La androgénesis es un proceso experimental que permite la obtención de líneas puras doble haploides a través de embriogénesis o callogénesis inducida partiendo, en la mayoría de los casos, del gametófito masculino (polen bicelular joven) o en la mayoría de los casos, su precursor, la microspora. Desde una perspectiva biotecnológica, esta posibilidad adquiere gran relevancia, pues las líneas puras son la base del proceso de obtención de semilla híbrida, y este proceso permite reducir a una sola generación, las 8 o 9 generalmente necesarias en el caso de utilizar métodos de mejora genética clásica para obtener las líneas puras. En la presente Tesis Doctoral se aborda el estudio de la inducción de androgénesis aplicando en paralelo dos abordajes: uno básico, mediante el estudio de factores que influyen y cambios que tienen lugar en la microspora al ser inducida, y uno aplicado, orientado a mejorar la eficiencia de inducción en especies recalcitrantes. El estudio se lleva a cabo en tres especies: la colza (Brassica napus), utilizada como sistema modelo para el estudio básico, y dos recalcitrantes, tomate (Solanum Lycopersicum), y berenjena (Solanum melongena). En resumen, mediante los estudios planteados en esta Tesis, se pretende conocer mejor algunos de los procesos de la androgénesis mediante su estudio en especies modelo como la colza, y recalcitrantes como el tomate. Además se pretende mejorar la eficiencia de la obtención de doble haploides en berenjena, desarrollando un método eficiente de cultivo de microsporas aisladas de berenjena. / Corral Martínez, P. (2013). Obtención de doble haploides en especies de interés agronómico: análisis de agentes y mecanismos celulares implicados en la inducción androgénica en berenjena, colza y tomate [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31643 / TESIS

Submitted by Verena Pereira (verenagoncalves@uefs.br) on 2018-07-03T23:23:34Z No. of bitstreams: 1 TESE 2018 - Doutorado RGV_UEFS - Carla Maria de Jesus Silva.pdf: 1687907 bytes, checksum: 3e9fe14e189c00f951079ca2a71e3c66 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-03T23:23:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE 2018 - Doutorado RGV_UEFS - Carla Maria de Jesus Silva.pdf: 1687907 bytes, checksum: 3e9fe14e189c00f951079ca2a71e3c66 (MD5) Previous issue date: 2018-03-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The watermelon (Citrullus lanatus) is a very important vegetable for a region of Northeast Brazil due to its adaptation as the natural conditions and the good characteristics of the fruit that are obtained. The aims of the current study are to assess watermelon genotype responses to calluses in anthers by using growth and temperature regulators, and to induce polyploidy through colchicine use (at different concentrations), exposure time, mechanical scarification and application methods. Anthers of Smile and Sugar Baby lines were inoculated in MS medium at different concentrations of 2.4-D or of BAP with 2.4-D, in combination with the pre-treatment (low temperature). Crimson Sweet cultivar seedlings were treated with different colchicine concentrations at two different times, with and without scarification, in order to induce polyploidy. Line LDRO was subjected to different colchicine concentrations at two different times and application methods: a) direct in the seed method (with, and without, scarification) (DSM, WE and WOE), b) Radicle emission method (ERM), c) Hypocotyl and root insertion point method (HRIM), d) At the apex of the seedling method (ASM) and e) Inverted hypocotyl method (IHM). Crimson Sweet flower buds were subjected to colchicine, at two different times, in order to induce polyploidy. Results have shown that 2.4-D often induced callus formation in both lines, but BAP/2.4-D interaction and pre-treatment did not increase the induction frequency. Crimson Sweet showed higher induction rate at 0.2% colchicine for 48h, WE. Line LDRO presented plants with tetraploid cells at 0.2% colchicine for 24 and 48h. The method 0.2% DSM, WE and WOE also generated plants with tetraploid cells. The diameter of treated pollen grains in flower buds have increased; the higher rate of non-reduced gametes induction was 16.07% and flower bud diameter (1.5mm) was estimated as adequate for induction / A melancia (Citrullus lanatus) ? uma hortali?a muito importante para a regi?o Nordeste do Brasil por sua adapta??o as condi??es clim?ticas e pelas boas caracter?sticas de fruto que se obt?m. Os objetivos desse trabalho foram avaliar as respostas de gen?tipos de melancia quanto ? indu??o de calos em anteras utilizando reguladores de crescimento e temperatura; e induzir a poliploidia mediante o uso da colchicina em diferentes concentra??es, tempos de exposi??o, escarifica??o mec?nica e m?todos de aplica??o. Anteras das linhagens de Smile e Sugar Baby foram inoculadas em meio MS sob diferentes concentra??es de 2,4-D ou BAP com 2,4-D, associado ao pr?-tratamento (baixa temperatura). Para indu??o de poliploidia, sementes da cultivar Crimson Sweet foram tratadas com diferentes concentra??es de colchicina, em dois tempos, com e sem escarifica??o. Para a linhagem LDRO, utilizaram-se diferentes concentra??es de colchicina em dois tempos e m?todos de aplica??o: a) M?todo direto na semente (com escarifica??o e sem escarifica??o) (MDS, CE e SE), b) M?todo da semente com emiss?o da rad?cula (MER), c) M?todo no ponto de inser??o do hipoc?tilo e raiz (MIHR), d) M?todo no ?pice da pl?ntula (MAP) e e) M?todo do hipoc?tilo invertido (MHI). Na indu??o de poliploidia em bot?es florais de Crimson Sweet utilizou-se colchicina em dois tempos. Os resultados mostraram que o 2,4-D induziu a maior frequ?ncia de calos nas duas linhagens, a intera??o BAP com 2,4-D e o pr?-tratamento, n?o aumentaram a frequ?ncia de indu??o. Para Crimson Sweet, o maior percentual de indu??o foi obtido com colchicina a 0,2% por 48 h, SE. Para LDRO, observou-se uma frequ?ncia de plantas com c?lulas tetraploides com colchicina a 0,2% por 24 h e 48 h. Nos m?todos 0,2% MDS CE e MHI observou-se tamb?m plantas com c?lulas tetraploides. Em bot?es florais, o di?metro dos gr?os de p?len tratados aumentou; o maior percentual de indu??o de gametas n?o reduzidos foi de 16,07% e; o di?metro em torno de 1,5 mm do bot?o floral foi estimado como adequado para indu??o

Tesis por compendio / Androgenesis induction is an experimental procedure by which microspores are diverted from their original gametophytic pathway towards embryogenesis by applying specific stresses in vitro. It allows for the production of doubled haploid (DH) pure lines through anther culture or isolated microspore culture followed by chromosome doubling. DH technology is interesting for both basic research and plant breeding. In this Thesis, we studied microspore embryogenesis with two parallel approaches: (I) an applied study directed to the development of the first eggplant (Solanum melongena) highly embryogenic line and the improvement of the efficiency of eggplant microspore cultures; and (II) a fundamental research study focused on the relationship between microspore embryogenesis ability, intracellular Ca2+ levels and the dynamics of callose and cellulose deposition for cell wall formation in microspore-derived structures, using rapeseed (Brassica napus) as a model species. As an applied research, we developed and evaluated an eggplant DH population from a commercial hybrid, and identified and characterized the first eggplant highly androgenic DH line (DH36), which may be used to facilitate the study of eggplant androgenesis and for both basic and applied research. In addition, we evaluated different factors involved in microspore embryogenesis induction efficiency in eggplant and optimized the regeneration protocol for DH production via microspore culture. Together, the applied research on eggplant microspore embryogenesis made in this Thesis resulted in the most efficient protocol existing to date for DH production in eggplant. As a fundamental research, we studied the dynamics of Ca2+ during in vivo microsporogenesis and microgametogenesis, as well as during the first stages of in vitro-induced microspore embryogenesis, establishing a link between microspore embryogenesis and changes in Ca2+ levels and subcellular distribution. In addition, we studied the deposition of callose and cellulose during the first stages of microspore embryogenesis and demonstrated that the abnormally increased callose deposition and the inhibition of cellulose deposition observed in embryogenic microspores is most likely caused by a transient increase in the intracellular Ca2+ levels that occurs right after microspore induction. We also found that this particular dynamics of callose and cellulose deposition is related to microspore embryogenesis ability, and is essential for proper progression and success of microspore embryogenesis. In summary, the research made in this Thesis helps to further understand the basis underlying microspore embryogenesis and cell totipotency, and to apply the powerful DH technology to an economically important crop such as eggplant. / La inducción de androgénesis es un procedimiento experimental en el cual las microsporas se desvían de su vía gametofítica original hacia embriogénesis, mediante la aplicación de estreses específicos in vitro. Este fenómeno permite la producción de líneas puras dobles haploides (DH) mediante cultivo de anteras o cultivo de microsporas aisladas seguidos de duplicación cromosómica. La tecnología DH es interesante tanto para la investigación básica como para su aplicación a la mejora genética vegetal. En esta Tesis se estudia la embriogénesis de microsporas y la obtención de DHs con dos enfoques paralelos: (I) un estudio aplicado dirigido al desarrollo de la primera línea de berenjena (Solanum melongena) con alta respuesta androgénica y a la mejora de la eficiencia de los cultivos de microsporas de berenjena; y (II) un estudio de investigación básica centrado en la relación entre la habilidad para la embriogénesis de microsporas, los niveles intracelulares de Ca2+ y la dinámica de la deposición de calosa y celulosa para la formación de paredes celulares en estructuras derivadas de microsporas, utilizando como especie modelo la colza (Brassica napus). Como investigación aplicada, se desarrolló y evaluó una población DH de berenjena a partir de un híbrido comercial, y se identificó y caracterizó la primera línea DH altamente androgénica de berenjena (DH36), que puede usarse para facilitar el estudio de la androgénesis en berenjena y para otros estudios aplicados o básicos. Además, se evaluaron diferentes factores implicados en la eficiencia de la inducción de embriogénesis de microsporas en berenjena, y se optimizó el protocolo de regeneración para la producción de DH mediante cultivo de microsporas. En conjunto, la investigación aplicada sobre la embriogénesis de microsporas realizada en esta Tesis proporciona el protocolo más eficiente existente hasta la fecha para la producción de DH en berenjena. Como investigación fundamental, se estudió la dinámica del Ca2+ durante la microsporogénesis y la microgametogénesis in vivo, así como durante las primeras etapas de la embriogénesis de microsporas inducida in vitro, y se estableció un vínculo entre la embriogénesis de microsporas y los cambios en el nivel y distribución intracelular de Ca2+. Además, se estudió la deposición de calosa y celulosa durante las primeras etapas de la embriogénesis de microsporas y se demostró que la excesiva deposición de calosa y la inhibición de la deposición de celulosa, exclusivas de las microsporas embriogénicas, están causadas por el aumento transitorio de Ca2+ intracelular que se produce justo tras la inducción. Hemos demostrado que esta particular dinámica de la deposición de calosa y celulosa está relacionada con la capacidad androgénica, y que es fundamental para la correcta progresión y éxito de la embriogénesis de microsporas. En resumen, la investigación realizada en esta Tesis ayuda a comprender mejor la base de la embriogénesis de microsporas y de la totipotencia celular, y a aplicar la potente tecnología DH a un cultivo económicamente importante como es la berenjena. / La inducció d'androgènesi és un procediment experimental en el qual les microspores es desvien de la seua via gametofítica original cap a un nou destí embriogènic, mitjançant l'aplicació d'estressos específics in vitro. Aquest fenomen permet la producció de línies pures dobles haploides (DH) mitjançant cultiu d'anteres o cultiu de microsporas aïllades seguits de duplicació cromosòmica. La tecnologia DH és interessant tant per a la recerca bàsica com per a la seua aplicació a la millora genètica vegetal. En aquesta Tesi s'estudia l'embriogènesi de microspores i l'obtenció de DHs amb dos enfocaments paral·lels: (I) un estudi aplicat dirigit al desenvolupament de la primera línia d'albergina (Solanum melongena) amb alta resposta androgènica i a la millora de l'eficiència dels cultius de microspores d'albergina; i (II) un estudi de recerca bàsica centrat en la relació entre la capacitat per a l'embriogènesi de microspores, els nivells intracel·lulars de Ca2+ i la dinàmica de la deposició de cal·losa i cel·lulosa per a la formació de parets cel·lulars en estructures derivades de microsporas, utilitzant com a espècie model la colza (Brassica napus). Com a recerca aplicada, es va desenvolupar i avaluar una població DH d'albergina a partir d'un híbrid comercial, i es va identificar i caracteritzar la primera línia DH altament androgènica d'albergina (DH36), que pot usar-se per a facilitar l'estudi de l'androgènesi en albergina i per a altres estudis aplicats o bàsics. A més, es van avaluar diferents factors implicats en l'eficiència de la inducció d'embriogènesi de microspores en albergina, i es va optimitzar el protocol de regeneració per a la producció de DH mitjançant cultiu de microspores. En conjunt, la recerca aplicada sobre l'embriogènesi de microspores realitzada en aquesta Tesi proporciona el protocol més eficient existent fins avui per a la producció de DH en albergina. Com a recerca fonamental, es va estudiar la dinàmica del Ca2+ durant la microsporogènesi i la microgametogènesi in vivo, així com durant les primeres etapes de l'embriogènesi de microspores induïda in vitro, i es va establir un vincle entre l'embriogènesi de microspores i els canvis en el nivell i distribució intracel·lular de Ca2+. A més, es va estudiar la deposició de cal·losa i cel·lulosa durant les primeres etapes de l'embriogènesi de microspores i es va demostrar que l'excessiva deposició de cal·losa i la inhibició de la deposició de cel·lulosa, exclusives de les microspores embriogèniques, estan causades per l'increment transitori del Ca2+ intracel·lular que es produeix just després de la inducció. Hem demostrat que aquesta particular dinàmica de la deposició de cal·losa i cel·lulosa està relacionada amb la capacitat androgènica, i que és fonamental per a la correcta progressió i èxit de l'embriogènesi de microspores. En resum, la recerca realitzada en aquesta Tesi ajuda a comprendre millor la base de l'embriogènesi de microspores i de la totipotència cel·lular, i a aplicar la potent tecnologia DH a un cultiu econòmicament important com és l'albergina. / Rivas Sendra, A. (2017). Calcium and cell wall dynamics during microspore embryogenesis and double haploid production in rapeseed and eggplant [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/85548 / TESIS / Compendio

La embriogénesis derivada de microsporas es la ruta androgénica más empleada para la obtención de individuos dobles haploides (DHs), 100% homocigotos, que pueden ser utilizados como líneas puras. Este proceso es una alternativa biotecnológica a los programas clásicos de mejora que permite reducir el tiempo y los recursos necesarios para la obtención de híbridos comerciales. Gracias a los avances realizados en los últimos 30 años, hay determinadas especies que pueden ser consideradas modelo debido a la elevada eficiencia que presentan en la obtención de individuos DHs. Sin embargo, aun existen muchas especies, interesantes desde un punto de vista agrícola y comercial, que permanecen recalcitrantes a la embriogénesis de microsporas. Debido al elevado potencial biotecnológico de esta técnica es fundamental mejorar el proceso en este tipo de especies en las que la androgénesis no está puesta a punto. Para ello es esencial realizar estudios en los que se combine un enfoque más aplicado, tratando de conseguir las condiciones experimentales más adecuadas, y en paralelo, un enfoque más básico, orientado a investigar las bases de la reprogramación de las microsporas y de este modo, tener una mayor posibilidad de influir en el proceso. En esta Tesis se han empleado ambos enfoques, empleando la colza como especie modelo y el pimiento como especie recalcitrante a la androgénesis. En pimiento, el estudio de factores clave para la inducción de la androgénesis nos ha permitido optimizar un protocolo de cultivo de anteras aplicable a diferentes genotipos. Proponemos el uso combinado de la relación sépalo/yema (80-90% de la yema cubierta por los sépalos) junto con la pigmentación de las anteras (extremo apical morado) como marcadores morfológicos fiables y fáciles de medir para determinar qué yemas y anteras contienen las microsporas en su estadio idóneo para la inducción. También se ha demostrado que la presencia de callos de origen somático es más dependiente de las condiciones de cultivo que del genotipo, lo cual nos ha permitido obtener un protocolo que reduzca la presencia de estos callos e incremente el número de embriones obtenidos. En los estudios de investigación básica realizados con colza, el uso de la fijación por alta presión combinada con la criosustitución ha permitido observar cambios ultraestructurales en las microsporas inducidas nunca antes descritos. Se ha estudiado la arquitectura y composición de las paredes celulares que se forman de novo en las microsporas embriogénicas y se han observado paredes celulares incompletas y deformes que podrían estar favoreciendo fenómenos de fusión nuclear, que a su vez da lugar a la duplicación cromosómica típica de los DHs. Se ha comprobado que estas paredes presentan elevados niveles de calosa y ausencia de celulosa. También se ha estudiado la arquitectura de diferentes orgánulos presentes en las microsporas recién inducidas y se ha demostrado que los plastidios presentes en las microsporas embriogénicas actúan como plastolisomas. Estos estudios ultraestructurales han servido para extraer dos nuevos marcadores de embriogénesis: la presencia de calosa en las nuevas paredes y en las placas celulares en formación y plastolisomas que posiblemente actúen como parte de un mecanismo más general de limpieza del citoplasma, en paralelo a la reprogramación. / Parra Vega, V. (2015). Aspectos básicos y aplicados de la inducción de embriogénesis en microsporas de pimiento y colza [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48518 / TESIS