Hannover, University, Diss., 2005.

Ulm, Univ., Diss., 2007.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-10-29T14:03:53Z No. of bitstreams: 1 Niara de Jesus Almeida.Avaliação...2014.pdf: 2142198 bytes, checksum: c0f1caa073f88305a34bffb0a94263ff (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-29T14:03:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Niara de Jesus Almeida.Avaliação...2014.pdf: 2142198 bytes, checksum: c0f1caa073f88305a34bffb0a94263ff (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Camundongos CBA são resistentes à infecção por Leishmania major e permissivos à infecção por L. amazonensis. Adicionalmente, macrófagos de camundongos CBA controlam à infecção por L. major, mas não por L. mazonensis in vitro. Em estudo comparativo realizado por nosso grupo foi demonstrado que o receptor scavenger MARCO teve expressão aumentada em resposta à infecção por L. major, mas não na infecção por L. amazonensis. Ainda, o bloqueio do receptor com o anticorpo específico reduziu a infecção por L. major em 30%, indicando que esta proteína tem participação no reconhecimento de promastigotas de L. major em macrófagos de CBA. Assim, nossa hipótese é que o receptor MARCO participa do reconhecimento e fagocitose de L. major por macrófagos, direcionando o curso da infecção. O objetivo do presente estudo consistiu em evidenciar o papel do receptor MARCO na infecção de macrófagos por L. major. Inicialmente, células J774 foram transfectadas com os vetores pcDNA3.1-MARCO (J774-MARCO) ou pcDNA3.1 (J774-MOCK). Foi observado que a expressão do gene do MARCO foi cinco vezes maior nas células J774-MARCO em comparação às células J774-MOCK. Ao avaliarmos o efeito da superexpressão sobre o metabolismo de células J774-MARCO foi observado que a atividade metabólica mitocondrial foi maior nos clones J774-MARCO e J774-MOCK, 14% e 39% respectivamente, em comparação com as células J774 controle não transfectadas. Entretanto, a diferença no metabolismo não alterou a viabilidade celular dos clones transfectados. A superexpressão de MARCO não aumentou a ligação de L. major em células J774, mas favoreceu tanto o aumento no percentual de infecção de L. major como o número de parasitos/célula nos tempos iniciais até 24 h após a infecção (p ≤ 0,05). Adicionalmente, foi investigado se MARCO estaria induzindo modificações na membrana celular que favorecessem a entrada de L. major. Foi demonstrado que as células superexpressando MARCO (67%) apresentaram um maior espraiamento da membrana celular, com a formação de lamelipódios e estruturas semelhantes a filopódios, eventos observados em um número reduzido de células J774-MOCK (24%). Ao avaliarmos o efeito da superexpressão de MARCO na produção de quimiocinas e citocinas durante a infecção por L. major foi observado que a adição de L. major induziu níveis significativamente maiores de MCP-1 e TNF-α nos tempos de 24 e 48 h após a infecção em comparação com as células J774-MOCK (p < 0,01). Níveis maiores de IL-6 foram observados após 48 h de infecção por L. major nas células J774-MARCO em comparação às células controle (p < 0,05). Similarmente, em resposta à infecção por L. major, células J774-MARCO produziram maior quantidade de NO nos tempos de 24 (p < 0,001) e 48 h (p < 0,01) após a infecção. Todavia, a superexpressão de MARCO não teve efeito sobre a sobrevivência intracelular do parasito. Em suma, nossos achados sugerem que a superexpressão do receptor scavenger MARCO favorece a entrada de L. major em células J774, além de desencadear uma resposta imune efetora direcionando o curso da infecção por Leishmania. / CBA mice are resistant to Leishmania major yet permissive to L. amazonensis infection. In addition, CBA macrophages control L. major, but not L. amazonensis infection in vitro. In a comparative study performed by our group increase in expression of the scavenger receptor MARCO has been detected in response to L. major, but not to L. amazonensis infection. Moreover, ED31 monoclonal antibody against MARCO reduced by 30% L. major infection in CBA macrophages. These findings indicate that MARCO plays a role in L. major recognition by CBA macrophages. We hypothesized that MARCO receptor participates in the recognition and phagocytosis of L. major by macrophages, directing the outcome of infection. In the present study, we aimed to further disclose the role MARCO plays in L. major infection of murine macrophages. First J774 cells were transfected with pcDNA3.1-MARCO vector (MARCO-J774) or pcDNA3.1 vector (MOCK-J774). Expression of MARCO gene shown to be five times higher in MARCO-J774 cells compared to MOCK-J774 cells. Overexpression of MARCO enhanced mitochondrial metabolic activity in 14% and 39% of both MARCO-J774 and MOCK-J774, respectively, when compared to the control non-transfected J774 cells. However, enhancement in mitochondrial metabolic activity did not alter the cell viability of transfected clones. MARCO overexpression did not increase the binding of L. major in J774 cells, but increased both the percentage of infection of L. major and the number of parasites / cell until 24 h after infection (p ≤ 0,05). Additionally, we investigated whether MARCO be inducing changes in cell membrane that would favor L. major uptake by macrophages. We observed that MARCO-J774 cells (67%) showed a pronounced spread of cell membranes, with short microvilli and lamellipodia, events observed in a reduced number of MOCK-J774 (24%). Then, we evaluated production of pro-inflammatory chemokine and cytokine induced by L. major in MARCO-J774 cells. L. major addition to MARCO-J774 cells induced higher significantly levels of MCP-1 and TNF-α compared to MOCK-J774 cells at 24 and 48 h post infection (p < 0,01). Higher levels of IL-6 were also observed at 48 h of L. major infection in MARCO-J774 cells compared to control (p < 0,05). Similarly, NO production induced by L. major was much more higher in MARCO-J774 cells compared to MOCK-J774 at 24 and 48 h post infection (p ≤ 0,01). Although in MARCO-overexpressing cells, enhancement in pro-inflammatory chemokines and cytokines in response to L. major has been observed, no effect on parasite intracellular survival has been detected. In summary, our findings suggest that the scavenger receptor MARCO overexpression favors the entry of L. major in J774 cells, and trigger an effector immune response that directs outcome of Leishmania infection.

Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:59:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peres_BarbaraRamalho_M.pdf: 4607988 bytes, checksum: e396f207db591110a7882ea1df2cfbd4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As proteínas Rvb1 e Rvb2 são DNA helicases dependentes de ATP pertencentes à família AAA+ ATPases (ATPases associadas com diversos processos celulares) que estão envolvidas na remodelação da cromatina, montagem da telomerase, mitose e biogênese de snoRNP ("small nucleolar ribonucleoprotein") e interagem com as co-chaperonas Tah1 (contém um domínio TPR associado com Hsp90) e Pih1 formando um complexo funcional, denominado R2TP. Este complexo já foi identificado em levedura e seres humanos, e desempenha um papel essencial na montagem de complexos multi-proteicos com DNA e RNA. Nosso grupo de pesquisa tem por objetivo identificar e caracterizar o complexo R2TP em Leishmania major pela importância deste parasita para medicina. Apresentamos o estudo das proteínas Rvb1 e Rvb2 de L. major. Os genes foram clonados e as proteínas recombinantes foram purificadas e caracterizadas quanto à conformação pelas técnicas de dicroísmo circular, gel filtração analítica e fluorescência intrínseca, mostrando que as proteínas foram purificadas enoveladas. Foram feitos ensaios funcionais de atividade ATPásica mostrando que estas possuem atividade ATPásica a qual é aumentada quando as proteínas foram incubadas com DNA. Espera-se que os resultados deste trabalho possam contribuir para o objetivo de compreensão do sistema R2TP e da regulação da homeostase do genoma de L. major. O conjunto destas pesquisas pode contribuir também para o desenvolvimento de possíveis estratégias para intervir no parasita causador de uma doença negligenciada / Abstract: Rvb1 and Rvb2 proteins are ATP-dependent DNA helicases belonging to the AAA + ATPases family (ATPases associated with diverse cellular processes) that are involved in chromatin remodeling, telomerase assembly, mitosis and snoRNP biogenesis ("small nucleolar ribonucleoprotein") and interact with co-chaperones Tah1 (wich contains a TPR domain associated with Hsp90) and Pih1 into a functional complex, named R2TP. The R2TP complex has been identified in yeast and humans, and has an essential role in the assembly of multi-protein complexes with DNA and RNA. Due to the medical importance of Leishmania major our research group has becoming interested in the identification and characterization of the R2TP complex of this parasite. We studied the Rvb1 and Rvb2 proteins of L. major. The genes were cloned, the recombinant proteins were purified and their conformation were characterized by circular dichroism, analytical gel filtration and intrinsic fluorescence techniques, indicating that the proteins were folded. Functional assays showed that Rvb1 and Rvb2 have ATPase activity and this activity increased when incubated with DNA. Hopefully, the results of this study may contribute to the goal of understanding the R2TP system and homeostasis of the L. major genome and together, may contribute to the development of possible strategies to intervene with a parasite that causes a neglected disease / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6324_1.pdf: 1187846 bytes, checksum: fab93aac3ac6d96c08d4c73f504e7338 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em eucariotos, a iniciação da tradução é um processo essencial de regulação pós-transcricional da expressão gênica. Neste processo, atuam proteínas designadas eIFs (fatores de iniciação da tradução). Destas destaca-se o complexo eIF4F eIF4E, eIF4A e eIF4G que permite associar o mRNA ao ribossomo. Identificamos no genoma de Leishmania major seqüências que apresentam homologia aos componentes do eIF4F. Este trabalho contempla a caracterização de um homólogo do eIF4A (LmeIF4A2) e três homólogos eIF4G (LmeIF4G1-3). O gene LmeIF4A2 foi clonado, expresso e utilizado na produção de anticorpos. Ensaios de Western-blot sugeriram não haver expressão do LmeIF4A2 na fase promastigota de Leishmania major. Em seguida realizamos construções com os LmeIF4G1-3, fusionando-os a GST, permitindo a realização de ensaios de pull down visando investigar sua associação com as proteínas LmeIF4A1-2. O LmeIF4A2 não interage com nenhum dos LmeIF4G1-3 e o LmeIF4A1 interage especificamente com o LmeIF4G3. Em outra etapa produzimos anticorpos contra as proteínas LmeIF4G1-3 para avaliar sua expressão na forma promastigota do parasita. A expressão do LmeIF4G3 foi confirmada, todavia não detectamos a expressão dos LmeIF4G1-2. A interação eIF4G/eIF4E foi investigada em ensaios onde homólogos LmeIF4G1-3 foram incubados a homólogos LmeIF4E1-3, para tentar reconstituir parcialmente o complexo eIF4F in vitro, e testados quanto a sua afinidade pelo cap sintético. Estes resultados se mostraram inconclusivos. A utilização de novas abordagens e a caracterização dos demais fatores será importante na elucidação da tradução nestes protozoários

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo769_1.pdf: 2236218 bytes, checksum: c1045cac8144a4b1e0d6bf9c71ea3643 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As proteínas presentes na saliva dos flebotomíneos possuem uma grande importância na proteção contra parasitas do gênero Leishmania. Uma das proteínas identificadas, denominada de SP15, demonstrou ser responsável pela proteção contra a progressão da doença e aumento do tamanho da lesão em modelos animais. A elaboração de vacinas de múltiplos componentes com proteínas salivares pode ser uma forma viável para o desenvolvimento de vacinas anti-Leishmania. Partindo desta estratégia adotada para elaboração de vacinas, é necessário entender a variabilidade dos genes que codificam proteínas salivares e suas implicações nas respostas imunes dos humanos. Neste trabalho, investigamos a variabilidade genética de SP15 de populações naturais de Phlebotomus papatasi do Oriente Médio. Adicionalmente, associamos a variabilidade genética observada com a predição da estrutura secundária da proteína e possíveis epítopos de ligação a MHC classe II. Os resultados obtidos indicaram um baixo nível de variabilidade genética entre as populações oriundas do Oriente Médio, apesar da ocorrência de um grande número de haplótipos, onde alguns deles são compartilhados entre as populações distintas. Em conjunto, estas observações evidenciam a existência de fluxo gênico ou retenção de polimorfismo ancestral entre as populações e a ausência da seleção purificadora atuando sobre este gene. Para os preditos epítopos de MHC classe II, muitos foram identificados como possuindo sítios de mutação, mas pelo menos três epítopos identificados não apresentaram qualquer tipo de mutação, sugerindo que esta molécula apresenta-se moderadamente conservada e deve induzir respostas imunes uniformes nos humanos

La galectine-3, une protéine cytosolique de l’hôte est impliquée dans la réponse immunitaire contre Leishmania major, un parasite protozoaire causant une infection cutanée. Lors d’une infection avec la souche LV39 de L. major, la galectine-3 se libère dans le milieu extracellulaire et participe au recrutement de neutrophiles au site d’infection. La galectine-3 ne semble cependant pas impliquée lors d’infections avec la souche L. major Friedlin qui possède un arrangement de saccarides différent sur ses phosphoglycans. In vitro, les deux souches de L. major sont en mesure de cliver la galectine-3, mais LV39 semble plus efficace. Différents essais ont été effectués in vivo afin de vérifier si les galectines-7 et 9 peuvent aussi avoir un rôle à jouer lors d’infection avec L. major. Alors qu’aucun effet significatif n’a pu être attribué à la galectine-9, l’absence de galectine-7 semble apporter une guérison plus rapide des lésions engendrées par L. major Friedlin. / Our recent data suggest that galectin-3, a host cytosolic protein is involved in the immune response against the Leishmania major strain LV39, which induces cutaneous infection. Following infection with this parasite, galectin-3 is released in the extracellular space and plays a role in neutrophil recruitment. In contrast, in another L. major strain called Friedlin, which expresses a different glycan structure on the phosphoglycans, galectin-3 has no impact on the host immune response and disease outcome. Our laboratory previously reported that L. major LV39 cleaves galectin-3. Our data suggest that both L. major strains are able to cleave galectin-3 in vivo, although the cleavage by LV39 is more efficient than that by Friedlin. We also addressed the role of galectins-7 and 9 in a murine L. major infection model. Lack of galectin-9 did not alter the pathogenesis of Leishmania infection. In contrast, lack of galectin-7 contributed to improve healing process.

Cutaneous leishmaniasis is endemic in tropical and subtropical regions of the world. Effective vaccination strategies are urgently needed because of the emergence of drug-resistant parasites and severe side effects of chemotherapy. The research group of Heidrun Moll previously established a DC-based vaccination strategy to induce complete and long-lasting immunity to experimental leishmaniasis using LmAg-loaded and CpG ODN-activated DC as a vaccine carrier. Prevention of tissue damages at the site of L. major inoculation can be achieved if the BALB/c mice were systemically given LmAg-loaded BMDC that had been exposed to CpG ODN. The interest in further exploring the role of IL-4 aroused as previous studies allowed establishing that IL-4 was involved in the redirection of the immune response towards a type 1 profile. Thus, wt BALB/c mice or DC-specific CD11ccreIL-4Rα-/lox BALB/c mice were given either wt or IL-4Rα-deficient LmAg-loaded BMDC exposed or not to CpG ODN prior to inoculation of 2 x 105 stationary phase L. major promastigotes into the BALB/c footpad. The results provide evidence that IL4/IL-4Rα-mediated signaling in the vaccinating DC is required to prevent tissue damages at the site of L. major inoculation, as properly conditioned wt DC but not IL-4Rα-deficient DC were able to confer resistance. Furthermore, uncontrolled L. major population size expansion was observed in the footpad and the footpad draining LN in CD11ccreIL-4Rα-/lox mice immunized with CpG ODN-exposed LmAg-loaded IL-4Rα-deficient DC, indicating the influence of IL-4R-mediated signaling in host DC to control parasite replication. In addition, no footpad damage was observed in BALB/c mice that were systemically immunized with LmAg-loaded wt DC doubly exposed to CpG ODN and recombinant IL-4. Discussing these findings allow the assumption that triggering the IL4/IL4Rα signaling pathway could be a precondition when designing vaccines aimed to prevent damaging processes in tissues hosting intracellular microorganisms. / Die kutane Leishmaniose ist vor allem in den tropischen und subtropischen Regionen endemisch. Die Notwendigkeit der Erforschung und Etablierung einer Impfstoffstrategie basiert auf dem Auftreten von starken Nebenwirkungen während einer medikamentösen Behandlung, als auch auf die Entwicklung von Resistenzen des Parasiten gegenüber herkömmlichen Behandlungsmethoden. Die Arbeitsgruppe um Heidrun Moll etablierte eine auf dendritischen Zellen (DZ) basierende Immunisierungsstrategie, welche langlebige Immunität gegen experimentelle Leishmaniose vermittelt. Dabei dienen CpG ODN-stimulierte DZ als Adjuvans für L.-major–Antigene (LmAg). Die durch Infektion mit Leishmania-Parasiten hervorgerufene Gewebeschädigung kann in BALB/c-Mäusen verhindert werden, vorausgesetzt eine systemische Verabreichung von LmAg-beladenen und CpG ODN-aktivierten DZ erfolgte eine Woche vor der Infektion. Es konnte gezeigt werden, dass der Schutz durch die Induktion einer von Interleukin (IL)-12 und Interferon (IFN)-gamma dominierten T-Helfer (Th)1-Immunantwort herbeigeführt wurde und kranke Kontrollmäuse eine IL-4-dominierte Th2 Immunantwort aufwiesen. Mittlerweile zeigen zahlreiche Studien, dass IL-4 nicht ausschließlich eine krankheitsfördernde Funktion innehat, sondern auch die Fähigkeit zur Einleitung eine Typ-1-Immunantwort besitzt. Auf Grund dieser Studien wurde das Augenmerk auf die Rolle von IL-4 in der DZ-basierten Immunisierung gegen Leishmaniose in BALB/c Mäusen gelegt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Notwendigkeit der Stimulation der IL-4 Rezeptor alpha (IL-4Rα) Kette auf DZ, während einer DZ-basierten Immunisierung gegen Leishmaniose in BALB/c Mäusen gezeigt. Um dies zu erreichen, wurden Wildtyp (wt)-BALB/c-Mäuse oder DZ-spezifische CD11ccreIL-4Rα-/lox BALB/c Mäuse entweder mit wt oder IL-4Rα-defizienten LmAg-beladenen DZ mit oder ohne Aktivierung durch CpG ODN, eine Woche vor der Infektion mit 2x105 L. major Promastigoten in den Hinterfuß, immunisiert. Die in dieser Doktorarbeit gezeigten Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Stimulation der IL-4Rα-Kette auf den als Adjuvans eingesetzten DZ erforderlich ist, um eine Gewebsschädigung an der Infektionsstelle zu verhindern, da konditionierte wt DZ, nicht aber IL-4Rα-defiziente DZ in der Lage sind, Schutz gegen Leishmaniose zu vermitteln. Des Weiteren konnte eine unkontrollierte Ausdehnung von Leishmania-Parasiten im infizierten Fuß und in den angrenzenden Lymphknoten von CD11ccreIL-4Rα-/lox Mäusen beobachtet werden, welche mit CpG ODN-aktivierten und LmAg-beladenen IL-4Rα-defizienten DZ immunisiert wurden. Dieser Befund zeigt den Einfluss der Stimulation der IL-4Rα-Kette auf wirtsansässigen DZ im Hinblick auf die Eindämmung der Parasitenreplikation und Parasitenverbreitung. Zusätzliche Analysen in BALB/c-Mäusen, welche mit LmAg-beladenen, CpG ODN- und rekombinanten IL-4-stimulierten DZ immunisiert wurden, zeigten einen resistenten klinischen Verlauf der Infektion. Die hier gezeigten Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass die durch die IL-4/IL-4Rα-Kette ausgelösten Signale in den DZ eine Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche Immunisierung sind und sollten deswegen unbedingt bei der Entwicklung eines Impfstoffes gegen die gewebsschädigenden Folgen einer Leishmaniose oder anderer durch intrazelluläre Mikroorganismen verursachten Infektionen berücksichtigt werden.

La plus grande sensibilité des souris TLR9-/- a révélé le rôle de ce récepteur dans l'infection par Leishmania major. Les cellules dendritiques (DCs) sont activées de manière TLR9-dépendante par l'ADN du L. major et d'autres Trypanosomatidae et non par l'ADN de vertébré. La nature de l'ADN capable d'activer le TLR9 reste controversée quant à la séquence/charpente de l'ADN et l'implication de cofacteurs se liant avec le TLR9 ou l'ADN. Nous avons démontré l'importance de la séquence d'ADN. Contrairement aux génomes de parasites, l'ADN de vertébré présente une contre-sélection des motifs activateurs du TLR9 au profit des motifs inhibiteurs. De plus, l'activation du TLR9 par l'ADN du parasite est augmentée en présence de la protéine HMGB1, qui se fixe mieux sur l'ADN de parasite que de vertébré. La maturation du TLR9 requiert un clivage protéolytique par des protéases endosomales, dont les cathepsines (Cat) B, S, L et l'asparagine endopeptidase (AEP) qui interviennent différemment dans les macrophages et les DCs. Après infection par L. major, nous avons montré que les souris AEP-/-, CatS-/- et CatL-/- ont une pathologie identique aux souris WT, ce qui peut être dû à la redondance de leur fonction. Etonnamment, les souris CatB-/- sont plus résistantes. Leurs lésions et la charge parasitaire dans les ganglions se résolvent plus rapidement, reflétant une réponse immune plus précoce et un contrôle plus rapide de la réaction inflammatoire.En conclusion, ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes permettant au TLR9 de discriminer entre l'ADN de pathogène et de vertébré et soulèvent le rôle non protecteur de la cathepsine B dans l'infection par L. major. / As TLR9-deficient mice are more sensitive to Leishmania major infection, we have shown previously that TLR9 receptor mediates this parasite infection. Dendritic cells (DCs) are activated by L. major and other Trypanosomatidae DNA and not by vertebrate DNA. There is an ongoing controversy concerning the properties of DNA required for TLR9 activation, regarding the DNA sequence or backbone or the implication of a cofactor interacting with TLR9 or DNA. We have established the importance of DNA sequences. In contrast to parasite genome, vertebrate genome have counter-selected stimulatory sequences and over-represented inhibitory motifs for TLR9. In addition, host proteins contribute to TLR9-dependent DC activation. HMGB1 enhances TLR9 activation only in the presence of L. major DNA and, surprisingly, HMGB1 binds more abundantly L. major than vertebrate DNA. TLR9 activation requires a proteolytic cleavage by endosomal proteases, as cathepsins (Cat) B, S and L and asparagine endopeptidase (AEP) that have a differential activity in macrophages and DCs. After L. major infection, we have showed that AEP-/-, CatS-/- and CatL-/- mice have a similar pathology than WT mice, likely due to their functionnally redundant activites. In contrast, CatB-/- mice are more resistant to the infection. Their lesion sizes and the parasite burdens in lymph nodes are significantly decreased, reflecting an earlier immune response and a more rapid control of the inflammatory response. In conclusion, our results bring further insights into how TLR9 discriminates between Trypanosomatidae and vertebrate DNA and reveal a non protective role of cathepsin B in L. major infection.

A amplificação gênica pode ser compreendida como um mecanismo de regulação de expressão protéica em Leishmania. A exposição a concentrações não letais de diferentes drogas isoladamente, como o metotrexato, a primaquina, cloroquina e antimônio levam à amplificação de regiões específicas como as localizadas no cromossomo 6 e no cromossomo 23. Essas linhagens tornam-se resistentes a estas drogas e eventualmente apresentam resistência cruzada a outras. A terbinafina é uma substância sintética utilizada como antifúngico que age pela inibição da esqualeno epoxidase impedindo a síntese de ergosterol, componente da membrana celular de Leishmania. A exposição do parasita à terbinafina leva à amplificação da região H. A fragmentação da região H permitiu delimitar a resistência a 2,8 kb; fragmento T1. Por mutagênese insercional o gene de resistência à terbinafina foi definido e nomeado HTBF. A proteína codificada pelo HTBF possui uma extremidade N-terminal hidrofílica e C-terminal hidrofóbica com quatro alfa-hélices sendo, supostamente, uma proteína integral de membrana. Possui semelhança com a proteína Yip de Saccharomyces cerevisiae, que participa do transporte vesicular do retículo endoplasmático para o complexo de Golgi. O gene HTBF foi detectado em linhagem sensível de L. major e de outras espécies de Leishmania e seu transcrito em linhagens sensíveis e resistentes de L. major. Levantou-se a hipótese de se tratar de locus de resistência a múltiplas drogas já que as regiões amplificadas, mesmo que induzidas por uma determinada droga, podem levar a resistência a outras. A co-transfecção do gene de resistência ao antimonial MRPA no transfectante portador do HTBF levou à diminuição em até cinco vezes da capacidade de resistência ao antimônio. Apesar dos genes de resistência amplificarem juntos na região H, foi constatado que possuem ação contrária. Sendo que a terbinafina interfere na integridade da membrana celular, levantou-se hipótese na qual a resistência envolveria o mecanismo de reparo de membrana. A perda do fenótipo de resistência pela falta de cálcio sugerindo a inativação desse mecanismo é um fenômeno previsto corroborando a hipótese. / Gene amplification can be recognized as a protein regulation mechanism in Leishmania. Exposure to non-lethal concentrations of different drugs in isolated manner, such as, methotrexate, primaquine, chloroquine and antimony drives the amplification of specific regions. Examples for amplified regions are contained in chromosomes six and 23. The strains become resistant to these drugs and eventu-ally to other drugs as well. Terbinafine is a synthetic substance used as an antifungal agent. Its mechanism of action is by squalene epoxidase inhibition, blocking ergosterol synthesis, a cell membrane component in Leishmania. Parasite exposure to terbinafine elicits H region amplification. H region fragmentation allowed resistance delimitation to 2.8kb, T1 fragment. By insertional mutagenesis terbinafine resistance gene was defined and termed HTBF. HTBF coded protein has a hydrophilic N-terminal and a hydrophobic C-terminal containing four alpha-helixes, putatively, an integral membrane protein. It possesses homology to Saccharomyces cerevisiae Yip protein, which takes part in the vesicular transport from the endoplasmic reticulum to Golgi apparatus. HTBF gene was detected in sensitive L. major strains and other Leishmania species and its transcript was detected in both resistant and sensitive L. major strains. We raised the hypothesis of a multiple drug resistance locus, since amplified regions induced by one drug could elicit resistance to a second drug. Co-transfection of MRPA to the HTBF transfectant led to a five-fold decrease to antimonial resistance level. Even though these resistance genes amplify together in the H region, they have antagonizing mechanisms of action. Since terbinafine action disrupts membrane integrity, we raised a hypothesis in which resistance involves enhancement of membrane repair machinery. Loss of phenotype caused by the lack of calcium suggests the inactivation of this machinery is a predicted phenomenon, corroborating the hypothesis.