O maior interesse dos consumidores por alimentos que tragam benefícios à saúde faz necessário o constante desenvolvimento de métodos de tecnologias que tornem possível a sua produção em grande escala. Dentre tais tecnologias, destaca-se a microencapsulação de componentes bioativos. Lipossomas têm sido amplamente estudados para diversos fins, dentre eles, a encapsulação e a veiculação de bioativos, pois permitem maior proteção dos bioativos encapsulados, bem como podem promover a liberação controlada dos mesmos. Dentre os bioativos de interesse da indústria de alimentos está a curcumina, que além de ser um poderoso antioxidante, pode ser uma ótima alternativa para substituição de corantes amarelos. Tais corantes amarelos possuem diversos efeitos colaterais conhecidos, como a alegernicidade. A fabricação de iogurtes no Brasil vem crescendo de maneira considerável, e a este fato pode-se atribuir o consumo por indivíduos que buscam suas características funcionais, tendo seu consumo associado a uma imagem positiva e aos benefícios que traz ao organismo. Tal produto se torna, portanto, bastante atrativo para utilização de curcumina encapsulada em lipossomas e sua utilização vai ao encontro dos interesses dos consumidores. Neste trabalho de Doutorado foram produzidos lipossomas multilamelares encapsulando curcumina, através do método inovador de hidratação de prolipossomas obtidos por recobrimento de sacarose micronizada. Os prolipossomas foram caracterizados, e constatou-se através de microscopia eletrônica de varredura que a sacarose foi completamente recoberta pelos fosfolipídios. Além disso, o pó obtido se mostrou amorfo e com solubilidade de 98% em água, fatores extremamente importantes para a etapa posterior de hidratação dos prolipossomas para formação das vesículas em dispersão. Também se mostraram com baixíssima capacidade de retenção de umidade, característica importante para aumentar sua vida de prateleira durante o armazenamento. Por sua vez, os lipossomas foram efetivos em preservar a curcumina encapsulada (70% da curcumina foi preservada após 30 dias de armazenagem sob refrigeração), com diâmetro médio aproximado de 700-800 nm. A incorporação dos lipossomas encapsulando curcumina em iogurte não alterou nenhum parâmetro físico-químico do produto, como composição centesimal, pH, acidez titulável e comportamento reológico. Os resultados da análise sensorial mostraram que o produto teve alta aceitação por parte dos panelistas, sendo que a apenas a adição de pedaços de fruta não foi bem aceito por parte dos consumidores. / The increased consumer interest in food products that produces health benefits requires constant development of methods and technologies to make possible their production on a large scale. Among these technologies, there are the processes of microencapsulation of bioactive components. Liposomes have been extensively studied for a variety of purposes, including the encapsulation and delivery of bioactives, as they allow greater protection of encapsulated bioactive substances as well as promote the controlled release of bioactive substances. Among the bioactives of interest in the food industry is curcumin, which in addition to being a powerful antioxidant, can be a great alternative for yellow dye substitution. Such yellow dyes have several known side effects, such as allergenicity. The production of yogurt in Brazil has been growing considerably, and this fact can be attributed consumption by individuals seeking their functional characteristics, having its consumption associated with a positive image and the benefits it brings to the body. Such a product, therefore, becomes quite attractive for use to test the incorporation of curcumin-loaded liposomes, to verify if their characteristics would meet the interests of consumers. In the present PhD, multilamellar liposomes were produced to encapsulate curcumin, through the innovative method of hydration of proliposomes obtained by coating of micronized sucrose. The proliposomes were characterized, and it was found by scanning electron microscopy that the sucrose was completely covered by the phospholipids. In addition, the powder obtained showed to be amorphous and with solubility of 98% in water, factors extremely important for the subsequent hydration of the proliposomes to form the vesicles in dispersion. They were also shown to have very low moisture retention capacity, an important feature to increase shelf life during storage. In turn, liposomes were effective in preserving encapsulated curcumin (70% of curcumin was preserved after 30 days of storage under refrigeration), with an approximate mean diameter of 700-800 nm. The incorporation of the liposomes encapsulating curcumin into yogurt did not change significantly any relevant physicochemical parameters of the dairy product, such as proximate composition, pH, titratable acidity and rheological behavior. The results of the sensorial evaluation showed that the product had high acceptance by the panelists, and that only the addition of pieces of fruit was not well accepted by the consumers.

A onicomicose é uma doença comum na lâmina ungueal, constituindo aproximadamente metade dos casos de infecção nas unhas. O tratamento convencional consiste na administração de antifúngicos e antibióticos por longos períodos. O aumento de linhagens microbianas resistentes aos fármacos disponíveis e a alta incidência deste tipo de infecção na população tornam importante o desenvolvimento de novas tecnologias e opções terapêuticas. A Terapia Fotodinâmica (TFD) consiste no emprego do fotossensibilizador (FS) ativado por luz em comprimento de onda adequado que, na presença de oxigênio, produz espécies reativas de oxigênio tóxicas que inativam os microrganismos. Os objetivos deste estudo foram: analisar o uso de curcumina e clorina como FSs; estudar mecanismos que auxiliam na penetração do FS na lâmina ungueal através da utilização de emolientes e novas formulações farmacêuticas; Desenvolver dispositivos projetados para iluminar as unhas dos pés e das mãos para o tratamento de onicomicose por TFD. Realizar a TFD com as tecnologias desenvolvidas em pacientes com onicomicose a fim de avaliar a eficácia, além de explorar novos métodos diagnóstico da doença com base em imagens térmicas e de fluorescência. OS resultados indicam que a curcumina é um FS mais efetivo que a clorina para o tratamento onicomicose por TFD. Também foi identificado que os veículos emulsão fornecem uma entrega superior de curcumina em unhas infectadas. Os dispositivos de iluminação desenvolvidos especificamente para a anatomia das unhas de pé e mãos também facilitaram a aplicação da TFD para o tratamento da onicomicose. Os novos veículos FS baseados em curcumina e os dispositivos de iluminação desenvolvidos foram avaliados em um estudo clínico com 30 pacientes. Este estudo indicou que a entrega de curcumina via emulsão foi mais eficaz do que a entrega via gel, conforme quantificado pelo número de sessões de TFD necessárias para resposta clínica positiva (6 semanas para emulsão e 10 semanas para gel). Finalmente, a viabilidade de realizar imagens térmicas e de fluorescência de unhas em pacientes com onicomicosis abre a possibilidade de explorar essas modalidades de imagem como ferramentas complementares para o diagnóstico não invasivo de onicomicose. Em conclusão, devido à sua eficácia demonstrada, baixo custo e simplicidade para operar, as tecnologias desenvolvidas através deste trabalho facilitarão a adoção da TFD como um tratamento novo e efetivo da onicomicose. / Onychomycosis is a common disease of the nail plate and constitutes approximately half of the cases of nail infection. The conventional treatment of onychomycosis consists of the administration of anti-fungal drugs and antibiotics for long periods of time. Due to both the increase of microbial lines resistant to available drugs and the high incidence of this type of infections, it is highly relevant to develop new technologies and therapeutic options. Photodynamic Therapy (PDT) consists of the use of photosensitizers (FS) activated by light of specific wavelengths that, in the presence of oxygen, produces toxic reactive oxygen species that can inactivate the microorganisms. The objectives of this study were: to analyze the use of curcumin and chlorine as FSs for PDT therapy of onychomycosis; to identify mechanisms for enhancing the penetration of FS in the nail plate via the application of emollients and novel pharmaceutical formulations; to develop devices specifically designed for illuminating the nails of feet and hands for PDT treatment of onychomycosis; to perform PDT with the developed technologies on patients with onychomycosis and evaluate its efficacy; to explore novel diagnosis methods for onychomycosis based on thermal and fluorescence imaging. Our results indicate that curcumin is a more effective FS than chlorine for the PDT treatment of onychomycosis. It was also identified that emulsion vehicles provide a superior delivery of curcumin into infected nails. The illumination devices developed specifically for the anatomy of foot and hand nails also facilitated the application of PDT for the treatment of onychomycosis. The novel FS vehicles based on curcumine and the developed illumination devices were evaluated in a pilot clinical study with 30 patients. This study indicated that delivery of curcumine via emulsion was more effective than the delivery via gel, as quantified by the number of PDT sessions needed for positive clinical response (6 weeks for emulsion vs. 10 weeks for gel). Finally, the feasibility to perform both thermal and fluorescence imaging of nails in patients with onychomycosis opens to the possibility of exploring these imaging modalities as complementary tools for the noninvasive diagnosis of onychomycosis. In conclusion, due to its demonstrated efficacy, low cost and simplicity to operate, the technologies developed through this work will facilitate the adoption of PDT as a novel and effective treatment of onychomycosis.

Orientador: Lívia Nordi Dovigo / Resumo: Estima-se que mais de 60% das infecções humanas são originadas pela presença de biofilmes. A placa dentária é o biofilme mais antigo descrito na literatura epode ser composta por diferentes gêneros e espécies, com destaque para a atuação de Lactobacillus spp, Streptococcus do grupo mutans e Candida albicans. A Inativação Fotodinâmica (do inglês, Photodynamic Inactivation - PDI) vem sendo apontada como modalidade terapêutica promissora para a inativação de microrganismos bucais visando sanar os problemas relacionados com a resistência dos microrganismos e não promover efeitos colaterais adversos. Estudos prévios conduzidos dentro e fora de nosso grupo de pesquisa mostraram que a curcumina possui grande potencial como fotossensibilizador para a PDI. Apesar disso, a curcumina apresenta baixa solubilidade em soluções aquosas e por isso esse estudo se propôs a avaliar a eficácia antimicrobiana da PDI, utilizando a curcumina veiculada em sistema precursor de cristal líquido (SPCL), em biofilmes dentais formados in situ. Esse sistema possui diversas vantagens descritas na literatura, como sua bioadesividade no local de ação, liberação controlada e biocompatibilidade. No entanto, nenhum estudo avaliou o sistema precursor de cristal líquido veiculando curcumina para ação fotodinâmica em biofilmes dentais. Este estudo contou com 30 voluntários que utilizaram dispositivos orais palatinos, contendo blocos de esmalte bovino, por 48 horas para a formação de biofilme in situ. Após esse perí... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: It is estimated that more than 60% of human infections are originated by the presence of biofilms. The dental plaque, reported as the oldest biofilm, can be composed of many different species, highlighting Lactobacillus spp, Streptococcus mutans and Candida albicans. Photodynamic Inactivation (PDI) has been suggested as a promising therapeutic modality for the inactivation of oral microorganisms, in order to overcome the problems related to microorganism resistance and prevent adverse side effects. Previous studies have shown that curcumin is a promising photosensitizer for PDI. Nevertheless, curcumin has low solubility in aqueous solutions, therefore, this study proposed to evaluate the antimicrobial efficacy of the PDI, using the curcumin in a liquid crystal precursor system (LCPS), in dental biofilms formed in situ. This system has several advantages described in the literature, such as its bioadhesiveness at the site of action, controlled release and biocompatibility. However, no study evaluated the LCPS carrying curcumin for photodynamic action on biofilms formed in situ. This study included 30 volunteers who used oral palatal devices containing bovine enamel blocks for 48 hours for in situ biofilm formation. After that period, the enamel blocks were randomized into two groups: i. control group (empty LCPS only); ii. PDI (immersed in LCPS with curcumin in the dark and then illuminated with a blue light LED) incubated, (PDI group). After the treatments, the CFU/ml of each group was determined in culture media presumptive for Streptococci mutans, Candida spp, Lactobacillus spp. and aciduric species, and total microbiota, specific to the culture conditions for this study. Multivariate analysis showed that the treatment had a large and highly significant effect on microbial viability. Univariate ANOVA was then performed, which revealed a significant reduction on log10(CFU/mL) values in the PDI ...(Complete abstract electronic access below) / Mestre

Nosso grupo estudou paciente com antecedente de infecções graves e deficiência homozigota Fator H (mutação CG453T→CA453T). Esta mutação leva a troca de códon Arg127His na molécula de Fator H (FH) resultando em acúmulo deste no retículo endoplasmático. Quando tratada a cultura de fibroblastos do paciente com curcumina in vitro, estes apresentaram aumento de secreção do FH, que mesmo mutado, apresentava função reguladora preservada. Neste protocolo, foi utilizado Theracurmin® (curcumina nanopartículada) para tratar a deficiência de FH deste paciente. Em avaliação prévia ao tratamento, foi diagnosticado lúpus com grau de atividade SLEDAI 4/105. No tratamento experimental, foram avaliados nível plasmático de curcumina e tetrahidrocurcumina. O paciente não apresentou sintomas adversos. Foi possível identificar que os níveis de curcumina e seus metabólitos se relacionaram a discreto aumento de FH detectado por Western Blot, porém sem normalização do FH e C3. O grau de atividade do lúpus se manteve estável ao longo de todo o tratamento. / Our group investigated a patient with a past of severe infections and homozygous deficiency Factor H (mutation CG453T → CA453T). This mutation leads to Arg127His codon exchange in the Factor H (FH) molecule resulting in accumulation of this protein in the endoplasmic reticulum. Once the culture of fibroblasts of the patient was treated with curcumin in vitro, they presented increased secretion of FH, which had his regulatory function. In this protocol, Theracurmin® (nanoparticle curcumin) was used to treat the FH deficiency of this patient. In pre-treatment evaluation, the pacient was diagnosed lupus with SLEDAI grade of activity 4/105. In the experimental treatment, plasma levels of curcumin and tetrahydrocurcumin were evaluated. The patient hasn\'t had adverse symptoms. It was possible to identify that the levels of curcumin and its metabolites were related to the discrete increase of FH detected by Western Blot, but without normalization of FH and C3. The degree of lupus activity remained stable throughout the treatment.

A prevenção das doenças periimplantares baseia-se em procedimentos de rotina na clínica, com a remoção mecânica do biofilme associada ou não de agentes antimicrobianos locais e sistêmicos. No entanto, o controle do biofilme oral sobre a superfície de implantes é dificultado particularmente sobre as superfícies rugosas do titânio, que apesar de facilitarem a osseointegração, também favorecem a formação do biofilme. Objetivos: Objetivou-se analisar in vitro o efeito da TFD (Terapia fotodinâmica) usando curcumina como fotossensibilizador sobre o biofilme formado na superfície de discos de titânio com superfície rugosa e lisa. Material e Métodos: Biofilme mono espécie de Streptococus gordonii, colonizador inicial do biofilme dental, foi formado em superfícies lisas (usinadas) e rugosas (tratadas) de discos de titânio por 72 horas. Os discos lisos e rugosos foram então distribuídos em 3 grupos: tratados por 5 minutos com curcumina (60?M), clorexidina 0,12% como controle positivo e solução de DMSO (dimetilsufóxido), etanol e água como controle negativo (veículo da curcumina). As amostras foram divididas em 2 sub-grupos: ativado por LED azul (455-492nm) por 7 minutos e não-ativado. A atividade metabólica do biofilme foi determinada pelo método de redução do Sal tetralisol XTT e os resultados analisados estatisticamente pela análise da variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey (p < 0,05). Resultados: Na ausência de luz, apenas o tratamento com clorexidina promoveu redução microbiana (controle positivo). O tratamento com curcumina ativada pela luz azul reduziu o número de bactérias viáveis no biofilme em 71% nos discos lisos e em 77% nos rugosos, não havendo diferença estatística com o controlepositivo.Conclusão: Os dados in vitro indicam que TFD associada à curcumina tem atividade sobre biofilme microbiano, sugerindo seu potencial no controle do biofilme oral sobre a superfície de titânio, e que este efeito independe da topografia da superfície. / Prevention of periimplant diseases is based on routine procedures in the clinic, with the mechanical removal of biofilm associated or not with local and systemic antimicrobial agents. However, the control of oral biofilm on the surface of implants is particularly difficult on the rough surfaces of titanium, which, although facilitating osseointegration, also favors biofilm formation. Objectives: The objective of this study was to analyze in vitro the effect of PDT using curcumin as a photosensitizer on the biofilm formed on the surface of titanium discs with a rough and smooth surface. Material and Methods: Biofilm mono species of Streptococus gordonii, initial colonizer of the dental biofilm, was formed on smooth (machined) and rough (treated) surfaces of titanium discs for 72 hours. The smooth and rough discs were then divided into 3 groups: treated for 5 minutes with curcumin (60 ?M), 0.1% chlorhexidine as a positive control and DMSO, ethanol and water solution as a negative control. The samples were divided into 2 subgroups: activated by blue LED (455-492nm) for 7 minutes and non-activated. The metabolic activity of the biofilm was determined by the reduction XTT salt method and the results analyzed statistically by ANOVA followed by the Tukey\'s test (p <0.05) Results: In the absence of light, only the chlorhexidine treatment promoted microbial reduction (positive control). The blue light-activated curcumin treatment reduced the number of viable bacteria in the biofilm in 71% in the smooth discs and in 77% in the wrinkles, and there was no statistical difference with the positive control. Conclusion: In vitro data indicate that PDT associated with curcumin has activity on microbial biofilm, suggesting its potential in the control of oral biofilm on the titanium surface, and that this effect is independent of surface topography.

Melanoma é o câncer mais agressivo e a mutação BRAF V600E é a mais frequente entre os pacientes. O vemurafenibe foi o primeiro inibidor específico desta mutação aprovado pela Food and Drug Administration. Entretanto, após cerca de seis meses há recidiva e superar os mecanismos de resistência responsáveis por este fenômeno ainda é um desafio. A curcumina é um tumérico com características antitumorais e anti-inflamatórias, entretanto sua baixa biodisponibilidade e estabilidade limitam seu uso e por isso impulsionaram a busca por análogos capazes de serem eficientes e comercializados. O DM-1, é um análogo monocetônico que apresentou efeitos antiumorais in vitro e in vivo em estudos anteriores. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos citotóxicos do DM-1 em células de melanoma sensíveis (naive) e resistentes ao vemurafenibe, bem como na modulação de metaloproteinases. As células de melanoma foram tratadas com diferentes concentrações de DM-1, e este composto foi citotóxico para linhagens sensíveis e resistentes ao vemurafenibe, além de induzir parada de ciclo celular em G1/G0 e diminuir o número de colônias, entretanto ele não foi seletivo em ensaios de citotoxicidade realizados com melanócitos e fibroblastos. O tratamento dessas células em doses subtóxicas resultou na modulação de metaloproteinases importantes no processo de invasão celular. O DM-1 reduziu as concentrações das metaloproteinases -1, -2 e -9 (MMP-1, -2 e -9) em um ensaio de quantificação de MMPs e a atividade das MMP-2 e -9 em um ensaio de zimografia de maneira célula dependente. As modulações negativas do inibidor de MMP TIMP-2 e MMP-14 para SKMEL-28 naive foram associadas a diminuição das atividades de MMP-2 e -9, enquanto que as modulações positivas para SKMEL-19 naive foram relacionadas ao aumento de MMP-2. Este composto ainda inibiu a migração das células e a formação de tubos por células endoteliais. / Malignant melanoma is the most aggressive cancer and the BRAF V600E mutation is the most frequent among patients. Vemurafenib was the first specific inhibitor for this mutation approved by Food and Drug Administration. Therefore around six months later there is relapse and overcoming it is still a challenge. Curcumin is a turmeric and it has been deeply researched because of its anti-inflammatory and antitumoral effects. However the low stability limits its use, therefore, encouraged the investigation of analogues capable to be efficient and commercialized. DM-1 is a monoketone curcumin analog and it showed antitumoral effects in vitro and in vivo in previous studies The aim of this project was to evaluate the cytotoxical effects of DM-1 for vemurafenib responsive (naïve) and resistant melanoma cells, as well as metalloproteinases modulation. Melanoma cells were treated with different DM-1 concentrations, and this compound was cytotoxic for responsive and resistant cell lines, besides inducing G1/G0 cell cycle arrest and reducing the number of colonies, nonetheless it was not selective in assays performed with melanocytes and fibroblasts. Subtoxic treatment of those cells modulated important MMPs in the cell invasion process. DM-1 reduced metalloproteinases -1, -2 and -9 (MMP-1,-2 and -9) in a quantification assay, and MMP-2 and -9 activities by zymography in a cell-dependent way. Negative modulations of MMP inhibitor TIMP-2 and MMP-14 for SKMEL-28 naïve were associated with MMP-2 and -9 reduced activities, whereas positive modulations for SKMEL-19 naïve were correlated to MMP-2 increase. Furthermore, this compound reduced migration of those cells and endothelial cell tube formation.

Diversas alterações genéticas estão associadas à patogênese do carcinoma epidermoide (CE), neoplasia maligna mais comum de cabeça e pescoço. Algumas dessas alterações comprometem proteínas pertencentes à via de sinalização do Akt, envolvida em diferentes fenômenos celulares. Este trabalho teve como objetivo estudar a expressão da proteína pAkt em linhagens celulares de carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço, de forma a verificar possíveis alterações na transcrição dessa molécula em células de CE tratadas com Curcumina. Foram utilizadas duas linhagens celulares de CE de cabeça e pescoço (FaDu e SCC9) e uma linhagem de queratinócitos normais (HaCat) divididas em dois grupos: a. Grupo controle não tratado; b. Células tratadas com Curcumina. A proliferação celular foi monitorada através do teste de viabilidade celular e a análise da expressão de proteína foi realizada através da técnica do Western Blotting que revelou supressão do pAkt na linhagem celular SCC9 nos tempos de 24 e 48 horas. Desta forma, conclui-se que a Curcumina na via do Akt em carcinomas epidermoides de cabeça e pescoço tem importante ação supressora do gene pAkt. / Several genetic alterations are associated with the pathogenesis of squamous cell carcinoma (SCC), the most common malignant neoplasm of the head and neck. Some of these changes compromise the proteins belonging to the Akt signaling pathway, involved in various cellular phenomena. The objective of this study to explores the expression of the pAkt protein in cell lines of the squamous cell carcinomas of the head and neck to verify possible changes in the transcription of this molecule in EC cells treated with curcumin. The study used two cell lines of EC head and neck (FaDu and SCC9) and a normal line of keratinocytes (HaCat), split into two groups: A. the controlled group, untreated; B. Cells treated with curcumin. The cell proliferation it was observed by cell viability test and analysis of protein expression performed through Western blotting technique revealed suppression of pAkt in SCC9 cell line at 24 and 48 hours. Thus, it is concluded that the Curcumin on the path of Akt in squamous cell carcinoma of the head and neck has a significant suppressive effect of gene Akt.

Esta tese de doutorado trata do desenvolvimento inédito de formas farmacêuticas sólidas contendo nanocápsulas de núcleo lipídico, facilmente redispersíveis em água, empregando a secagem por aspersão ou granulação em leito fluidizado. A estratégia visa superar limitações tecnológicas associadas às suspensões de nanocápsulas poliméricas, pela sua natureza coloidal, e avançar na fronteira do conhecimento, buscando o desenvolvimento de formulações inovadoras para a administração oral de fármacos. Foram produzidos pós e grânulos contendo nanocápsulas de núcleo lipídico (LNC), empregando a secagem por aspersão e granulação em leito fluidizado, respectivamente. A influência do número de partículas das suspensões de nanocápsulas nas propriedades de redispersão dos pós produzidos pela secagem por aspersão foi investigada. Uma mistura de maltodextrina e L-leucina (90:10 m/m) foi utilizada como adjuvante de secagem. A formulação que obteve os melhores perfis de redispersão consistiu de uma mistura da suspensão de nanocápsulas de núcleo lipídico e de uma solução contendo maltodextrina/L-leucina (10% m/v) em uma proporção 1:1 v/v. Após a redispersão dos pós produzidos em água, 75% do número inicial de partículas de nanocápsulas foi recuperado. Análises de área superficial, microscopia eletrônica de varredura e microscopia confocal Raman permitiram compreender as diferenças na organização estrutural destes pós. Estes dados, em conjunto com análises de diâmetro médio de partículas, obtidos por difratometria de laser, confirmaram a influência do número inicial de partículas das suspensões de nanocápsulas na qualidade de sua redispersão, a partir de formulações sólidas obtidas pela secagem por aspersão. Para compreender as influências dos processos de secagem e redispersão da formulação proposta no perfil de liberação in vitro e na atividade biológica de fármacos associados ao sistema, novos pós foram preparados, substituindo-se a suspensão de nanocápsulas sem fármaco (LNC) por nanocápsulas contendo uma substância ativa modelo (curcumina) (LNC-C 1 mg mL-1). A formulação seca demonstrou adequada redispersão em água e o perfil de liberação in vitro manteve-se semelhante ao da suspensão original (LNC-C), seguindo um modelo cinético de ordem zero. A atividade da curcumina nanoencapsulada foi avaliada empregando um modelo de inflamação induzida por LPS em cultura organotípica de cultura de hipocampo cerebral de ratos. Não houve alterações nas concentrações de biomarcadores pró-inflamatórios (TNF-α e IL-1β) liberados nos meios de cultura, comparando-se as LNC-C em suspensão ou a redispersão dos pós secos. Portanto, a produção de pós facilmente redispersíveis não implica em alterações no controle da liberação in vitro e na atividade biológica da substância ativa nanoencapsulada. Na última etapa, a obtenção dos grânulos empregando granulador em leito fluidizado foi estudada utilizando maltodextrina, como material de suporte, e suspensões de nanocápsulas de núcleo lipídico estabilizadas com polissorbato 80 (LNC) ou com revestimento catiônico (C-LNC), como líquidos aglutinantes. A influência do revestimento catiônico das nanocápsulas nas características tecnológicas dos grânulos obtidos foi avaliada. Propriedades como o tamanho de partícula, rendimento, teor de umidade, características morfológicas, propriedades de fluxo e perfil de redispersão foram estudados. Os rendimentos do processo de granulação foram próximos a 90%, resultando em grânulos com teor de umidade inferior a 4%. Valores calculados de índice de Carr, fator de Hausner e índice de coesão indicaram que as formulações de grânulos propostas neste estudo apresentam melhores características de fluxo em relação à maltodextrina (matéria-prima). O revestimento catiônico das nanocápsulas melhorou tanto as propriedades de fluxo quanto o perfil de redispersão em água dos grânulos contendo C-LNC, demonstrado a partir das análises de diâmetro médio de partículas por difratometria de laser. Em conclusão, os processos de secagem por aspersão e granulação em leito fluidizado, empregados neste estudo, para a produção de formas farmacêuticas sólidas intermediárias e/ou finais contendo nanocápsulas de núcleo lipídico, mostraram-se alternativas viáveis para a produção de pós e grânulos facilmente redispersíveis em água, com potencial aplicação para administração oral de fármacos nanoencapsulados. / This thesis proposes the development of novel easily redispersible solid dosage forms containing lipid-core nanocapsules, produced by spray drying or fluidized bed granulation. The strategy aims to overcome the technological limitations associated to polymeric nanocapsule suspensions, due to their colloidal nature, aiming the development of innovative oral formulations. Powders and granules containing lipid-core nanocapsules (LNC) were produced by spray-drying and fluidized bed granulation, respectively. The influence of the number of particles of the nanocapsule suspensions on the redispersion properties of the spray-dried powders was investigated. A mixture of maltodextrin and L-leucine (90:10 m/m) was used as a drying adjuvant. The formulation that obtained the best redispersion profiles consisted of a mixture of the lipid-core nanocapsule suspension and a solution containing maltodextrin/L-leucine (10% w/v) in a 1:1 v/v ratio. After the aqueous redispersion, 75% of the initial number of particles in the nanocapsules suspension was recovered. Analysis of surface area, by scanning electron microscopy and by Raman confocal microscopy allowed understanding the differences in the structural organization of the powders produced. These results along with the mean diameter analysis by laser diffractometry confirmed the influence of the initial number of particles of the nanocapsule suspensions on the redispersion properties of the spray-dried powders. In order to understand the influence of the drying and redispersion processes on the in vitro release profile and the biological activity of substances associated to this system, new powder formulations were prepared by replacing the unloaded suspension of nanocapsules (LNC) by nanocapsules containing an active substance (curcumin) (LNC-C 1 mg mL-1). The spray-dried powder showed good aqueous redispersion profile and its in vitro release profile remained similar to that of the original LNC-C suspension, according to the zero-order kinetic model. The biological activity of nanoencapsulated curcumin was assessed by a model of LPS-induced inflammation in organotypic hippocampal slice cultures. There were no changes in the concentration of pro-inflammatory biomarkers (TNF-α and IL-1β) released in the culture media, comparing the LNC-C as the initial suspension or the aqueous redispersion of their spray-dried powders. The drying process does not imply changes in the control of in vitro release and in the biological activity of the nanoencapsulated active substance. In the last stage, granules were produced using a fluidized bed granulator and maltodextrin, as support material. Lipid-core nanocapsules suspensions stabilized with polysorbate 80 (LNC) or with a cationic coating (C-LNC) were used as binder liquids. The influence of the cationic coating of the nanocapsules on the technological characteristics of the produced granules was evaluated. Properties such as particle size, yield, moisture content, morphological characteristics, flow properties and redispersion profile were also studied. Granulation process yields were close to 90%, resulting in granules with moisture content of less than 4%. Calculated values of Carr index, Hausner ratio and cohesion index indicated that the granule formulations proposed in this study present better flow characteristics in relation to the maltodextrin raw material. The cationic coating of the nanocapsules improved the flow properties and the aqueous redispersion profile of the granules containing C-LNC, as demonstrated by laser diffraction analysis. In conclusion, the spray-drying and fluidized bed granulation processes used in this study are viable alternatives for the production of easily redispersible powders and granules containing lipid-core nanocapsules, showing potential application for oral administration of drug-loaded lipid-core nanocapsules.

O maior interesse dos consumidores por alimentos que tragam benefícios à saúde faz necessário o constante desenvolvimento de métodos de tecnologias que tornem possível a sua produção em grande escala. Dentre tais tecnologias, destaca-se a microencapsulação de componentes bioativos. Lipossomas têm sido amplamente estudados para diversos fins, dentre eles, a encapsulação e a veiculação de bioativos, pois permitem maior proteção dos bioativos encapsulados, bem como podem promover a liberação controlada dos mesmos. Dentre os bioativos de interesse da indústria de alimentos está a curcumina, que além de ser um poderoso antioxidante, pode ser uma ótima alternativa para substituição de corantes amarelos. Tais corantes amarelos possuem diversos efeitos colaterais conhecidos, como a alegernicidade. A fabricação de iogurtes no Brasil vem crescendo de maneira considerável, e a este fato pode-se atribuir o consumo por indivíduos que buscam suas características funcionais, tendo seu consumo associado a uma imagem positiva e aos benefícios que traz ao organismo. Tal produto se torna, portanto, bastante atrativo para utilização de curcumina encapsulada em lipossomas e sua utilização vai ao encontro dos interesses dos consumidores. Neste trabalho de Doutorado foram produzidos lipossomas multilamelares encapsulando curcumina, através do método inovador de hidratação de prolipossomas obtidos por recobrimento de sacarose micronizada. Os prolipossomas foram caracterizados, e constatou-se através de microscopia eletrônica de varredura que a sacarose foi completamente recoberta pelos fosfolipídios. Além disso, o pó obtido se mostrou amorfo e com solubilidade de 98% em água, fatores extremamente importantes para a etapa posterior de hidratação dos prolipossomas para formação das vesículas em dispersão. Também se mostraram com baixíssima capacidade de retenção de umidade, característica importante para aumentar sua vida de prateleira durante o armazenamento. Por sua vez, os lipossomas foram efetivos em preservar a curcumina encapsulada (70% da curcumina foi preservada após 30 dias de armazenagem sob refrigeração), com diâmetro médio aproximado de 700-800 nm. A incorporação dos lipossomas encapsulando curcumina em iogurte não alterou nenhum parâmetro físico-químico do produto, como composição centesimal, pH, acidez titulável e comportamento reológico. Os resultados da análise sensorial mostraram que o produto teve alta aceitação por parte dos panelistas, sendo que a apenas a adição de pedaços de fruta não foi bem aceito por parte dos consumidores. / The increased consumer interest in food products that produces health benefits requires constant development of methods and technologies to make possible their production on a large scale. Among these technologies, there are the processes of microencapsulation of bioactive components. Liposomes have been extensively studied for a variety of purposes, including the encapsulation and delivery of bioactives, as they allow greater protection of encapsulated bioactive substances as well as promote the controlled release of bioactive substances. Among the bioactives of interest in the food industry is curcumin, which in addition to being a powerful antioxidant, can be a great alternative for yellow dye substitution. Such yellow dyes have several known side effects, such as allergenicity. The production of yogurt in Brazil has been growing considerably, and this fact can be attributed consumption by individuals seeking their functional characteristics, having its consumption associated with a positive image and the benefits it brings to the body. Such a product, therefore, becomes quite attractive for use to test the incorporation of curcumin-loaded liposomes, to verify if their characteristics would meet the interests of consumers. In the present PhD, multilamellar liposomes were produced to encapsulate curcumin, through the innovative method of hydration of proliposomes obtained by coating of micronized sucrose. The proliposomes were characterized, and it was found by scanning electron microscopy that the sucrose was completely covered by the phospholipids. In addition, the powder obtained showed to be amorphous and with solubility of 98% in water, factors extremely important for the subsequent hydration of the proliposomes to form the vesicles in dispersion. They were also shown to have very low moisture retention capacity, an important feature to increase shelf life during storage. In turn, liposomes were effective in preserving encapsulated curcumin (70% of curcumin was preserved after 30 days of storage under refrigeration), with an approximate mean diameter of 700-800 nm. The incorporation of the liposomes encapsulating curcumin into yogurt did not change significantly any relevant physicochemical parameters of the dairy product, such as proximate composition, pH, titratable acidity and rheological behavior. The results of the sensorial evaluation showed that the product had high acceptance by the panelists, and that only the addition of pieces of fruit was not well accepted by the consumers.

背景及研究目的：據報導薑黃素（curcumin）在阿爾茨海默癥（老年癡呆癥）的動物模型中表現出有效性。這可能與其能阻抑β 澱粉樣蛋白的聚集有關，而β 澱粉樣蛋白正是老年癡呆癥中達成共識的神經毒性物質。然而，薑黃素的水溶性很差，這一弱點直接限制其在作為口服藥物的生物利用度。羥丙基-β-環糊精是一種由七個單糖分子鍵合成的環狀分子，該環具有親水性的外部和疏水性的內部，這一特點使得疏水性藥物可以裝入環糊精分子內部從而提高該藥物的親水性，進而提高藥物的口服吸收率。 / 方法：包合物在50 攝氏度下，由摩爾比為1:2 的薑黃素和羥丙基-β-環糊精經過6 小時的攪拌而形成。其后对包合物的物化性質與相同摩爾比的薑黃素與羥丙基-β-環糊精的混合物的物化特性进行了对比以证实包合物的形成，诸如水溶性，掃描電鏡下的形態以及傅利葉紅外圖譜特性。接著用經包合物和普通薑黃素粉末喂食的SD 大鼠做藥代動力學研究，取出大鼠血樣然之後用高效液相色譜-質譜聯用法對薑黃素進行定量，計算出達峰時間（T{U+2098}{U+2090}{U+2093} ）， 峰濃度（C{U+2098}{U+2090}{U+2093} ）以及 0 到4 小時藥時曲綫下面積 （AUC₀→₄{U+2095} ）從而比較包合物較普通薑黃素是否有優越之處。之後，用Tg2576 轉基因小鼠做短期研究，此种小鼠能過度表達β 澱粉樣蛋白，是一種被廣泛應用于老年癡呆癥相關科研的動物模型，經過連續7 日的喂食之後，對小鼠的β 樣澱粉蛋白進行觀察。進一步，將用能同時過度表達β 樣澱粉蛋白與神經纖維結（NTFs）的Tau/APP 轉基因小鼠做長達兩月的藥效學實驗，在實驗始末配以关联恐惧调件反应测试（CFC）和八臂迷宮（Radial Arm Maze）來對實驗小鼠的記憶失進行定量分析。處死小鼠之後，對β 樣澱粉蛋白與神經纖維結（NTFs）進行定量分析從而確定包合物在藥效學上的優勢。 / 結果：在包合的過程中，大部份的薑黃素被整合到包合物之中。通過傅利葉紅外圖譜和掃描電鏡照片都可以觀察到包合物與混合物的顯著不同。在藥代動力學研究中，普通薑黃素粉末的達峰時間為22 分鐘左右，而包合物是40 分鐘，同時，經過包合，峰濃度也提高了3 倍左右，藥時曲綫下面積提高了2 倍以上。在用Tg2576 進行的為期一周的短期實驗中，觀察不到包合物和普通薑黃素在β 樣澱粉蛋白清除方面有明顯差別，然後通過體內染色卻可以看到經包合物喂食的小鼠腦切片中可以觀察到更多的來自薑黃素的螢光信號。在2 個月的長期實驗中，就关联恐惧调件反应测试和八臂迷宮實驗的結果來看，可以觀察到包合物有更好延遲TAPP 小鼠記憶失過程的趨勢但無顯著性，除此之外，對處死后的小鼠腦部進行分析，其β 澱粉樣蛋白與神經纖維節的含量分析結果也和行為測試具有一致性。 / 結論：用羥丙基-β-環糊精對薑黃素進行包合確實可以通過增加薑黃素的水溶性從而提高其生物利用度，讓更多的薑黃素通過血腦屏障進入大腦進而與β 澱粉樣蛋白進行結合。然後短期實驗無法表明包合物具有β 澱粉樣蛋白清除效應。而長期實驗中行為實驗和處死後大腦分析顯示出較普通薑黃素而言包合物具有有限的優點，如果要證明這一優點確實存在，可能需要更長時間的喂食與另外劑量。 / Background: Curcumin is reported to be an effective treatment in animal models of Alzheimer’s disease (AD), possibly by inhibiting aggregation of amyloid-β peptides, which can be neurotoxic.However, curcumin is poorly soluble in water, limiting its oral bioavailability. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD), a cyclic oligosaccharide made of seven sugar molecules bound togetherin a ring has a hydrophobic exterior and a hydrophobic interior, within which curcumin can reside, thus increasing the aqueous solubility of curcumin. This study aims to solve the problem of poor water-solubility of curcumin using HP-β-CD. / Method: The inclusion complexes were formed by stirring a suspension of curcumin and HP-β-CD at a molar ratio of 1:2 at 50°C for 6 hr. Physicochemical properties, including watersolubility,morphology under scanning electron microscopy (SEM) and the Fourier Transform Infrared (FTIR) spectrum, varied between the inclusion complex and a physical mixture of the two compounds. The inclusion complex and curcumin powder were fed to Sprague Dawley rats for pharmacokinetic studies, from which blood samples were analyzed using LC/MS/MS, and relevant parameters such as T{U+2098}{U+2090}{U+2093}, C{U+2098}{U+2090}{U+2093} and AUC₀→₄{U+2095} were calculated to study the effect of HP-β-CD on the bioavailability of curcumin. To evaluate the pharmacodynamic effects, Tg2576 mice, which over express amyloid-β, were treated for 7 consecutive days with curcumin powder or inclusion complexes. Further, to examine effects of long-term treatment, Tau/APP mice, a commonly used AD model producing both amyloid-β and mutant tau proteins, were treated for 2 months. Behavior tests were conducted at the beginning and end of the long-term treatment to quantify the memory loss of the mice, and post mortem analyses, including quantification of amyloid-β plaques and neurofibrillary tangles, were performed after sacrificing the mice. / Result: The majority of curcumin was integrated into complexes. FTIR profiles and SEM photographs of complexes displayed significant differences from the physical mixture. In the pharmacokinetic study, the concentration of curcumin in the control group peaked at around 22.5 min, while that of inclusion complexes peaked around 40 min. The maximum concentration of curcumin trebled and the area under the curve from 0 to 4 hours more than doubled. For shortterm treatment in Tg2576 mice, paraffin sections stained with Thioflavin T, a dye detecting amyloid-β plaques, showed no obvious difference between mice treated with curcumin powder or complexes; however brain sections from complex-treated mice had more fluorescence signal from curcumin than did mice treated with curcumin powder. For long-term treatment, in terms of the results of contextual fear conditioning and radial arm maze, there was a trend toward inclusion complexes delaying the memory loss of Tau/APP mice more effectively than curcumin powder. Compared to curcumin powder, complexes tended to reduce the number of plaques and neurofibrillary tangles. / Conclusion: Complexation with HP-β-CD can significantly enhance curcumin bioavailability by increasing its water-solubility, allowing more curcumin to penetrate the blood brain barrier to bind to amyloid-β plaques. However, short-term treatment showed no advantage of inclusion complexes in clearing amyloid-β plaques. The results of behavior tests and post-mortem studies from the 2-month long-term treatment indicated limited superiority of inclusion complexes over curcumin powder. A longer feeding period or altered dosage or both might be necessary to enhance the effect of curcumin inclusion complexes. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Liu, Hao. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2012. / Includes bibliographical references (leaves 104-117). / Abstracts also in Chinese. / Chapter Chapter 1 --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Overview of Alzheimer’s disease --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- The pathological mechanisms of Alzheimer’s disease --- p.2 / Chapter 1.1.2 --- Anti-Alzheimer’s disease drugs --- p.3 / Chapter 1.2 --- Curcumin as a potential anti-AD agent --- p.5 / Chapter 1.2.1 --- Actions of curcumin on Aβ --- p.6 / Chapter 1.2.2 --- Anti-inflammatory and anti-oxidant activities of curcumin in AD --- p.8 / Chapter 1.2.3 --- Activities of curcumin to combat metal toxicity --- p.9 / Chapter 1.3 --- The physicochemical properties of curcumin and limitations of curcumin in clinical usage --- p.12 / Chapter 1.4 --- Cyclodextrin in pharmaceutical usage --- p.18 / Chapter 1.5 --- Aims of the study --- p.23 / Chapter Chapter 2 --- Preparation and characterization of curcumin-HP-β-CD complexes --- p.24 / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.24 / Chapter 2.2 --- Phase solubility study --- p.24 / Chapter 2.1.2 --- Preparation of solid complexes --- p.28 / Chapter 2.1.3 --- Characterization of solid complexes --- p.29 / Chapter 2.1.4 --- Previous work on the curcumin HP-β-CD inclusion complex --- p.31 / Chapter 2.2 --- Methodology --- p.33 / Chapter 2.2.1 --- Phase solubility test --- p.33 / Chapter 2.2.2 --- Preparation of curcumin-CD complexes --- p.33 / Chapter 2.2.3 --- Recovery --- p.35 / Chapter 2.2.4 --- Differential solubility --- p.36 / Chapter 2.2.5 --- SEM Studies --- p.37 / Chapter 2.2.6 --- Infrared --- p.37 / Chapter 2.3 --- Results and discussion --- p.38 / Chapter 2.3.1 --- Phase solubility analysis --- p.38 / Chapter 2.3.2 --- Recovery test --- p.40 / Chapter 2.3.3 --- Differential solubility --- p.42 / Chapter 2.3.4 --- SEM study --- p.44 / Chapter 2.3.5 --- Infrared study --- p.45 / Chapter Chapter 3 --- Staining of amyloid plaques in Tg2576 mice after oral administration of curcumin-HP-β-cyclodextrin inclusion complex --- p.47 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.47 / Chapter 3.2 --- In vitro staining of amyloid plaques by thioflavin T and curcumin --- p.49 / Chapter 3.2.1 --- Thioflavin T and curcumin specifically binding to amyloid plaques --- p.49 / Chapter 3.2.2 --- Chemicals --- p.51 / Chapter 3.2.3 --- Method --- p.51 / Chapter 3.3 --- In vivo staining of amyloid plaques after oral administration of curcumin-HP-β-CD inclusion complex --- p.53 / Chapter 3.3.1 --- Animal treatment --- p.53 / Chapter 3.3.2 --- Method --- p.54 / Chapter 3.4 --- Results and discussion --- p.56 / Chapter 3.4.1 --- In vitro staining of amyloid plaques by thioflavin T and curcumin --- p.56 / Chapter 3.4.2 --- In vivo staining of amyloid plaques by curcumin --- p.57 / Chapter 3.4.3 --- Plaque removal effects after short-term feeding --- p.58 / Chapter Chapter 4 --- Pharmacokinetic study of curcumin in Sprague-Dawley (SD) rats after oral administration of curcumin-HP-β-cyclodextrin inclusion complex --- p.61 / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.61 / Chapter 4.1.1 --- Previous pharmacokinetic study of curcumin-HP-β-CD inclusion complex --- p.61 / Chapter 4.1.2 --- Previously established LC/MS/MS methods for quantification of curcumin in SD rat plasma sample --- p.62 / Chapter 4.2 --- Development and validation of LC/MS/MS assay --- p.63 / Chapter 4.2.1 --- Chemicals --- p.63 / Chapter 4.2.2 --- Instrumentation and chromatographic conditions --- p.63 / Chapter 4.2.3 --- Preparation of standard solutions --- p.63 / Chapter 4.2.5 --- Validation of the assay method --- p.64 / Chapter 4.3 --- Pharmacokinetic profile of curcumin in SD rats --- p.65 / Chapter 4.3.1 --- Animals --- p.65 / Chapter 4.3.2 --- Animal treatment and blood sampling --- p.65 / Chapter 4.3.3 --- Plasma sample analysis --- p.65 / Chapter 4.3.4 --- Data analysis --- p.66 / Chapter 4.4 --- Result and discussion --- p.67 / Chapter 4.4.1 --- Mass spectrum --- p.67 / Chapter 4.4.2 --- Chromatography and specificity --- p.69 / Chapter 4.4.3 --- Linearity and sensitivity --- p.71 / Chapter 4.4.4 --- Method validation---Precision and accuracy --- p.71 / Chapter 4.4.5 --- Method validation---Liquid-liquid extraction recovery --- p.72 / Chapter 4.4.6 --- Pharmacokinetics parameters --- p.73 / Chapter Chapter 5 --- Long-term effects of curcumin-HP-β-CD inclusion complex on Alzheimer’s disease model mice --- p.79 / Chapter 5.1 --- Introduction --- p.79 / Chapter 5.1.1 --- Tau/APP trangenic mouse --- p.79 / Chapter 5.1.2 --- Memory --- p.80 / Chapter 5.1.3 --- The role of the hippocampus in memory --- p.81 / Chapter 5.1.4 --- Memory task contextual fear conditioning (CFC) --- p.82 / Chapter 5.1.5 --- Memory task radial arm maze (RAM) --- p.83 / Chapter 5.2 --- Methods --- p.85 / Chapter 5.2.1 --- Animal treatment --- p.85 / Chapter 5.2.2 --- Contextual fear conditioning test --- p.85 / Chapter 5.2.3 --- Radial arm maze test --- p.87 / Chapter 5.2.4 --- Post-mortem analysis amyloid plaque removal effects of the curcumin-HP-β-CD inclusion complex --- p.88 / Chapter 5.2.5 --- Post-mortem analysis neurofibrillary tangle removal effects of the curcumin-HP-β-CD inclusion complex --- p.90 / Chapter 5.3 --- Results and discussion --- p.92 / Chapter 5.3.1 --- Mortality of the mice --- p.92 / Chapter 5.3.2 --- Contextual fear conditioning test --- p.93 / Chapter 5.3.3 --- Radial arm maze (RAM) test --- p.95 / Chapter 5.3.4 --- Post-mortem analysis amyloid plaque removal effects of the curcumin-HP-β-CD inclusion complex --- p.97 / Chapter 5.3.5 --- Post-mortem analysis neurofibrillary tangle removal effects of the curcumin-HP-β-CD inclusion complex --- p.99 / Chapter Chapter 6 --- Conclusions and future perspective --- p.100 / Chapter 6.1 --- Conclusions --- p.101 / Chapter 6.2 --- Future perspective --- p.103 / References --- p.104