Kyoto University (京都大学) / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第19043号 / 農博第2121号 / 新制||農||1032 / 31994 / 京都大学大学院農学研究科地域環境科学専攻 / (主査)教授 縄田 栄治, 教授 田中 千尋, 教授 北島 宣 / 学位規則第4条第1項該当

Background: Natural products have attracted high attention due to their great contribution in drug discovery. Many natural products have shown to be effectively against different disease targets including cancer, malaria and HIV. And their structural diversity is a rich resource for the discovery of novel bioactive compounds. This thesis is to explore plant natural products for their potential in treatment of malaria and cancer diseases. Malaria is still considered as a major global health problem, affecting a large population of the world, especially in the developing countries. Effective drug discovery is still one of the main efforts to control malaria, and plant-derived compounds have played the most important role for treatment of malarial disease. In our previous work, we have evaluated more than 2,000 plant extracts against the malaria parasite Plasmodium falciparum. As a result, we discovered dozens of antiplasmodium plant leads. Bioassay guided separation of these active plant extracts led to isolation of some potent antimalarial compounds. Among them, trichothecenes, the sesquiterpenes identified from the plant Ficus fistulosa and Rhaphidophora decursiva, were found to have potent inhibitory activity against P. falciparum with IC50 values in the sub-nano molar range in our previous study (Zhang et al. 2002). However, these compounds are significant cytotoxic. In order to improve the antimalarial activity of the trichothecenes, we evaluated the antimalarial activity of dozens of trichothecenes, and based on the structure-activity relationships (SAR) analysis, we synthesized trichothecene derivatives with low cytotoxicity. On the other hand, cancer has stricken one-third of the world's population. Through our anticancer drug program to discover bioactive leads from thousands of the plant extracts, the extract of Miliusa sinensis Finet et Gagnep. (Annonaceae) was found to exhibit cytotoxic activity against a panel of cancer cell lines. Our previous bioassay-directed fractionation of the leaf, twig and flower extracts of M. sinensis has led to the discovery of a novel class of anticancer lead molecules, which we designated as miliusanes (Zhang et al, 2006). M. balansae, in the same family with M. sinensis, also contains bioactive miliusanes. We thus collected the plant materials of M. balansae to isolated additional new anticancer miliusanes. Objective: The objective of this study is to discover novel antimalarial and anticancer natural compounds from plants using different techniques in combination of extensive literature review, phytochemical separation, SAR analysis, semi-synthesis and biological activity study. Trichothecenes and miliusanes are the two major classes of the compounds, which have been extensively explored in the current thesis for their antimalarial and anticancer potential.;Methodology: There was a prior comprehensive review article entitled "Antimalarial activity of plant metabolites" by Schwikkard and Van Heerden (2002), which reported structures of those antiplasmodial active compounds and covered literatures up to the year 2000. As a continuation of their work, antimalarial compounds isolated from plants, including marine plants, which reported in the literatures from 2001 to the end of 2017 have been reviewed and organized according to their plant families. Dozens of trichothecenes have been obtained by us and explored for their SARs. Based on the SAR analysis, we designed and carried out the structure modifications of some trichothecenes. These compounds were evaluated for their antimalarial and cytotoxic activities. M. balansae, in the same genus with M. sinensis, was selected to isolate bioactive miliusanes, as well as the other active components through bioassay-guided fractionation study. Columns chromatography was used in fractionation and separation of the dichloromethane extract of M. balansae. Preparative HPLC separation and LC-MS analysis were used to speed up the isolation process. All isolates were determined for their chemical structures by spectroscopic means such as NMR and MS, and then evaluated for their anticancer potential. The isolated compounds with abundant amounts were further explored to modify their structures in order to improve their biological activities. Result: During the span of the last 17 years (2001-2017), 175 antiplasmodial compounds were discovered from plants. These active compounds were organized in our review article according to their plant families. In addition, we also included ethnobotanical information of the antimalarial plants. In order to decrease toxicity while retaining antimalarial activity of the trichothecenes, we analyzed SAR of 28 trichothecene analogues. Based on the SAR analysis, we were able to conclude that the diacetylation of C-4 and C-15, and the hydroxylation at C-3 or C-4 could significantly improve the therapeutic indices of trichothecenes. Subsequently, our synthesis of a trichothecene derivative demonstrated potent inhibitory activity against P. falciparum with an IC50 value of 10.4 nM and low toxicity against KB cells with an IC50 value of 556 nM. The separation of the dichloromethane extract of M. balansae led to the isolation of 16 new miliusanes, along with 12 known ones, and 6 flavonoids. Seven of them exhibited significant cytotoxicity against human colorectal cancer cell lines HCT116 with IC50 values in the range of 1.24 - 4.2 µM. The SAR study of the miliusanes indicated that the α,β-unsaturated ketone was the active group of but may not be the essential group responsible for the bioactivity of miliusanes. Two flavonoids that showed moderate cytotoxic activity were carried out their structure activities modification. A total of 19 derivatives have been synthesized based on the two flavonoid structures.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1757_1.pdf: 1846397 bytes, checksum: 23f6b530228369b5ee17c8696b3601a4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Foi abordada a biologia da polinização de aráceas cantarófilas nativas do estado de Pernambuco e a polinização natural da gravioleira (Annona muricata L., Annonaceae), uma frutífera largamente cultivada no estado. As áreas de estudo foram a Reserva Ecológica da Mata da Usina São José (município de Igarassu), a Estação Experimental de Itapirema (município de Goiana) e um terreno abandonado na estrada de Aldeia (município de Camaragibe). Foram encontradas três espécies cantarófilas de Araceae: Philodendron acutatum, Caladium bicolor e Taccarum ulei. Besouros do gênero Cyclocephala (Scarabaeidae, Dynastinae) foram os polinizadores exclusivos das três plantas. Os insetos apresentaram hábito crepuscular-noturno, intimamente relacionado as fases da antese. Entre as adaptações mais marcantes das inflorescências estão a emissão de odores atrativos, arcabouço floral robusto e ofertas de alimento, na forma de tecidos nutritivos e pólen. Outro destaque foi a termogênese floral, um mecanismo metabólico de aquecimento do espádice que facilita a volatização dos aromas atrativos e oferece abrigo aquecido aos besouros dentro das câmaras florais. Este aquecimento marca o início da fase feminina, que culmina em temperaturas do espádice até 14ºC acima das do ar ambiente. A. muricata também foi polinizada por uma espécie de Cyclocephala (C. vestita) e mostrou adaptações semelhantes às aráceas. Manutenção de adultos de C. vestita em cativeiro resultou na obtenção de larvas viáveis de primeiro ínstar, o que leva a crer que estratégias de manejo do polinizador são promissoras

Orientador: Gisela Ferreira / Resumo: Para que as plantas conseguissem conquistar o ambiente terrestre, foi necessário desenvolver habilidades que as tornassem capazes de sobreviver aos desafios de seu habitat, dentre as quais estão o desenvolvimento de mecanismos de tolerância à dessecação das sementes. Espécies que habitam locais com grande disponibilidade de água tendem a produzir sementes recalcitrantes e por outro lado, as espécies que habitam locais secos, como os Cerrados, tendem a produzir sementes ortodoxas, conseguindo tolerar períodos de seca sem acumular danos que prejudiquem a germinação. Dentre os sistemas que atuam no mecanismo de tolerância à dessecação estão a atividade de enzimas antioxidantes, o acúmulo de açúcares e a atividade das proteínas da embriogênese tardia (LEA). A família Annonaceae possui espécies inseridas em habitats contrastantes, como a Annona crassiflora, oriunda do Cerrado e a Annona glabra, oriunda de manguezais o que as torna interessantes para avaliar se suas sementes apresentam diferentes respostas frente à tolerância à dessecação. Para alcançar esse objetivo, sementes das duas espécies foram coletadas e avaliadas após submissão a diferentes níveis de secagem (teor inicial de água, 20%, 10% e 5%) e secagem seguida de reidratação. Foram realizados testes de germinabilidade, quantificação enzimática (superóxido dismutase (SOD) (EC 1.15.1.1), peroxidase (POD) (EC 1.11.1.7) e catalase (CAT) (EC 1.11.1.6)); de açúcares (frutose, galactose, glicose, manose, sacarose e trealose); ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In order for plants to conquer the terrestrial environment, it was necessary to develop skills that would enable them to survive the challenges of their habitat, including the development of seed desiccation tolerance mechanisms. Species that inhabit places with high water availability tend to produce recalcitrant seeds and, on the other hand, species that inhabit dry places, such as Cerrados, tend to produce orthodox seeds, being able to tolerate periods of drought without accumulating germinating damage. Systems that act on the desiccation tolerance mechanism include antioxidant enzyme activity, sugar accumulation, and late embryogenesis (LEA) protein activity. The Annonaceae family has species in contrasting habitats, such as Annona crassiflora, from the Cerrado and Annona glabra, from mangroves, which makes them interesting to evaluate if their seeds have different responses to desiccation tolerance. To achieve this goal, seeds of both species were collected and evaluated after submission to different drying levels (initial water content, 20%, 10% and 5%) and drying followed by rehydration. Germinability, enzymatic quantification (superoxide dismutase (SOD) (EC 1.15.1.1), peroxidase (POD) (EC 1.11.1.7) and catalase (CAT) (EC 1.11.1.6) tests were performed; sugars (fructose, galactose, glucose, mannose, sucrose and trehalose); determination of LEA proteins and lipoperoxide content. The results showed that A. crassiflora seeds were able to tolerate drying up to 10% water co... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Gisela Ferreira / Resumo: Além das formas clássicas de identificação de espécies e variedades realizadas por meio da diferenciação morfológica de órgãos das plantas, como as folhas, flores e frutos, contamos com diferentes técnicas de estudo que analisam aspectos moleculares e químicos. A junção de mais de uma técnica de análise taxonômica é utilizada quando apenas a diferenciação morfológica não é capaz de identificar e classificar uma espécie. A quimiossistemática, recentemente nomeada quimiofenética utiliza dados químicos, provenientes do metabolismo especializado das plantas, para auxiliar na classificação de diferentes famílias, gêneros, espécies e variedades. A espécie Annona emarginata (Schltdl.) H. Rainer, conhecida por seu valor econômico e ecológico, é popularmente chamada como araticum de terra-fria e como araticum mirim, observações de campo e diversos estudos demonstram diferenças fisiológicas e morfológicas entre os araticuns. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi utilizar caracteres morfológicos e químicos provenientes do metabolismo especializado para esclarecer se os araticuns (araticum de terra-fria e araticum mirim) podem ser tratados como variedades de Annona emarginata (Schltdl.) H. Rainer. Para tanto, foram realizadas análises morfométricas do limbo foliar e da coloração das flores e, análises do metabolismo especializado dos araticuns, considerando a) o perfil químico de alcaloides da raiz, expressado como abundância e perfil químico de alcaloides totais, e abundância de um... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In addition to the classical forms of identification of species made through the morphological differentiation of plant organs, such as leaves, flowers and fruits, we have different study techniques that analyze molecular and chemical aspects. The addition of more than one taxonomic analysis technique is used when only morphological differentiation is not able to identify and classify a species. The chemosystematics, recently named chemophenetic, uses chemical data from specialized plant metabolism to aid in the classification of different families, genera, species and varieties. The species Annona emarginata (Schltdl.) H. Rainer, known for its economic and ecological value, is popularly called araticum de terra-fria and araticum mirim. Field observations and several studies demonstrate physiological and morphological differences between them. Therefore, the purpose of this work is to use morphological and specialized chemical characters to clarify whether both araticuns (araticum de terra-fria and araticum mirim) are varieties of Annona emarginata (Schltdl.) H. Rainer. For this purpose, morphometric analysis of leaf blade and flower color analysis were performed, analysis of the specialized metabolism of araticuns were performed, considering a) chemical alkaloid profile of the root, expressed as abundance and chemical profile of total alkaloids, and abundance of an alkaloid considered a chemotaxonomic marker (liriodenine) of the Annonaceae family, b) profile of leaf volatile... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第19043号 / 農博第2121号 / 新制||農||1032(附属図書館) / 学位論文||H27||N4925(農学部図書室) / 31994 / 京都大学大学院農学研究科地域環境科学専攻 / (主査)教授 縄田 栄治, 教授 田中 千尋, 教授 北島 宣 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Nesse estudo, foram avaliados os óleos voláteis de Porcelia macrocarpa (Warm) R. E. Fries e Rollinia sericea (R. E. Fries) R. E. Fries com relação a sua composição ao longo das estações anuais e sua atividade antimicrobiana e anticolinesterase. Entre os componentes majoritários foram identificados apenas sesquiterpenos em ambas as espécies, bicicloelemeno (7%), biciclogermacreno (10%), germacreno-D (15%) e espatulenol (15%) para a P. macrocarpa e, α-muurolol (5%), Z-nerolidol (6%), bicicloelemeno (7%), germacreno-D (10%), biciclogermacreno (10%), β-cariofileno (11 %) e β-elemeno (12%) para R. sericea, não apresentando variação sazonal significativa. Os testes antimicrobianos foram realizados com bactérias Gram--positivas e negativas e com fungos filamentosos e leveduriformes. Os resultados indicaram que os óleos testados apresentam um melhor potencial antifúngico do que antibacteriano quando testado na dose de 3,125 µL/mL e não apresentaram potencial para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da doença de Alzheimer. / In this study, the volatile oils from Porcelia macrocarpa(Warm) R.E.Fr. and Rollinia sericea (R.E.Fr.) R.E.Fr. were analyzed for the seasonal variation in their chemical composition and their antimicrobial and anticholinesterase activity. The major components consisted only of sesquiterpenes in both species, bicycloelemene (7%), bicyclogermacrene (10%), germacrene-D (15%) and sphatulenol (15%) to P. macrocarpa and, α-muurolol (5%), Z-nerolidol (6%), bicycloelemene (7%), germacrene-D (10%), bicyclogermacrene (10%), β-caryophyllene (11 %) e β-elemene (12%) to R. sericea and no significant seasonal variation could be detected. The antimicrobial assays were performed with Gram-positive and negative bacteria, filamentous fungi and yeasts. The results indicated that the tested oils presented a better antifungal potential than antibacterial, when done test in the dose of 3,125 µL/mL. These oils could also not be considered as potential targets for the development of new drugs for the Alzheimer\'s treatment.

Nesse estudo, foram avaliados os óleos voláteis de Porcelia macrocarpa (Warm) R. E. Fries e Rollinia sericea (R. E. Fries) R. E. Fries com relação a sua composição ao longo das estações anuais e sua atividade antimicrobiana e anticolinesterase. Entre os componentes majoritários foram identificados apenas sesquiterpenos em ambas as espécies, bicicloelemeno (7%), biciclogermacreno (10%), germacreno-D (15%) e espatulenol (15%) para a P. macrocarpa e, α-muurolol (5%), Z-nerolidol (6%), bicicloelemeno (7%), germacreno-D (10%), biciclogermacreno (10%), β-cariofileno (11 %) e β-elemeno (12%) para R. sericea, não apresentando variação sazonal significativa. Os testes antimicrobianos foram realizados com bactérias Gram--positivas e negativas e com fungos filamentosos e leveduriformes. Os resultados indicaram que os óleos testados apresentam um melhor potencial antifúngico do que antibacteriano quando testado na dose de 3,125 µL/mL e não apresentaram potencial para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da doença de Alzheimer. / In this study, the volatile oils from Porcelia macrocarpa(Warm) R.E.Fr. and Rollinia sericea (R.E.Fr.) R.E.Fr. were analyzed for the seasonal variation in their chemical composition and their antimicrobial and anticholinesterase activity. The major components consisted only of sesquiterpenes in both species, bicycloelemene (7%), bicyclogermacrene (10%), germacrene-D (15%) and sphatulenol (15%) to P. macrocarpa and, α-muurolol (5%), Z-nerolidol (6%), bicycloelemene (7%), germacrene-D (10%), bicyclogermacrene (10%), β-caryophyllene (11 %) e β-elemene (12%) to R. sericea and no significant seasonal variation could be detected. The antimicrobial assays were performed with Gram-positive and negative bacteria, filamentous fungi and yeasts. The results indicated that the tested oils presented a better antifungal potential than antibacterial, when done test in the dose of 3,125 µL/mL. These oils could also not be considered as potential targets for the development of new drugs for the Alzheimer\'s treatment.

The presente work describes the results obtained from the phytochemical studies bioguided of crude extracts of the bark of A. salzmannii, a species belonging to the Annonaceae family, front to tests of antioxidant, antimicrobial, and insecticide activities against larvae of the mosquito Aedes aegypti. From the hexane extract were isolated five compounds, been three sesquiterpenes (caryophyllene oxide, spathulenol, and selin-11-en-4a-ol); and two steroids (stigmast-4-en-3-one and - sitosterol). From the chloroform alkaloidal fraction of the methanolic extract were isolated seven alkaloids: liriodenine, 10-methoxyliriodenine, anonaine, asimilobine, reticuline, cleistopholine, and a mixture of alkaloids anonaine and xylopine. The assay of antioxidant activity revealed that the methanol extract (3583.02 μmol of TE g-1) and its fractions, chloroform alkaloidal fraction (5291.77 μmol of TE g-1) and chloroform neutral fraction (2047.54 μmol of TE g-1) showed significant antioxidant activity, mainly the chloroform alkaloidal fraction. Among the alkaloids isolated and tested, asimilobine was the most active of them with antioxidant activity of 2.09 TE relative. For antimicrobial assay, the best results were observed for methanol extract and chloroform alkaloidal fraction against Staphylococcus aureus (ATCC14458), Escherichia coli (ATCC 10799), Candida tropicalis (ATCC 157), and C. dubliniensis (ATCC 777). Among the alkaloids isolated and tested, all showed significant results with MIC values between 25-100 mg.mL-1, mainly the alkaloids anonaine, asimilobine, and liriodenine against Staphylococcus aureus penicilinase- (8-), S. epidermidis (ATCC 12228), S. epidermidis (6ep), and Candida dubliniensis (ATCC 778157). To the test of larvicidal activity, only the hexane extract and the fractions of methanol extract showed activity below 700 mg.mL-1. The caryophyllene oxide showed activity of 167 mg.mL-1. The results obtained confirm that A. salzmannii is a typical species of the Annonaceae family, and a promising source of biologically active compounds. / O presente trabalho descreve os resultados obtidos a partir do estudo fitoquímico biomonitorado dos extratos brutos das cascas de Annona salzmannii, uma espécie pertencente a família Annonaceae, frente a testes de atividades antioxidante, antimicrobiana e larvicida contra o Aedes aegypti. Do extrato hexânico foram isoladas cinco substâncias, sendo três sesquiterpenos (óxido de cariofileno, espatulenol e selin-11-en-4a-ol); e dois esteróides (estigmast-4-en-3-ona e - sitosterol). Da fração clorofórmica alcalóidica, proveninente do extrato metanólico, isolou-se sete alcalóides: liriodenina, 10-metoxiliriodenina, anonaina, asimilobina, reticulina, cleistofolina e uma mistura dos alcalóides anonaina e xylopina. O ensaio de atividade antioxidante revelou que o extrato metanólico (3583,02 μmol de TE g-1) e suas respectivas frações, fração clorofórmica alcalóidica (5291,77 μmol de TE g-1) e fração clorofórmica neutra (2047,54 μmol de TE g-1) apresentaram expressiva atividade antioxidante, com destaque para a fração clorofórmica alcaloídica. Dentre os alcalóides isolados e testados, asimilobina foi o mais ativo com atividade antioxidante de 2,09 TE relativo. Para o ensaio de atividade antimicrobiana, os melhores resultados foram observados para o extrato metanólico e a fração clorofórmica alcaloídica contra Staphylococcus aureus (ATCC14458), Escherichia coli (ATCC 10799), Candida tropicalis (ATCC 157) e C. dubliniensis (ATCC 777). Dentre os alcalóides isolados e testados, todos apresentaram resultados significativos com valores de CIM entre 25-100 mg.mL-1, com destaque para os alcalóides anonaina, asimilobina e liriodenina frente a Staphylococcus aureus penicilinase-(8-), S. epidermidis (ATCC 12228), S. epidermidis (6ep) e Candida dubliniensis (ATCC 778157). Para o teste de atividade larvicida, apenas o extrato hexânico e as frações provenientes do extrato metanólico apresentaram atividade abaixo de 700 mg.mL-1. O óxido de cariofileno apresentou atividade de 167 mg.mL-1. Os resultados obtidos confirmam que A. salzmannii é quimicamente uma espécie típica da família Annonaceae, além de uma fonte promissora de substâncias biologicamente ativas.

In the Amazon region, Xylopia species are used to popular medicine, pharmacobotany and to produce wood and fibers. However, the knowledge about vegetative organ anatomy is not enough. Therefore, this work purposed to know leaf and wood anatomy of Xylopia henthamii R. E Fries and Xylopia nítida Dunal, and it is contributing to identify their. For this study usual techniques were used in plant and wood anatomy. The leaf anatomic characteristics is common like dorsiventral mesophyll, hipostomatic leaf, paracytic stomata, simple filiform trichomes, collateral vascular bundles, secretory cavities scattered in mesophyll and petiole, druse idioblastic in petiole and leaf vein is brochidodromous. But they were different about shape of epidermal cell walls in abaxial surface, papillose abaxial surface, invaginated adaxial surface of petiole, vascular bundles and chlorenchyma or fundamental parenchyma in leaf margin, invaginated stomata, striate cuticle and marginal vein. The wood anatomic characteristics presented uniformly in macro and microscopic levei with little distinct growth rings, multiples vessels of two to five, apotracheal axial parenchyma in thin lines and scalariform, simple perforated plates, alternate intervessel pits, rays were homogeneous, mainly three-seriate, with procumbents cells. The main differences between them were length and vessels tangencial diameter. It was concluded that leaf anatomy is efficient to taxonomy, but wood anatomy not, because the homogeneously between that species. / Espécies do gênero Xylopia, são usadas na região amazônica, na medicina popular, na farmacobotânica, no aproveitamento de madeira e das fibras. Contudo, o conhecimento sobre a anatomia dos órgãos vegetativos, não contemplam todas as espécies do gênero. Diante disso, visando o conhecimento científico das espécies de Xylopia, o presente trabalho teve como objetivo conhecer as estruturas internas das folhas e da madeira das espécies Xylopia henthamii R. E Fries e Xylopia nítida Dunal, contribuindo dessa maneira para a identificação das mesmas. Para a realização do trabalho, foram empregadas as técnicas usuais em anatomia vegetal e da madeira. Com relação à caracterização anatômica das folhas as espécies apresentaram características em comum como dorsiventralidade, lâmina hipoestomática, estômatos paracíticos, tricomas simples filiformes, feixes vasculares colaterais, cavidades secretoras dispersas no mesofilo e pecíolo, idioblastos em drusas no pecíolo e o padrão de venação foliar do tipo broquidódromo. Entretanto as espécies foram separadas com relação ao contorno das paredes anticlinais e periclinais na superfície adaxial, superfície abaxial papilosa, face adaxial do pecíolo invaginada, margem apresentando feixes no bordo foliar, margem terminando com parênquima paliçádico ou parênquima fundamental, estômatos posicionados abaixo do nível das células epidérmicas, estriamento cuticular e presença da nervura marginal. Em relação à caracterização anatômica da madeira as mesmas apresentaram grande uniformidade em nível macro e microscópico como camadas de crescimento poucos distintas, arranjo dos vasos múltiplos de dois a cinco, parênquima axial apotraqueal em linhas finas e escalariforme, placas de perfurações simples, pontuações intervasculares alternas, raios homogêneos, predominantemente trisseriados, constituídos de células procumbentes. As principais diferenças entre as mesmas estão relacionadas ao comprimento e ao diâmetro tangencial dos elementos de vasos ao diâmetro do lume do tecido fibroso. Com base nos resultados, conclui-se que tanto a anatomia foliar quanto a anatomia do lenho das espécies selecionadas neste trabalho foram eficientes para a separação dos taxa, mesmo as espécies apresentarem em sua organização estrutural interna grande homogeneidade entre si.