Resumo não disponível.

A meningite meningocócica permanece como importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Extratos purificados de LOS de Neisseria meningitidis foram utilizados em um ensaio de ELISA a fim de detectar a especificidade dos anticorpos anti-LOS produzidos por 41 pacientes com doença meningocócica. Durante o período de convalescença, 100% dos pacientes apresentaram aumento da concentração sérica de IgG anti-LOS (L1, L2, L3,7, L6, L8 e L10) em no mínimo três vezes a concentração verificada nos soros coletados durante a fase aguda. O maior aumento foi de oito vezes para IgG anti-L3,7 adicionada de resíduo de ácido siálico. Portadores de Neisseria meningitidis e Neisseria lactâmica na nasofaringe não produziram anticorpos anti-LOS. Através de um ensaio ELISA de Inibição, foi possível verificar a especificidade dos anticorpos anti-LOS, exceto para os anticorpos IgG anti-L10, que apresentaram reação cruzada com outros tipos antigênicos de LOS como L2, L3,7 e L6, revelando-se um importante candidato a antígeno vacinal. / Meningococcal meningitis remains as an important cause of morbidity and mortality all over the world. Purified LOS extracts were used in an ELISA assay to verify the specificity of the antibodies produced due to meningococcal disease. All 41 convalescent sera collected from patients had at lowest a three-folder increase of anti-LOS IgG concentrations when compared with acute sera. A higher increase of eight fold was seen to anti-L3,7 IgG specific antibodies. Safe carries of Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica had no detectable specific anti-LOS antibodies. In an Inhibition ELISA assay, except for anti-L10 IgG, antibodies against L1, L2, L3,7, L6 and L8 immunotypes were specific. Anti-L10 antibodies cross-reacted with L2, L3,7 and L6 epitopes.

Mestre -- Escola Nacional de Saude Publica, Rio de Janeiro, 2002.

Mestre -- Sao Paulo (Estado). Secretaria da Saude. Coordenacao dos Institutos de Pesquisa. Programa de Pos-Graduacao em Ciencias, Sao Paulo, 2004.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000438287-Texto+Completo-0.pdf: 659033 bytes, checksum: 74536bb270173b92a486ff2c17575495 (MD5) Previous issue date: 2012 / IgG anti-dsDNA antibodies are associated to lupus nephritis. Recent data suggest that IgM isotype is nephroprotector. We evaluated the frequency of IgG anti-dsDNA in patients with Systemic lupus erythemathosus (SLE) and its relation between IgG/IgM proportion and clinical manifestations of the disease. This transversal study included 137 SLE patients according to traditional criteria (92. 5% female, 79. 5% Caucasian) and 58 SLE individual (93. 1% female, 81% Caucasian) selected by positivity for IgG anti-dsDNA. IgG and IgM anti-dsDNA antibodies were detected by Chrithidiae luciliae indirect immunofluorescence with cut point 1/10 dilution. The presence of IgG anti-dsDNA was associated to the presence of hemolytic anemia, leukopenia/lymphopenia and Complement depletion (p<0. 001). Of the 58 patients positive for IgG anti-dsDNA 15 were also positive for IgM anti-dsDNA. The group presenting both isotypes showed significant less frequency of active urinary sediment when compared to isolated IgG anti-dsDNA (6. 7% versus 34. 9%, p=0. 046). IgG/IgM proportion distribution evidenced a trend of higher medians in the presence of arthritis and leukopenia/lymphopenia [4 (2-8) versus 1 (1-2), p=0. 070 and 4 (3-8) versus 1 (1-4), p=0. 066, respectively]. Summarizing, the frequency of IG anti-dsDNA was relevant in our casuistic. Positive subpopulation for both IgG/IgM isotypes anti-dsDNA was less willing to urinary sediment alterations than IgG anti-dsDNA isolated population. These data suggest a distinct biologic behavior for IgM anti-dsDNA. / Anticorpos IgG anti-dsDNA se associam à ocorrência de nefrite lúpica. Relatos recentes sugerem que o isotipo IgM anti-dsDNA seja nefroprotetor. Avaliamos frequência de IgG anti-dsDNA em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES), e averiguamos a relação entre proporção IgG/IgM anti-dsDNA e manifestações clínicas da doença. O estudo, transversal, incluiu 137 pacientes com LES de acordo com os critérios tradicionais (92,5% mulheres, 79,5% raça branca) e uma população de 58 casos de LES (93,1% mulheres, 81% raça branca) selecionados por positividade para IgG anti-dsDNA. Anticorpos IgG e IgM anti-dsDNA foram detectados por imunofluorescência indireta com Crithidia luciliae, com ponto de corte na diluição 1/10. A presença de IgG anti-dsDNA se associou à presença de anemia hemolítica, leucolinfopenia e depleção de Complemento (p<0, 001). Dos 58 pacientes com teste positivo para IgG anti-dsDNA, 15 foram também positivos para o isotipo IgM. O grupo com ambos os isotipos teve frequência significativamente menor de sedimento urinário ativo quando comparado ao grupo com IgG anti-dsDNA isolado (6,7% versus 34,9%, p=0, 046). A distribuição da proporção IgG/IgM anti-dsDNA evidenciou tendência de medianas mais elevadas na presença de artrite e leucolinfopenia [4 (2-8) versus 1 (1-2), p=0, 070 e 4 (3-8) versus 1 (1-4), p=0, 066, respectivamente]. Em suma, a frequência de IgG anti-dsDNA foi relevante em nossa casuística. A subpopulação positiva para ambos IgG e IgM anti-dsDNA foi menos propensa a alterações de sedimento urinário do que aquela com IgG anti-dsDNA isolado. Estes dados sugerem um comportamento biológico distinto para o isotipo IgM anti-dsDNA.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000383317-Texto+Completo-0.pdf: 533302 bytes, checksum: d1c54ea34e0bdbcdd31f54bbce98b274 (MD5) Previous issue date: 2006 / Theoretical basis – Severe obstructive carotid artery disease is related to atherosclerosis (ATC). Mechanisms of inflammation and self-immunity may have influence on the occurrence of ATC. This includes antiphospholipid antibodies (AAP), antiphospholipid syndrome markers (APS) and antibodies against heat shock proteins (anti-Hsp). A beta 2-glycoprotein I (beta2-gpI) and the 60 and 65 kilodaltons (kDa) Hsp are molecules present in atherosclerotic plaques. This is the first report including research on IgA anticardiolipin (aCL), IgG/IgM/IgA anti-beta2- glycoprotein I and anti-HSP in severe obstructive carotid artery disease cases. Objective – To determine the association, if any, between the presence of AAP/anti-Hsp and the occurrence of severe obstructive carotid artery disease. Patients and Methods – In our control case study the cases consisted of patients with either symptomatic or asymptomatic severe obstructive carotid artery disease. The presence of the disease was determined by anamnesis, physical examination, MR angiography (MRA) and carotid endarterectomy. The control group consisted of patients admitted to orthopedic wards. Both groups were assessed for risk factors: age, sex, race, hypertension, smoking, diabetes mellitus (DM) and hypercholesterolemy. IgG/IgM/IgA aCL, IgG/IgM/IgA anti-beta2-gpI, IgG anti-Hsp 60 kDa recombinant human and IgG anti-Hsp 65 kDa of Mycobacterium bovis antibodies were detected by enzymatic test. In order to assess the degree of association between antibodies with severe obstructive carotid artery disease, (odds ratios, OR) were calculated with their respective confidence intervals (IC 95%).Logistic regression was used to adjust the confusion factors. Results – 57 case patients and 93 control patients were studied and the average age was 66 + 8. 7 years for case patients and 47. 5 + 18. 8 years for control patients (P<0. 001). There was a predominance of black race individuals in the control group. Most case patients were male individuals (61. 4%), but there were less male individuals (49. 5%) among control patients. The presence of hypertension (OR=21. 0; IC 95% 8. 0 to 57. 1; P<0. 001) and hypercholesterolemy (OR=25. 5; IC 95% 9. 5 to 70. 9; P<0,001) determined the strongest associations between the risk factors already known and severe obstructive carotid artery disease. IgA antibeta2-gpI antibodies were detected in 33. 3% of the case patients and in 9. 7% of the control patients (OR adjusted 4. 7; IC 95% 1. 0 to 23. 7; P=0. 06). The frequency of other non-tested antibodies was not significantly different in cases and controls. Conclusion – No association was found between the presence of aCL, IgG/IgM antibeta2-gpI, anti-Hsp and the occurrence of severe obstructive carotid artery disease. The presence of IgA antibeta2-gpI antibodies was found to be an independent risk factor for severe obstructive carotid artery disease (OR adjusted 4. 7), although with borderline significance (P=0,06). The association of IgA antibeta2-gpI with severe obstructive carotid artery disease may be one of the links between auto-immunity and carotid. / Base teórica - A doença obstrutiva severa de artérias carótidas (DOSAC) está relacionada à aterosclerose (ATC). Mecanismos de inflamação e auto-imunidade podem influenciar o deflagramento da ATC. Neste contexto, incluem-se anticorpos antifosfolípides (AAF), marcadores da síndrome antifosfolipídica (SAF) e anticorpos contra proteínas de choque térmico (anti-Hsp). A beta2-glicoproteína I (beta2-gpI) e as Hsp de 60 e 65 kilodaltons (kDa) são moléculas encontradas em ateromas. O relato é o primeiro a incluir a pesquisa de IgA anticardiolipina (aCL), IgG/IgM/IgA antibeta2-gpI e anti-HSP em casuísticas de DOSAC. Objetivo - Avaliar a associação, se alguma, entre ocorrência de AAF/anti-Hsp e DOSAC. Pacientes e Métodos - Neste estudo de caso-controle, os casos consistiram de uma população de pacientes com DOSAC (sintomática ou assintomática). A presença de DOSAC foi definida pela anamnese, exame físico, angiografia por ressonância nuclear magnética (ARM) e endarterectomia de carótida. Os controles foram selecionados de enfermarias de ortopedia. Ambos os grupos foram avaliados quanto aos fatores de risco: idade, sexo, raça, hipertensão arterial sistêmica (HAS), tabagismo, diabete mellitus (DM) e hipercolesterolemia. Anticorpos IgG/IgM/IgA aCL, IgG/IgM/IgA antibeta2-gpI, IgG anti-Hsp 60 kDa humana recombinante e IgG anti-Hsp 65 kDa de Mycobacterium bovis foram detectados através de ensaio enzimático. Para estimar o grau de associação dos anticorpos com DOSAC, razão de chances (odds ratios, OR) foram calculadas com seus respectivos IC 95%.Regressão logística foi utilizada para ajuste de fatores de confusão. Resultados - Entre os 57 casos e 93 controles estudados, a média de idade foi de 66 + 8,7 anos nos casos e de 47,5 + 18,8 anos nos controles (P<0,001). A raça negra predominou no grupo controle. O sexo masculino foi mais freqüente nos casos (61,4%), situação que se inverteu nos controles (49,5%). As presenças de HAS (OR=21,0; IC95% 8,0 a 57,1; P<0,001) e de hipercolesterolemia (OR=25,5; IC95% 9,5 a 70,9; P<0,001) determinaram, entre os fatores de risco conhecidos, as mais fortes associações com DOSAC. Anticorpos IgA antibeta2-gpI foram detectados em 33,3% dos casos e em 9,7% dos controles (OR ajustado 4,7; IC95% 1,0 a 23,7; P=0,06). A freqüência dos outros anticorpos testados não diferiu significantemente em casos e controles. Conclusão - Não houve associação entre ocorrência de aCL, IgG/IgM antibeta2- gpI, anti-Hsp e desfecho DOSAC. A presença de anticorpos IgA antibeta2-gpI se configurou como fator de risco independente para DOSAC (OR ajustado 4,7), embora com significância limítrofe (P=0,06). A associação de IgA antibeta2-gpI com DOSAC pode representar um dos elos na relação auto-imunidade e aterosclerose carotídea.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000430255-Texto+Completo-0.pdf: 1176318 bytes, checksum: 4850238e491d62ada84dedd411f149d1 (MD5) Previous issue date: 2011 / The relationship between anticardiolipin antibodies (ACA), markers of the antiphospholipid syndrome, and vascular complications of diabetes is a matter of debate. This cross-sectional study assessed the frequency of IgG, IgM, and IgA-ACA in type 2 diabetics with or without history of vascular events in the last 5 years and in healthy controls. Antibodies were detected by enzyme immunoassay. A total of 73 type 2 diabetics (33 with history of vascular events) and 54 healthy controls were tested. Most diabetics were female (p = 0. 003), and older than controls (p < 0. 001). Mean duration of disease was 10 years. The prevalence of a positive ACA test was 7. 4% in controls and 9. 5% in diabetics (p = 0. 910). Comparison of healthy controls and diabetics with or without history of macrovasculopathy, after adjusting for gender and age, showed no significant differences in ACA positivity (p > 0. 09). ACA positivity rates were also similar when diabetics with or without recent history of vascular events were compared (p > 0. 47). After adjusting for gender, age, hypertension, and smoking status, a weak but statistically nonsignificant association was found between IgM-ACA and vasculopathy in diabetics (adjusted OR 2. 7; 95%CI 0. 2 – 34. 2; p = 0. 441). Overall, levels of IgG (r = 0. 25; p = 0. 005) and IgM (r = 0. 23; p = 0. 010) ACA were associated with advancing age. In short, the frequency of positive ACA test in type 2 diabetics (with or without previous vascular events) was not significant as compared to healthy controls. There was no association between ACA and vascular events in patients with type 2 diabetes. / A relação entre anticorpos anticardiolipina (aCL), marcadores da síndrome antifosfolípide, e vasculopatia em diabéticos é matéria de debate. Este estudo, transversal controlado, avaliou a freqüência de IgG, IgM e IgA aCL em diabéticos do tipo 2 com ou sem eventos vasculares nos últimos 5 anos e em controles sadios. Os anticorpos foram detectados por ensaio imunoenzimático. Setenta e três diabéticos (33 com eventos vasculares prévios) e 54 controles foram estudados. Diabéticos foram predominantemente mulheres (p=0,003), e de idade mais avançada (p<0,001) em relação aos controles. A duração média da doença foi de 10 anos. A prevalência de teste positivo para anticorpos aCL foi de 7,4% em controles e de 9,5% em diabéticos (p=0,910). Após ajuste para sexo e idade, a freqüência de anticorpos aCL não diferiu significativamente quando se comparou controles e diabéticos com ou sem macrovasculopatia (p>0,09). A freqüência de anticorpos aCL também não diferiu quando se comparou os dois grupos de diabéticos entre si (p>0. 47). Após ajuste para sexo, idade, hipertensão e tabagismo, uma associação fraca, mas estatisticamente insignificante, foi 28 observada entre IgM aCL e diabéticos com vasculopatia (OR ajustado 2,7; IC95% 0,2-34,2; p=0,441). Globalmente, níveis de IgG (r=0,25; p=0,005) e IgM (r=0,23; p=0,010) aCL se correlacionaram com idade progressiva. Em resumo, a freqüência de teste positivo para anticorpos aCL em diabéticos tipo 2 (com ou sem histórico vascular) não foi significativa em relação a controles sadios. Não houve associação entre presença de anticorpos aCL e eventos vasculares em diabéticos tipo 2.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422630-Texto+Completo-0.pdf: 863810 bytes, checksum: 54cbb559cd6e16dd1047303d63eb52f7 (MD5) Previous issue date: 2010 / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by a considerable diversity of circulating autoantibodies. Heat shock proteins (Hsp), highly conserved in the evolution of species, are a possible target for autoantibodies in SLE. The humoral response to the 90 kilodaltons Hsp (Hsp90) in SLE was rarely addressed to date. Material and methods. In this cross-sectional and controlled study, we evaluated levels of anti-Hsp90 antibodies in active and inactive SLE patients and in healthy controls. Diagnosis of SLE was based on the American College of Rheumatology criteria of 1997. The presence of active SLE was confirmed by a SLEDAI above 4. IgG anti-Hsp90 antibodies were tested by immunoenzymatic assay. Levels above 2 standard deviation considering the average of controls were arbitrarly considered positive. To compare categoric and continuous variables and to estimate correlations, non-parametric, t test and Pearson coefficient were calculated. Results. Forty-five patients with SLE (42 females, 93. 3%) and 25 controls 22 females, 88%) were evaluated. Twenty-two of the 45 SLE patients (49%) had active disease. Urinary protein above 0. 5 grams/day, alopecia, oral ulcers and arthritis were significantly more frequent in active than inactive SLE patients. Patients with active SLE showed average levels of anti-Hsp90 significantly higher than controls (P<0. 001). The Pearson test revealed a significant correlation of levels of anti-Hsp90 and SLEDAI (R = 0. 51, P<0. 001). Sixteen SLE patients (36%) had a positive test for anti-Hsp90 (P<0. 02 in comparison to healthy controls).A positive test for anti-Hsp90 was significantly more frequent in active SLE when compared to controls (P<0. 001) and inactive SLE (P<0. 05). Positivity for anti-Hsp90 antibodies associated to occurrence of anti-DNA antibodies, leucopenia and thrombocytopenia. Specificity and sensitivity of the anti-Hsp 90 antibody test were 100% and 36%, respectively. The positive likelihood ratio (LR+) for anti- Hsp90 above 2 SD was elevated (18. 7). Conclusions. The average levels of anti- Hsp90 antibodies were significantly higher in SLE patients than controls. A positive testing for anti-Hsp90 seemed to associated to active disease, particularly anti-DNA antibodies and haematological changes. The test was highly specific, but with low sensitivity in SLE patients. In patients with antibody levels above 2 SD, the probability of SLE was elevated. The utilization of anti-Hsp90 antibodies as biomarkers of SLE and other autoimmune diseases shall be evaluated in future studies. / O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune caracterizada por uma considerável diversidade de autoanticorpos circulantes. As proteínas de choque térmico (Hsp), altamente conservadas na evolução das espécies, são um possível alvo para autoanticorpos no LES. A resposta humoral contra a Hsp de 90 kilodaltons (Hsp90) no LES foi pouco estudada até o momento. Material e métodos: Neste estudo, tranversal controlado, avaliamos os níveis de anticorpos anti-Hsp90 em pacientes com LES ativo e inativo e em controles sadios. O diagnóstico de LES foi fundamentado nos critérios do Colégio Americano de Reumatologia de 1997. A presença de LES ativo foi confirmada através de SLEDAI acima de 4. Anticorpos IgG anti-Hsp90 foram testados através de ensaio imunoenzimático. Níveis acima de 2 desvios-padrões (DP) em relação à média dos controles foram arbitrariamente considerados positivos. Para comparar variáveis categóricas e contínuas e para obtenção de correlações foram utilizados testes não-paramétricos, test t e coeficiente de Pearson. Resultados: Quarenta e cinco pacientes com LES (42 do sexo feminino, 93,3%) e 25 controles sadios (22 do sexo feminino, 88%) foram avaliados. Vinte e dois dos 45 pacientes com LES (49%) apresentaram doença ativa. Proteinúria acima de 0,5 g/dia, alopécia, úlceras mucosas e artrite foram significativamente mais freqüentes no LES ativo do que na doença inativa. Pacientes com LES ativo apresentaram níveis médios de anti- Hsp90 significativamente acima dos controles (P<0,001). O teste de Pearson revelou correlação significante entre níveis de anti-Hsp90 e SLEDAI (R = 0,51, P<0,001). Dezesseis pacientes com LES (36%) tiveram teste positivo para anti-Hsp90 (P<0,02 em relação aos controles sadios).Um teste positivo para anti-Hsp90 foi significativamente mais freqüente no LES ativo quando comparado a controles (P<0,001) e LES inativo (P<0,05). Positividade para anti-Hsp90 se associou à ocorrência de anticorpos anti-DNA, leucopenia e trombocitopenia. A especificidade e a sensibilidade do teste para anti-Hsp90 foram de 100% e 36%, respectivamente. O likelihood ratio positivo (LR+) para anti-Hsp90 acima de 2 DP foi elevado (18,7). Conclusões: Os níveis médios de anticorpos anti-Hsp90 foram significantemente mais elevados no LES do que em controles. A testagem positiva para anti-Hsp90 pareceu ser associada à doença lúpica ativa, particulamente anticorpos anti-DNA e alterações hematológicas. O teste se mostrou altamente específico, mas com baixa sensibilidade em pacientes com LES. Em pacientes com níveis anticórpicos acima de 2 DP, a probabilidade de doença lúpica foi elevada. A utilização do anticorpo anti-Hsp90 como biomarcador no LES e outras doenças autoimunes deve ser avaliada em estudos futuros.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000408007-Texto+Completo-0.pdf: 7713390 bytes, checksum: bf92d92b7f1e311023e32849423ed23c (MD5) Previous issue date: 2008 / The tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous ectoparasite of bovines, widely distributed in herds from America, Asia, Africa and Oceania. The use of acaricides is the main method for tick control, however it may become unfeasible due to the cost of drugs and labor required to apply the treatment, as well as the increasing appearance of resistant ticks to various acaricides. In addition, chemical residues in food and environmental pollution are major concerns nowadays. The development of an immunological control method as an alternative for the chemical control depends on finding out antigenic molecules that generate a protective immune response. As bovines develop resistance to ticks during successive infestations, the analysis of the immune responses developed by infested bovines may become of great importance in the search for protective antigens. ELISA and Western Blot were used to investigate the pattern of antibody responses of six bovines infested twelve times with R. microplus (six heavy infestations followed by six light infestations) against salivary gland, gut and larvae extracts. During heavy infestations, bovine IgG levels were shown to be higher, and a decrease in the number and weight of ticks that completed the parasitic cycle was observed. The pattern changed starting from the seventh infestation, showing a decrease in IgG levels, and an initial increase followed by a significant decrease in the proportion of ticks that completed the parasitic cycle. The number of molecules recognized by Western Blot was higher from sera collected following heavy infestations than after light infestations, although a great variation in the profiles detected could be seen when the bovines were compared. These results indicate that IgG responses to different tick antigens may not be generally associated with bovine resistance, and that infestation levels modulate the magnitude of humoral responses and possibly the immune mechanisms in the natural acquisition of tick resistance. / O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago de bovinos, amplamente distribuído nos rebanhos da América, Ásia, África e Oceania. O uso de acaricidas é o principal método para o controle do carrapato, porém o custo das drogas e da mão-de-obra requerida para aplicar o tratamento, o aparecimento crescente de carrapatos resistentes a vários acaricidas, a permanência de resíduos químicos nos alimentos e a poluição ambiental decorrente do seu uso tornam importante o desenvolvimento de outras formas de controle. O desenvolvimento de um método de controle imunológico como uma alternativa para o controle químico depende da identificação de moléculas antigênicas que geram uma resposta imune protetora. Como bovinos desenvolvem resistência ao carrapato durante sucessivas infestações, a análise da resposta imune desenvolvida por bovinos infestados pode tornar-se de grande importância na busca por antígenos protetores. ELISA e Western Blot foram utilizados para investigar o padrão de respostas de anticorpos de seis bovinos infestados doze vezes com R. microplus (seis infestações pesadas seguidas por seis infestações leves) contra extratos de glândula salivar, intestino e larva. Durante infestações pesadas foram observados níveis maiores de IgGs reconhecendo extratos protéicos de glândula salivar, intestino e larva, e uma diminuição no número e no peso de carrapatos que completam o ciclo parasitário. O padrão mudou iniciando na sétima infestação, mostrando uma diminuição nos níveis de IgG, e um aumento inicial seguido por uma significante diminuição na proporção de carrapatos que completam o ciclo parasitário. O número de moléculas reconhecidas em Western Blot foi maior pelos soros das infestações pesadas do que das infestações leves, embora uma grande variação nos perfis detectados pode ser visto entre os bovinos. Esses resultados indicam que níveis de anticorpos contra o carrapato não estão necessariamente relacionados de forma direta com níveis de resistência. Além disso, infestações pesadas e leves parecem modular de forma diferente a magnitude da resposta humoral e possivelmente os mecanismos imunes na aquisição natural de resistência ao carrapato.

Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz Soccol / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 27/02/2015 / Inclui referências : f.98-108 / Resumo: A febre aftosa é uma doença altamente contagiosa que acomete animais biungulados. Tem distribuição cosmopolita, mas é endêmica na Ásia, África e em alguns países da América do Sul, sendo que o Brasil é considerado zona livre com vacinação. No Brasil o controle epidemiológico da doença é realizado mediante a vacinação e vigilância sanitária sendo necessário diagnóstico diferencial entre animais vacinados de portadores do vírus, para provar a ausência da doença. Desta forma é fundamental o desenvolvimento de testes para diferenciar animais vacinados de doentes e para o controle do processo de produção da vacina. A resposta a anticorpos, contra proteínas não estruturais do vírus, tem sido amplamente utilizada para este propósito, como é o caso do ensaio imuno-enzimático-ELISA/EITB. A proteína 3ABC é uma proteína não estrutural do vírus da febre aftosa e está presente em altos níveis no soro de animais infectados. Visando a diferenciação entre animais doentes e vacinados a proteína ABC deve ser removida durante o processo de produção da vacina, para que o animal imunizado não apresente anticorpos detectáveis contra ela. O objetivo deste estudo foi produzir e caracterizar anticorpos policlonal e monoclonal contra a proteína 3ABC do vírus da febre aftosa, para serem utilizados no desenvolvimento de um teste imunoenzimático que permita monitorar os processos de purificação da vacina, para remover as proteínas não estruturais e controle de qualidade das partidas produzidas visando sua aprovação pelos órgãos fiscalizadores como o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Para a produção dos anticorpos policlonal e monoclonal primeiramente foi produzida a proteína 3ABC recombinante a partir do plasmídeo contendo gene que codifica a proteína 3ABC, já com a mutegênese do gene 3ABC no sítio ativo da protease 3Cpro para sua inativação, produzido por Gonzales, 2013. A produção da proteína foi realizada por fermentação da Escherichia coli recombinante em erlenmeyer de um litro e realizada as etapas de semi purificação (anticorpo policlonal) e ou purificação (anticorpo monoclonal). O anticorpo policlonal, produzido em coelhos, apresentou altos títulos a partir de 75 dias pós-imunização. A puriticação foi realizada por cromatografia de afinidade com proteína G, o que resultou em uma imunoglobulina altamente pura, tornando-a mais específica para a proteína de interesse. Para a produção do anticorpo monoclonal foram imunizados camundongos BALB/c por via intramuscular. A fusão realizada originou 217 colônias de hibridomas, sendo 10 deles positivos no tese ELISA indireto. Após clonagem e expansão dos clones positivos, foi realizado o teste de estabilidade permitindo a seleção de dois clones estáveis. Os anticorpos foram caracterizados pelas metodologias de ELISA e Western Blotting e mostraram alta reatividade contra a proteína 3ABC e podem ser utilizados no desenvolvimento do teste ELISA para o monitoramento dos processos de purificação da vacina contra a febre aftosa. Todos os experimentos foram realizados na empresa Ourofino Saúde Animal. Palavras chave: febre aftosa; proteína 3ABC; anticorpo policlonal anti-3ABC; anticorpo monoclonal anti-3ABC. / Abstract: FMD is a highly contagious disease that affects cloven-hoofed animals and is endemic in Asia, Africa and some countries in South America. In Brazil the epidemiological disease control is achieved by vaccination and health surveillance. For this control is necessary differential diagnosis between vaccinated animals and those carrying the virus, to prove the absence of the disease. Thus it is important to develop tests to differentiate vaccinated animals from sick animals. The antibody response against nonstructural proteins of the virus, have been widely used for this purpose, such as the enzyme-immunoassay ELISA / EITB. The 3ABC is a nonstructural protein of FMD virus and it is present in high levels in infected animals serum. It is necessary to be removed during vaccine production, so the immunized animal does not produce detectable antibodies against them. The aim of this study was to produce and characterize polyclonal and monoclonal antibodies against the 3ABC protein of FMD virus, for their use to develop an enzymatic immunoassay experiments. Such experiments will allows the monitoring of the vaccine purification processes, which removes non-structural proteins and also the quality control process of the produced batches for approval by regulatory agencies such as the Ministry of Agriculture Livestock and Supply (MAPA). In this study, the plasmid to heterologous protein 3ABC production was produced by GONZALEZ, 2013. The expression has been optimized for subsequent production of polyclonal and monoclonal antibodies. For animal's immunization, either rabbit or mouse, the protein used was the semi purified protein. And for the monoclonal antibody screening tests, the protein used was the purified protein. The purification in this stage was due to the need of a specific test to select the monoclonal antibody which is also highly specific. The polyclonal antibody produced in rabbits, showed high titers from 75 days post-immunization. The large amount of polyclonal antibody obtained enabled the using of affinity chromatography using protein G, as a purification method, which resulted in a highly pure immunoglobulin, making it more specific to the protein of interest. For the production of monoclonal antibody (Mabs) BALB/c Mice were immunized intramuscularly. The fusion carried out originated 217 hybridomas colonies, 10 of them were positives for antibody production by ELISA test. After cloning and expansion of positive clones, stability tests were performed wich allowed the selection of two stable clones. The antibodies were characterized by ELISA and Western Blotting approaches. The mabs obteined showed high reactivity against 3ABC protein and as a result they can be used in the development of an ELISA assay to monitor the purification processes of the vaccine against FMD. All experiments were performed in Ourofino Animal Health Company. Key-words: FMD; 3ABC protein; polyclonal anti-3ABC; monoclonal anti-3ABC.