial MRPA no transfectante portador do HTBF levou à diminuição em até cinco vezes da capacidade de resistência ao antimônio. Apesar dos genes de resistência amplificarem juntos na região H, foi constatado que possuem ação contrária. Sendo que a terbinafina interfere na integridade da membrana celular, levantou-se hipótese na qual a resistência envolveria o mecanismo de reparo de membrana. A perda do fenótipo de resistência pela falta de cálcio sugerindo a inativação desse mecanismo é um fenômeno previsto corroborando a hipótese. / Gene amplification can be recognized as a protein regulation mechanism in Leishmania. Exposure to non-lethal concentrations of different drugs in isolated manner, such as, methotrexate, primaquine, chloroquine and antimony drives the amplification of specific regions. Examples for amplified regions are contained in chromosomes six and 23. The strains become resistant to these drugs and eventu-ally to other drugs as well. Terbinafine is a synthetic substance used as an antifungal agent. Its mechanism of action is by squalene epoxidase inhibition, blocking ergosterol synthesis, a cell membrane component in Leishmania. Parasite exposure to terbinafine elicits H region amplification. H region fragmentation allowed resistance delimitation to 2.8kb, T1 fragment. By insertional mutagenesis terbinafine resistance gene was defined and termed HTBF. HTBF coded protein has a hydrophilic N-terminal and a hydrophobic C-terminal containing four alpha-helixes, putatively, an integral membrane protein. It possesses homology to Saccharomyces cerevisiae Yip protein, which takes part in the vesicular transport from the endoplasmic reticulum to Golgi apparatus. HTBF gene was detected in sensitive L. major strains and other Leishmania species and its transcript was detected in both resistant and sensitive L. major strains. We raised the hypothesis of a multiple drug resistance locus, since amplified regions induced by one drug could elicit resistance to a second drug. Co-transfection of MRPA to the HTBF transfectant led to a five-fold decrease to antimonial resistance level. Even though these resistance genes amplify together in the H region, they have antagonizing mechanisms of action. Since terbinafine action disrupts membrane integrity, we raised a hypothesis in which resistance involves enhancement of membrane repair machinery. Loss of phenotype caused by the lack of calcium suggests the inactivation of this machinery is a predicted phenomenon, corroborating the hypothesis.

O projeto de obtenção de huAcMos (Anticorpos Monoclonais Humanizados) tinha como escopo a humanização de anticorpos murinos com potencial terapêutico, inserção das sequências em vetores de expressão e transfecção em células CHO (do inglês, Chinese Hamster Ovary). A expressão do huAcMo Anti-CD18 resultou em baixos níveis da proteína recombinante e inciamos o processo de expressão de isoformas do huAcMo Anti-CD3. As células foram transfectadas com seqüências codificadoras do fragmento FvFc Anti-CD3 e clonadas pelo equipamento ClonePix FL. O fragmento foi caracterizado e demonstrou uma menor afinidade quando comparada com a molécula murina original. Ulizamos o sistema de recombinação homóloga (CHO Flp-In, Invitrogen) para expressão da molécula inteira do huAcMo Anti-CD3. Os clones foram caracterizados e demonstrou, assim como o fragmento FvFc, uma menor afinidade pelo alvo. As diferenças nas propriedades de ligação são freqüentemente encontradas após processos de humanização; dependendo da função efetora esta diminuição de afinidade não é negativa para a molécula. / The humanized antibodies (huMab) project intent to use murine antibodies with therapeutic potencial to obtain more human sequences with maintened specificity. The sequences were inserted in expression vectors and transfected in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells. Anti-CD18 huMab expression results in low levels of recombinant protein and lead us to try the expression of Anti-CD3 isoforms. The cells were transfected for the expression of a FvFc antibody fragment and cloned using ClonePix FL equipment. The fragment characterization demonstrate a lower affinity when compared with the murine molecule. We use the homologous recombination system (CHO Flp-In) for the expression of the whole molecule of huMab Anti-CD3; like the FvFc fragment, the whole molecule demonstrate a lower affinity for the target. The differences in the affinity properties are frequently found after humanization process and depending on the expected efector functions is not negatively characterized.

O projeto de obtenção de huAcMos (Anticorpos Monoclonais Humanizados) tinha como escopo a humanização de anticorpos murinos com potencial terapêutico, inserção das sequências em vetores de expressão e transfecção em células CHO (do inglês, Chinese Hamster Ovary). A expressão do huAcMo Anti-CD18 resultou em baixos níveis da proteína recombinante e inciamos o processo de expressão de isoformas do huAcMo Anti-CD3. As células foram transfectadas com seqüências codificadoras do fragmento FvFc Anti-CD3 e clonadas pelo equipamento ClonePix FL. O fragmento foi caracterizado e demonstrou uma menor afinidade quando comparada com a molécula murina original. Ulizamos o sistema de recombinação homóloga (CHO Flp-In, Invitrogen) para expressão da molécula inteira do huAcMo Anti-CD3. Os clones foram caracterizados e demonstrou, assim como o fragmento FvFc, uma menor afinidade pelo alvo. As diferenças nas propriedades de ligação são freqüentemente encontradas após processos de humanização; dependendo da função efetora esta diminuição de afinidade não é negativa para a molécula. / The humanized antibodies (huMab) project intent to use murine antibodies with therapeutic potencial to obtain more human sequences with maintened specificity. The sequences were inserted in expression vectors and transfected in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells. Anti-CD18 huMab expression results in low levels of recombinant protein and lead us to try the expression of Anti-CD3 isoforms. The cells were transfected for the expression of a FvFc antibody fragment and cloned using ClonePix FL equipment. The fragment characterization demonstrate a lower affinity when compared with the murine molecule. We use the homologous recombination system (CHO Flp-In) for the expression of the whole molecule of huMab Anti-CD3; like the FvFc fragment, the whole molecule demonstrate a lower affinity for the target. The differences in the affinity properties are frequently found after humanization process and depending on the expected efector functions is not negatively characterized.

A variação do número de cópias (CNV) de genes e cromossomos é uma característica comum do genoma plástico de Leishmania major, que pode estar associada à resistência do parasita à quimioterapia das leishmanioses. Em outros eucariotos, alterações na replicação do DNA ou na resposta a danos no DNA (DDR) pode levar à CNV. Nestes organismos, o complexo de checkpoint 9-1-1 (RAD9, RAD1 e HUS1) é essencial para a detecção e a sinalização do estresse de replicação e para o recrutamento de uma apropriada DDR. Já demonstramos que L. major expressa um homólogo 9-1-1 funcional. Aqui, avaliamos a deficiência de subunidades de 9-1-1 na variação do número de cópias em células selecionadas em metotrexato (MTX), um inibidor da enzima diidrofolato redutase timidilato sintetase (DHFR-TS). A seleção em MTX facilita o isolamento de células que carregam amplificações contendo o locus da DHFR-TS. Assim, selecionamos células deficientes de HUS1 ou RAD9 para resistência ao MTX sem e com exposição previa a hidroxiureia (HU), uma droga que causa estresse de replicação por inibição da ribonucleotídeo redutase, e avaliamos o efeito da deficiência destas proteínas na CNV e no tipo de amplificação gerada. Avaliamos também o efeito da deficiência destas proteínas no processo de síntese do DNA medido pela incorporação de IdU e observamos que a deficiência destas proteínas levou a um incremento na síntese do DNA na ausência de estresse de replicação e a perfis opostos de síntese do DNA após a remoção do estresse replicativo. Análises da detecção de simples fita do DNA (ssDNA) e da histona H2A fosforilada (?H2A) como indicadores do processo de estresse de replicação e dano no DNA também foram conduzidas. Em conjunto, nossos resultados indicam que (i) os níveis alterados das proteínas HUS1 e RAD9 afetam o padrão da CNV após a seleção no MTX, assim como a natureza da amplificação; (ii) HUS1 e RAD9 parecem possuir mecanismos distintos para mediar a CNV; (iii) a função destas proteínas na CNV deve envolver o processo de replicação e (iv) HUS1 e RAD9 são requeridas para a manutenção da estabilidade genômica em Leishmania. Estes resultados contribuem para uma melhor compreensão não só da evolução da via de sinalização mediada pelo complexo de checkpoint 9-1-1 nos eucariotos, mas também da bases moleculares da plasticidade genômica e do fenômeno de amplificação gênica em Leishmania. / The copy number variation (CNV) of genes and chromosomes is a common feature of the plastic genome of Leishmania major, which is normally associated with resistance of the parasite to the chemotherapy of leishmaniasis. In other eukaryotes, alteration in DNA replication and DNA damage response (DDR) causes CNV. In these organisms, the RAD9-RAD1-HUS1 (9-1-1) checkpoint complex is essential for detection and signaling of replication stress and recruitment of an appropriate DDR. We have already demonstrated that L. major expresses a functional 9-1-1 homolog. Here we evaluated the effect of 9-1-1 subunit deficiency in CNV of cells selected in methotrexate (MTX), an inhibitor of the dihydrofolate reductase thymidylate synthetase (DHFR-TS) enzyme. Selection in MTX facilitates the isolation of cells that carry amplicons containing the DHFR-TS locus. Thus, we selected HUS1 or RAD9 deficient cells for MTX resistance without and prior exposure to hydroxyurea (HU), a drug that causes replication stress due to inhibition of ribonucleotide reductase, and evaluated not only CNV, but also the nature of the amplification generated. We also evaluated the effect of deficiency of these proteins in the DNA synthesis process measured by IdU incorporation and observed that the deficiency of these proteins led to an increase in DNA synthesis in the absence of replication stress, and to opposite profiles of DNA synthesis after removal of replicative stress. Analyzes of single-stranded DNA (ssDNA) and phosphorylated histone H2A (?H2A) as indicators of replication stress and DNA damage were also conducted in both presence and absence of replicative stress. Taken together, our results indicate that (i) altered levels of HUS1 and RAD9 proteins affect the CNV pattern after selection in MTX, as well as the nature of amplification; (ii) HUS1 and RAD9 possibly have different mechanisms to mediate CNV; (iii) the function of these proteins in CNV seems to involve replication process and (iv) HUS1 and RAD9 are required for the maintenance of genomic stability in Leishmania. These findings contribute to a better understanding not only of the evolution of the signaling pathway mediated by 9-1-1 checkpoint complex in eukaryotes, but also of the molecular basis of the genome plasticity and the gene amplification phenomenon in Leishmania.

A variação do número de cópias (CNV) de genes e cromossomos é uma característica comum do genoma plástico de Leishmania major, que pode estar associada à resistência do parasita à quimioterapia das leishmanioses. Em outros eucariotos, alterações na replicação do DNA ou na resposta a danos no DNA (DDR) pode levar à CNV. Nestes organismos, o complexo de checkpoint 9-1-1 (RAD9, RAD1 e HUS1) é essencial para a detecção e a sinalização do estresse de replicação e para o recrutamento de uma apropriada DDR. Já demonstramos que L. major expressa um homólogo 9-1-1 funcional. Aqui, avaliamos a deficiência de subunidades de 9-1-1 na variação do número de cópias em células selecionadas em metotrexato (MTX), um inibidor da enzima diidrofolato redutase timidilato sintetase (DHFR-TS). A seleção em MTX facilita o isolamento de células que carregam amplificações contendo o locus da DHFR-TS. Assim, selecionamos células deficientes de HUS1 ou RAD9 para resistência ao MTX sem e com exposição previa a hidroxiureia (HU), uma droga que causa estresse de replicação por inibição da ribonucleotídeo redutase, e avaliamos o efeito da deficiência destas proteínas na CNV e no tipo de amplificação gerada. Avaliamos também o efeito da deficiência destas proteínas no processo de síntese do DNA medido pela incorporação de IdU e observamos que a deficiência destas proteínas levou a um incremento na síntese do DNA na ausência de estresse de replicação e a perfis opostos de síntese do DNA após a remoção do estresse replicativo. Análises da detecção de simples fita do DNA (ssDNA) e da histona H2A fosforilada (?H2A) como indicadores do processo de estresse de replicação e dano no DNA também foram conduzidas. Em conjunto, nossos resultados indicam que (i) os níveis alterados das proteínas HUS1 e RAD9 afetam o padrão da CNV após a seleção no MTX, assim como a natureza da amplificação; (ii) HUS1 e RAD9 parecem possuir mecanismos distintos para mediar a CNV; (iii) a função destas proteínas na CNV deve envolver o processo de replicação e (iv) HUS1 e RAD9 são requeridas para a manutenção da estabilidade genômica em Leishmania. Estes resultados contribuem para uma melhor compreensão não só da evolução da via de sinalização mediada pelo complexo de checkpoint 9-1-1 nos eucariotos, mas também da bases moleculares da plasticidade genômica e do fenômeno de amplificação gênica em Leishmania. / The copy number variation (CNV) of genes and chromosomes is a common feature of the plastic genome of Leishmania major, which is normally associated with resistance of the parasite to the chemotherapy of leishmaniasis. In other eukaryotes, alteration in DNA replication and DNA damage response (DDR) causes CNV. In these organisms, the RAD9-RAD1-HUS1 (9-1-1) checkpoint complex is essential for detection and signaling of replication stress and recruitment of an appropriate DDR. We have already demonstrated that L. major expresses a functional 9-1-1 homolog. Here we evaluated the effect of 9-1-1 subunit deficiency in CNV of cells selected in methotrexate (MTX), an inhibitor of the dihydrofolate reductase thymidylate synthetase (DHFR-TS) enzyme. Selection in MTX facilitates the isolation of cells that carry amplicons containing the DHFR-TS locus. Thus, we selected HUS1 or RAD9 deficient cells for MTX resistance without and prior exposure to hydroxyurea (HU), a drug that causes replication stress due to inhibition of ribonucleotide reductase, and evaluated not only CNV, but also the nature of the amplification generated. We also evaluated the effect of deficiency of these proteins in the DNA synthesis process measured by IdU incorporation and observed that the deficiency of these proteins led to an increase in DNA synthesis in the absence of replication stress, and to opposite profiles of DNA synthesis after removal of replicative stress. Analyzes of single-stranded DNA (ssDNA) and phosphorylated histone H2A (?H2A) as indicators of replication stress and DNA damage were also conducted in both presence and absence of replicative stress. Taken together, our results indicate that (i) altered levels of HUS1 and RAD9 proteins affect the CNV pattern after selection in MTX, as well as the nature of amplification; (ii) HUS1 and RAD9 possibly have different mechanisms to mediate CNV; (iii) the function of these proteins in CNV seems to involve replication process and (iv) HUS1 and RAD9 are required for the maintenance of genomic stability in Leishmania. These findings contribute to a better understanding not only of the evolution of the signaling pathway mediated by 9-1-1 checkpoint complex in eukaryotes, but also of the molecular basis of the genome plasticity and the gene amplification phenomenon in Leishmania.