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Forkhead box (Fox) transcription factors have a conserved function in regulating lifespan and onset of age related disease in organisms from worms to mammals. Key functions in this process are the regulation of the cell cycle, oxidative stress response, and apoptosis. A complex post-translational code from nutrient, growth factor, and stress induced signals regulates Fox activity, target specificity, stability, and subcellular localization; however, many of the Fox mechanisms and targets responsible for regulating lifespan remain elusive. The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model for unravelling the genetic mechanism and pathways. Yeast encodes four Fox transcription factors, Fkh1, Fkh2, Fhl1 and Hcm1, and their roles in aging are only recently being examined. In this study, we utilized the chronological lifespan and oxidative stress assays, to explore evolutionary conservation of lifespan regulation in two of the yeast Fox orthologs, FKH1 and FKH2. We observed that deletion of both FKH genes in S. cerevisiae, impedes normal lifespan and stress resistance. Furthermore, fkh1Δ fkh2Δ cells were found to be non-responsive to caloric restriction, an intervention that extends lifespan from yeast to mammals. Conversely, increased expression of the FKHs leads to extended lifespan and improved stress resistance. Additionally, we show the Anaphase-Promoting Complex (APC) genetically interacts with the FKHs, likely functioning in a linear pathway under normal conditions, as fkh1Δ fkh2Δ post-mitotic survival defect is epistatic to that observed in apc5CA mutants. However, under stress conditions, post-mitotic survival is dramatically impaired in apc5CA fkh1Δ fkh2Δ beyond either apc5CA or fkh1Δ fkh2Δ. Finally, we observed that both the FKHs and APC genetically interact with nutrient-responsive lifespan-regulating kinase encoding genes SCH9 and TOR1. This study establishes that the yeast FKHs play a role as regulators of lifespan in yeast and identifies the APC as a novel component of this mechanism. We speculate this involves combined regulation of stress response, genomic stability, and cell cycle.

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La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle de premier plan dans le contrôle fin de l’expression génique en permettant une modulation de la synthèse de protéines dans le temps et l’espace, en fonction des besoins de la cellule. Ainsi, des protéines reconnaissant des éléments d’ARN présents sur des transcrits peuvent influencer toutes les étapes de leur existence, soit leur épissage, leur export nucléaire, leur localisation subcellulaire, leur traduction et leur dégradation. Staufen1 (Stau1) est un membre de la famille des protéines liant l’ARN double-brin qui contribue à la régulation post-transcriptionnelle par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir l’épissage alternatif, le transport, la dé-répression de la traduction et l’induction de la dégradation d’ARN messagers (ARNm) spécifiques. L’identité des cibles potentielles de Stau1 est maintenant connue puisqu’une étude à l’échelle du génome a montré que la protéine s’associe à près de 7% du transcriptome des cellules HEK293T. Ces ARNm se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles, mais il est tout de même intéressant de noter qu’une grande proportion d’entre eux code pour des protéines reliées au métabolisme cellulaire et à la régulation de processus cellulaires. En considérant toutes ces informations, nous avons émis l’hypothèse que les différentes activités de Stau1 puissent être modulées afin de contrôler adéquatement l’expression des transcrits liés par la protéine. Dans la mesure où certains ARNm faisant partie des complexes définis par la présence de Stau1 codent pour des régulateurs clés de la prolifération cellulaire, nous avons voulu examiner si l’expression de la protéine varie au cours du cycle de division cellulaire. Nous avons montré que l’abondance de Stau1 est maximale en début de mitose et qu’elle diminue ensuite lorsque les cellules complètent la division cellulaire. Nous avons ensuite découvert que cette baisse d’expression de Stau1 en sortie de mitose dépend du complexe promoteur d’anaphase/cyclosome (APC/C). En soutien à l’idée que Stau1 soit une cible de cette ubiquitine ligase de type E3, nous avons de plus démontré que Stau1 est ubiquitiné et dégradé par le protéasome. Ce contrôle des niveaux de Stau1 semble important puisque la surexpression de la protéine retarde la sortie de mitose et entraîne une diminution importante de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, nous avons supposé que les différentes fonctions de Stau1 puissent également être sujettes à une régulation. Compte tenu que les activités de nombreuses protéines liant l’ARN peuvent être contrôlées par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, nous avons voulu tester la possibilité que Stau1 soit phosphorylé. L’immunopurification de Stau1 et son analyse par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier trois phosphosites dans la protéine. L’évaluation du rôle de ces événements de phosphorylation à l’aide de mutants phoshomimétiques ou non-phoshorylables a révélé que la modification de Stau1 pourrait compromettre son association à la protéine UPF1. Comme cette interaction est nécessaire pour déstabiliser les transcrits liés par Stau1, nos résultats suggèrent fortement que la fonction de Stau1 dans la dégradation d’ARNm est régulée négativement par sa phosphorylation. Toutes ces données mettent en lumière l’importance des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la phosphorylation dans la modulation de l’expression et des fonctions de Stau 1. Somme toute, il est vraisemblable que ces mécanismes de contrôle puissent avoir un impact significatif sur le destin des ARNm liés par Stau1, particulièrement dans un contexte de progression dans le cycle cellulaire. / Post-transcriptional regulation plays a major role in the fine tuning of gene expression by allowing a modulation of protein synthesis in space and time, according to cellular requirements. For instance, proteins recognizing RNA elements on transcripts can influence all the steps of their existence, such as their splicing, nuclear export, subcellular localization, translation and degradation. Staufen1 (Stau1) is a member of the double-stranded RNA-binding protein family that contributes to the post-transcriptional regulation of gene expression by its involvement in mechanisms that promote alternative splicing, transport, de-repression of translation and decay of specific messenger RNAs (mRNAs). The identity of potential Stau1 targets is now known as genome-wide analyses have shown that the protein is associated with about 7% of the HEK293T cell transcriptome. Although these mRNAs are classified in a broad range of functional categories, a large proportion of them code for proteins related to cellular metabolism and regulation of cellular processes. Considering all this information, we hypothesized that the different activities of Stau1 may be modulated in order to control appropriately the expression of Stau1-bound mRNAs. Since some of the mRNAs that are part of Stau1-containing complexes encode key regulators of cell proliferation, we wanted to examine whether Stau1 expression fluctuates during the cell division cycle. We showed that Stau1 abundance peaks at the onset of mitosis and then decreases as cells complete division. We then found that Stau1 down-regulation in mitosis exit is mediated by the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C). To support the idea that Stau1 is a target of this E3-ubiquitin ligase, we further demonstrated that Stau1 is ubiquitinated and degraded by the proteasome. The importance of controlling Stau1 levels during the cell cycle is underscored by the observation that its overexpression delays mitotic exit and impairs cell proliferation. Furthermore, we speculated that Stau1 different functions may also be regulated. In the view that the activities of numerous RNA-binding proteins can be controlled by post-translational modifications such as phosphorylation, we tested the possibility that Stau1 is phosphorylated. Mass spectrometry analysis of immunopurified Stau1 allowed the identification of three phosphosites in this protein. Assessment of the role of these phosphorylation events using phosphomimetic or non-phosphorylatable mutants revealed that Stau1 phosphorylation may compromise its association with Upf1. Because this interaction is necessary to elicit the destabilisation of Stau1-bound RNAs, our results strongly suggest that Stau1 function in mRNA decay is negatively regulated by its phosphorylation. Collectively, these data highlight the importance of post-translational modifications such as ubiquitination and phosphorylation in the modulation of Stau1 expression and functions. Overall, the mechanisms that control Stau1 are likely to have a significant impact on the fate of Stau1-bound mRNAs, especially in the context of cell cycle progression.

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La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle de premier plan dans le contrôle fin de l’expression génique en permettant une modulation de la synthèse de protéines dans le temps et l’espace, en fonction des besoins de la cellule. Ainsi, des protéines reconnaissant des éléments d’ARN présents sur des transcrits peuvent influencer toutes les étapes de leur existence, soit leur épissage, leur export nucléaire, leur localisation subcellulaire, leur traduction et leur dégradation. Staufen1 (Stau1) est un membre de la famille des protéines liant l’ARN double-brin qui contribue à la régulation post-transcriptionnelle par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir l’épissage alternatif, le transport, la dé-répression de la traduction et l’induction de la dégradation d’ARN messagers (ARNm) spécifiques. L’identité des cibles potentielles de Stau1 est maintenant connue puisqu’une étude à l’échelle du génome a montré que la protéine s’associe à près de 7% du transcriptome des cellules HEK293T. Ces ARNm se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles, mais il est tout de même intéressant de noter qu’une grande proportion d’entre eux code pour des protéines reliées au métabolisme cellulaire et à la régulation de processus cellulaires. En considérant toutes ces informations, nous avons émis l’hypothèse que les différentes activités de Stau1 puissent être modulées afin de contrôler adéquatement l’expression des transcrits liés par la protéine. Dans la mesure où certains ARNm faisant partie des complexes définis par la présence de Stau1 codent pour des régulateurs clés de la prolifération cellulaire, nous avons voulu examiner si l’expression de la protéine varie au cours du cycle de division cellulaire. Nous avons montré que l’abondance de Stau1 est maximale en début de mitose et qu’elle diminue ensuite lorsque les cellules complètent la division cellulaire. Nous avons ensuite découvert que cette baisse d’expression de Stau1 en sortie de mitose dépend du complexe promoteur d’anaphase/cyclosome (APC/C). En soutien à l’idée que Stau1 soit une cible de cette ubiquitine ligase de type E3, nous avons de plus démontré que Stau1 est ubiquitiné et dégradé par le protéasome. Ce contrôle des niveaux de Stau1 semble important puisque la surexpression de la protéine retarde la sortie de mitose et entraîne une diminution importante de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, nous avons supposé que les différentes fonctions de Stau1 puissent également être sujettes à une régulation. Compte tenu que les activités de nombreuses protéines liant l’ARN peuvent être contrôlées par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, nous avons voulu tester la possibilité que Stau1 soit phosphorylé. L’immunopurification de Stau1 et son analyse par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier trois phosphosites dans la protéine. L’évaluation du rôle de ces événements de phosphorylation à l’aide de mutants phoshomimétiques ou non-phoshorylables a révélé que la modification de Stau1 pourrait compromettre son association à la protéine UPF1. Comme cette interaction est nécessaire pour déstabiliser les transcrits liés par Stau1, nos résultats suggèrent fortement que la fonction de Stau1 dans la dégradation d’ARNm est régulée négativement par sa phosphorylation. Toutes ces données mettent en lumière l’importance des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la phosphorylation dans la modulation de l’expression et des fonctions de Stau 1. Somme toute, il est vraisemblable que ces mécanismes de contrôle puissent avoir un impact significatif sur le destin des ARNm liés par Stau1, particulièrement dans un contexte de progression dans le cycle cellulaire. / Post-transcriptional regulation plays a major role in the fine tuning of gene expression by allowing a modulation of protein synthesis in space and time, according to cellular requirements. For instance, proteins recognizing RNA elements on transcripts can influence all the steps of their existence, such as their splicing, nuclear export, subcellular localization, translation and degradation. Staufen1 (Stau1) is a member of the double-stranded RNA-binding protein family that contributes to the post-transcriptional regulation of gene expression by its involvement in mechanisms that promote alternative splicing, transport, de-repression of translation and decay of specific messenger RNAs (mRNAs). The identity of potential Stau1 targets is now known as genome-wide analyses have shown that the protein is associated with about 7% of the HEK293T cell transcriptome. Although these mRNAs are classified in a broad range of functional categories, a large proportion of them code for proteins related to cellular metabolism and regulation of cellular processes. Considering all this information, we hypothesized that the different activities of Stau1 may be modulated in order to control appropriately the expression of Stau1-bound mRNAs. Since some of the mRNAs that are part of Stau1-containing complexes encode key regulators of cell proliferation, we wanted to examine whether Stau1 expression fluctuates during the cell division cycle. We showed that Stau1 abundance peaks at the onset of mitosis and then decreases as cells complete division. We then found that Stau1 down-regulation in mitosis exit is mediated by the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C). To support the idea that Stau1 is a target of this E3-ubiquitin ligase, we further demonstrated that Stau1 is ubiquitinated and degraded by the proteasome. The importance of controlling Stau1 levels during the cell cycle is underscored by the observation that its overexpression delays mitotic exit and impairs cell proliferation. Furthermore, we speculated that Stau1 different functions may also be regulated. In the view that the activities of numerous RNA-binding proteins can be controlled by post-translational modifications such as phosphorylation, we tested the possibility that Stau1 is phosphorylated. Mass spectrometry analysis of immunopurified Stau1 allowed the identification of three phosphosites in this protein. Assessment of the role of these phosphorylation events using phosphomimetic or non-phosphorylatable mutants revealed that Stau1 phosphorylation may compromise its association with Upf1. Because this interaction is necessary to elicit the destabilisation of Stau1-bound RNAs, our results strongly suggest that Stau1 function in mRNA decay is negatively regulated by its phosphorylation. Collectively, these data highlight the importance of post-translational modifications such as ubiquitination and phosphorylation in the modulation of Stau1 expression and functions. Overall, the mechanisms that control Stau1 are likely to have a significant impact on the fate of Stau1-bound mRNAs, especially in the context of cell cycle progression.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est l’agent étiologique du SIDA, un rétrovirus complexe encodant les protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr et Vpu. La fonction principale de ces protéines est de moduler l’environnement cellulaire afin de promouvoir la réplication virale. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur la protéine virale Vpr, une protéine bien connue pour son activité d’arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M dans les cellules en division et pour l’avantage réplicatif qu’elle confère au virus durant l’infection de cellules myéloïdes. Les évènements sous-jacents à ces deux activités restent pour l’heure mal compris. Le but des travaux regroupés dans cet ouvrage est d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires pouvant éventuellement expliquer les activités de Vpr précédemment décrites. Pour ce faire, nous avons utilisé une approche d’identification des partenaires de proximité par biotinylation, appelée BioID. L’avantage du BioID est de permettre un marquage in cellulo des protéines à proximité de la protéine d’intérêt. La mise en place et la caractérisation de cette approche font l’objet de la première section de cette thèse. En utilisant cette approche, nous avons défini un réseau de 352 partenaires cellulaires de la protéine Vpr. Parmi ces partenaires de Vpr, plusieurs sont organisés sous forme de complexes ou réseaux protéiques incluant notamment le complexe promoteur de l’anaphase/cyclosome (APC/C) et les centrosomes. Étant donné que le complexe APC/C est l’un des principaux régulateurs du cycle cellulaire, nous avons décidé d’analyser sa relation avec Vpr. Nous avons découvert que Vpr formait un complexe non seulement avec APC1, une sous-unité essentielle du complexe APC/C, mais aussi avec les coactivateurs (CDH1 et CDC20) de ce complexe. Nous avons par la suite démontré que Vpr induisait la dégradation d’APC1 et que celle-ci pouvait être prévenue par une double-mutation N28S-G41N de Vpr. Cette dégradation d’APC1 ne semblerait pas être reliée aux activités précédemment décrites de Vpr. Ces travaux font l’objet de la seconde section de cette thèse. Enfin, dans une troisième section, des travaux effectués en collaboration et analysant la relation entre les centrosomes et Vpr sont présentés. Cette thèse identifie 200 nouveaux partenaires de Vpr, ouvrant la porte à l’exploration de nouvelles cibles et activités de Vpr. Elle décrit également une nouvelle cible de Vpr : le complexe APC/C. Globalement nos résultats contribuent à une meilleure compréhension de la façon dont le VIH-1 manipule l’environnement cellulaire de l’hôte à travers la protéine virale Vpr. / Human immunodeficiency virus (HIV-1) is the AIDS causal agent. This complex retrovirus encodes several accessory proteins; namely Nef, Vif, Vpr and Vpu; whose functions are to manipulate the cellular host environment in order to favor HIV-1 viral replication. This thesis focused on Vpr whose main activities are to induce a cell cycle arrest in the G2/M phase in dividing cells and to provide a replicative advantage to HIV-1 during infection of myeloid cells such as macrophages. The cellular mechanisms underlying these two activities are up to now misunderstood. The main goal of the work presented in this thesis is to identify new cellular factors that could potentially explain the previously described Vpr activities. To do so, we used the proximity labelling approach called BioID. The main strength of BioID is to tag in cellulo partners of the protein of interest. The development as well as optimization of the BioID approach is presented in the thesis first section. Using BioID, we defined a network containing 352 cellular partners in close proximity with the viral protein Vpr. Amongst these cellular partners, several were organized into protein complexes or networks such as the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C) or the centrosome. Given that APC/C is a cell cycle master-regulator, we analyzed the interplay governing Vpr and APC/C interactions. We first demonstrated that Vpr could form a complex containing the scaffolding subunit APC1. APC/C coactivators, namely CDH1 and CDC20, could also be found in association with Vpr. We next showed that Vpr was inducing APC1 degradation and that Vpr residues N28 and G41 were essential to this activity. Surprisingly, the APC1-Vpr interplay does not relate to previously described Vpr activities. This work is presented in the second section of this thesis. Lastly, in the third section, a work done in collaboration analyzed the interplay between Vpr and the centrosomes. In this thesis we identified 200 new potential partners of Vpr, opening the doors to discover novel Vpr targets and activities. This thesis also defined APC/C as new Vpr target. Taken together our results allow a better understanding on how HIV-1 modulates the cellular environment by using the viral accessory protein Vpr.

L'activació sostinguda de Hog1 porta a una inhibició del creixement cel·lular. En aquest treball, hem observat que el fenotip de letalitat causat per l'activació sostinguda de Hog1 és parcialment inhibida per la mutació del complexe SCFCDC4. La inhibició de la mort causada per l'activació sostinguda de Hog1 depèn de la via d'extensió de la vida. Quan Hog1 s'activa de manera sostinguda, la mutació al complexe SCFCDC4 fa que augmenti l'expressió gènica depenent de Msn2 i Msn4 que condueix a una sobreexpressió del gen PNC1 i a una hiperactivació de la deacetilassa Sir2. La hiperactivació de Sir2 és capaç d'inhibir la mort causada per l'activació sostinguda de Hog1. També hem observat que la mort cel·lular causada per l'activació sostinguda de Hog1 és deguda a una inducció d'apoptosi. L'apoptosi induïda per Hog1 és inhibida per la mutació al complexe SCFCDC4. Per tant, la via d'extensió de la vida és capaç de prevenir l'apoptosi a través d'un mecanisme desconegut. / Sustained Hog1 activation leads to an inhibition of cell growth. In this work, we have observed that the lethal phenotype caused by sustained Hog1 activation is prevented by SCFCDC4 mutants. The prevention of Hog1-induced cell death by SCFCDC4 mutation depends on the lifespan extension pathway. Upon sustained Hog1 activation, SCFCDC4 mutation increases Msn2 and Msn4 dependent gene expression that leads to a PNC1 overexpression and a Sir2 deacetylase hyperactivation. Then, hyperactivation of Sir2 is able to prevent cell death caused by sustained Hog1 activation. We have also observed that cell death upon sustained Hog1 activation is due to an induction of apoptosis. The apoptosis induced by Hog1 is decreased by SCFCDC4 mutation. Therefore, lifespan extension pathway is able to prevent apoptosis by an unknown mechanism.