Orientador : Dagmar Ruth Stach-Machado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T17:58:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_LeticiaChavesFerreira_M.pdf: 5578812 bytes, checksum: 7e4d14ddd6394f6091ef77195ec9d6c2 (MD5) Previous issue date: 2002 / Mestrado

Orientador: Luiz Carlos Zeferino / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T05:08:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_SabasCarlos_M.pdf: 3965943 bytes, checksum: 18f39a7d28aa4b50ba92767580e0b71c (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O objetivo deste estudo foi analisar a associação entre a angiogênese e as características anatomopatológicas do carcinoma do colo uterino, através da densidade de microvasos determinada pela técnica de imunoistoquímica com anticorpos monoclonais anti-CD34, BNH9 e anti-CD31. Para tal, foi realizado um estudo observacional analítico do tipo transversal, que incluiu 62 pacientes com carcinoma invasivo do colo uterino nos estádios Ibl, Ib2 e TIa da FIGO, que foram submetidas a histerectomia radical com linfadenectomia pélvica no período de janeiro de 2000 a fevereiro de 2002. A mensuração da angiogênese foi feita através da densidade de microvasos que correspondeu à média de microvasos por campo contados em dez campos. A densidade de microvasos foi maior quando se utilizou o anticorpo monoc1onal anti-CD34 e BNH9 do que com anti-CD31. O coeficiente de kappa foi de 0,74 (IC 950/0=0,56-0,91) quando analisou-se a concordância entre CD34 e BNH9 e os coeficientes de kappa foram de 0,35 (IC 95%=0,12-0,59) e de 0,29 (IC 95%=0,05-0,53), respectivamente, quando analisou-se a concordância entre CD34 e CD31 e entre CD31 e BNH9. Maior densidade de microvasos determinada pelo anticorpo anti-CD34 associou-se com carcinoma do colo uterino do tipo histológico escamoso, enquanto que com o anti-CD31 associou-se com o carcinoma indiferenciado. Maior densidade de microvasos determinada pelo anticorpo BNH9 associou-se com linfonodos comprometidos no carcinoma escamoso do colo uterino. Quando se utilizou os anticorpos anti-CD34 e BNH9 observou-se tendência de associação com invasão linfática para o carcinoma do colo uterino. Com bases nestes resultados, podemos concluir que a densidade de microvasos é maior quando utilizou-se os anticorpos monoclonais anti-CD34 e BNH9 do que com anti-CD31. A concordância para determinar a densidade de microvasos é melhor entre os anticorpos monoclonais anti-CD34 e BNH9. A atividade angiogênica é mais alta nos carcinomas escamosos, nos carcinomas indiferenciados e nos casos de carcinoma escamoso com linfonodos comprometidos / Abstract: The aim of this study was to analyse the association between angiogenesis and the pathoanatomic features of cervical cancer through microvessel density, determined by an immunohistochemical technique using anti-CD34, BNH9 and anti-CD31 monoclonal antibodies. For this purpose, a cross-sectional analytical observational study was conducted, including 62 patients with Stage Ibl, 1h2 and na cervical cancer as described by FIGO. These patients underwent radical hysterectomy with pelvic lymph node ressection 1Tom January 2000 to February 2002. Angiogenesis was measured through microvessel density which corresponded to the mean number of microvessels per field in 10 fields. Microvessel density was higher when using anti-CD34 and BNH9 monoclonal antibodies compared to using anti-CD31 monoclonal antibody (p<0,01). The kappa coefficient was 0.74 (CI 950/0=0.56-0.91) when analysing agreement between CD34 and BNH9. Kappa coefficients were 0.35 (CI 95%=0.12-0.59) and 0.29 (CI 95%=0.05-0.53), respectively, when analysing agreement between CD34 and CD31 and beween CD31 and BNH9. Higher microvessel density detennined by anti-CD34 antibody was associated with squamous cell cervical carcinoma, whereas it was associated with undifferentiated carcinoma when determined by anti-CD31 antibody. Higher microvessel density detennined by BNH9 antibody was associated with lymph node involvement in squamous cell cervical carcinoma. When anti-CD34 and BNH9 antibodies were used, a trend towards lymphatic invasion was observed in cervical carcinoma. Based on these results, we can conclude that microvessel density is higher when using anti-CD34 and BNH9 monoclonal antibodies compared to using anti-CD31. The agreeement between anti-CD34 and BNH9 monoclonal antibodies is better for determining microvessel density. There is a higher leveI of angiogenic activity in squamous cell carcinomas, undifferentiated carcinomas and squamous cell carcinomas with lymph node involvement / Mestrado / Medicina Interna / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T04:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_JoseDirceu_D.pdf: 4352784 bytes, checksum: fee17d1dc83be0a6528fa16646b68bb0 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: As subclasses de IgG, particularmente IgG 1 E IgG2, são os anticorpos responsáveis pela opsonização de Haemophylus irifluenzae e Streptococcus pneumoniae, agentes freqüentes das pneumonias da infância. O presente trabalho teve como objetivo avaliar se havia ou não diferença na concentração sérica dessas imunoglobulinas em crianças asmáticas graves com e sem pneumonias de repetição. Os níveis Séricos de IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, foram dosados utilizando-se anticorpos monoclonais pela técnica de ELISA, em 72 crianças de 7 a 15 anos de idade ,portadoras de asma brônquica atópica grave, divididas em dois grupos: 1- 37 crianças com pneumonias de repetição. 1I-35 crianças que nunca haviam tido pneumonia. O mesmo método foi empregado em 80 crianças controles de 7 a 15 anos de idade, permitindo a construção de curvas com os percentís 2,5, 5,0, 25,0, 50,0, 75,0, 95,0 e 97,5. Para isso utilizou-se a transformação logarítmica de BOX-COX. A comparação entre os grupos foi realizada utilizando-se o teste não paramétrico de WILLCOXON - MANN & WHITNEY. Verificou-se que foram significativamente menores (p<0,05) os níveis séricos de IgGl nos grupos I e lI, os níveis séricos de IgG2, na faixa etária de 7 a 9 anos nos pacientes do grupo I, bem como de IgG4, na faixa etária de 7 a 12 anos de idade nos grupos I e lI, quando comparados ao grupo controle. Não houve diferença significativa (p>0,05) entre os pacientes asmáticos dos dois grupos estudados quando comparados por sexo ou por faixa etária. Exceção apenas para os níveis séricos de IgG3 nos asmáticos masculinos que foram significativamente maiores que nos asmáticos femininos do grupo 1. As crianças controles (saudáveis) também não apresentaram diferenças estatísticas nos níveis de subclasses de IgG quando comparadas por sexo, exceto para IgG4 na faixa etária de 7 a 9 anos. Estes resultados sugerem que a regulação da síntese destas imunoglobulinas em crianças asmáticas, especialmente IgG1 na faixa etária de 7 a 15 anos e IgG4 na faixa etária de 7 a 12 anos é diferente das crianças saudáveis. Porém este fato não distingue nestas faixas etárias, os grupos com e sem pneumonias de repetição / Abstract: IgG subclasses (IgGSC), especially IgG 1 and IgG2, are the antibodies responsible for the opsonization of Haemophylu8 influenzae and Streptococcus pneumoniae, ftequent agents of childhood pneumonia. It was the objective of this research to evaluate whether differences in the serum concentration of such immunoglobulins exists in severely asthrnatic children with or without recun-ent pneumonia. The serum levels of IgG 1, IgG2, IgG3 and IgG4 were administered using monoclonal antibodies, utilizing the ELISA technique, in 72 children, age 7 though 15, with severe atopic bronchial asthma. The children were divided in two groups: Group I - 37 children with repetitive pneumonia. Group fi - 35 children who had never had pneumonia. The same procedure was applied to 80 healthy chidren, age 7 to 15, which allowed for the construction ofpercentual curves 2.5, 5.0, 25.0, 50.0,95.0 and 97.5. For this, the BOX-COX logarithmic transformation was used. Thc comparation between groups was made using the WILCOXON, F. and MANN, H. & WHITNEY, D. non-parametric test. n was verified that there was a statistically significant difference (less than p<0.05) in the serum levels of IgG 1 in groups I and lI, of IgG2 in the 7 to 9 age groups of patients in group 1, and of IgG4 in the 7 to 12 groups of patients in groups I and fi, when compared,to normal groups. No significant differences were found (p>0.05) among the asthrnatic patients of both groups that were analysed when compared by sex or separated by age. The onlyexception found was the scrum levels of IgG3 in male asthmatic patients that were significantly largcr than in thc female asthmatic group. Thc healthy children also did not present statistical differences in the levels of IgGSC when compared by sex, except for IgG4 between age 7 to 9. These results suggest that the regulation of the synthesis of these immunoglobulins in astlunatic children, especially in the 7 to 15 group of IgG 1 and the 7 to 15 age group of IgG4 are different than in nonnal children. These facts do not distinguish in these age groups, however, groups with or without reCU1Tent pneumonia / Doutorado / Doutor em Pediatria

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 415077.pdf: 548894 bytes, checksum: e6f3e94ef77c01b55d71ea1aa94a93f8 (MD5) Previous issue date: 2009-03-04 / A s?ndrome metab?lica ? considerada uma afec??o pr?-aterog?nica. Fen?menos autoimunes, particularmente autoanticorpos contra co-fatores fosfolip?dicos como a beta2- glicoprote?na I (beta2-gpI), podem ter influ?ncia no desenvolvimento do ateroma. Estudos pr?vios confirmaram uma associa??o entre IgA anti-beta2-gpI e acidente vascular cerebral isqu?mico, infarto agudo do mioc?rdio, doen?a arterial perif?rica e doen?a carot?dea. Este estudo de casocontrole avaliou uma poss?vel associa??o de anticorpos anti-beta2-gpI e anticardiolipina (aCL) com ocorr?ncia de s?ndrome metab?lica n?o-complicada. Os casos compreenderam pacientes com s?ndrome metab?lica sem hist?rico de eventos vasculares; os controles consistiram de pacientes internados em enfermaria ortop?dica devido ? dist?rbios musculoesquel?ticos. Idade, sexo, ra?a, hist?rico de hipertens?o arterial sist?mica (HAS), tabagismo, hipercolesterolemia e diabetes mellitus (DM) foram avaliados como fatores de risco em ambos os grupos. Anticorpos IgG, IgM e IgA anti-beta2-gpI e aCL foram detectados por ensaio imunoenzim?tico. Para estimar o grau de associa??o dos anticorpos com s?ndrome metab?lica, foram calculadas raz?es de chances (odds ratios, OR). Regress?o log?stica foi utilizada para ajuste dos fatores de confus?o. Sessenta e oito pacientes com s?ndrome metab?lica e 82 indiv?duos do grupo-controle foram estudados. O grupo com s?ndrome metab?lica apresentou m?dia de idade superior ao do grupo-controle (P = 0,001), enquanto o sexo masculino (P = 0.003; OR 0,31; IC95% 1,15-0,16) e a cor branca (P = 0.004; OR 0,25; IC95% 0,10-0,60) predominaram nos controles. Hist?rico de HAS, hipercolesterolemia e DM foram mais prevalentes nos casos do que em controles (P<0.05). Anticorpos IgA anti-beta2-gpI foram significativamente mais frequentes em pacientes com s?ndrome metab?lica do que no grupocontrole (P < 0,001). O OR ajustado para anticorpos IgA anti-beta2-gpI foi de 3,6 (IC95% 1,55-8,37; P = 0,003). O presente estudo demonstra que n?veis elevados de autoanticorpos IgA anti-beta2-gpI podem se constituir em fator de risco independente para s?ndrome metab?lica.

A prova sorológica de referência na leptospirose ainda é a soroaglutinação microscópica (SAM). Devido à complexidade desta prova avaliamos alguns testes rápidos para triagem dos anticorpos anti-leptospiras na fase aguda da infecção. Na década de 80, uma hemaglutinação passiva, utilizando frações polissacarídicas de leptospiras, foi considerada apropriada ao diagnóstico precoce, porém esta preparação antigênica incluía muitos “antígenos comuns" reconhecidos por anticorpos de 4% dos indivíduos normais. Um novo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) utilizando uma suspensão de antígenos imunodominantes, resistentes à proteinase K, foi padronizado e avaliado quanto ao seu valor diagnóstico. Com 89,9% de sensibilidade e 97,4% de especificidade, esta técnica, referida como PK-ELISA, satisfaz os requisitos necessários para as provas de triagem da leptospirose humana. No entanto, em virtude de alguns reagentes usados nesta preparação antigênica serem importados e muito instáveis, foi proposta a introdução de novos métodos empregando-se anticorpos monoclonais. Em um “Acordo de Pesquisa Cooperativa" entre o Instituto Adolfo Lutz e o Laboratório Fleury foram produzidos hibridomas contra leptospiras. Dois deles foram selecionados para dar continuidade ao estudo: um, secretando anticorpos monoclonais (AcM) para um epítopo detectado em 16 de 23 sorovares do gênero Leptospira mais freqüentes em nosso meio (clone A12P4), e outro específico a somente um sorogrupo patogênico, icterohaemorragiae (clone H7P1). O AcM A12P4, uma imunoglobulina G2B (IgG2B), reagiu com epítopo presente nos componentes de pesos moleculares (PM) de 16-18 kDa dos lisados de leptospiras das cepas RGA e M-20, quando separados na eletroforese em gel de poliacrilamida, e com componentes de PM de 75-84kDa dos sorovares copenhageni e canicola. Por sua vez, o AcM H7P1, uma imunoglobulina G, reagiu com um epítopo comum a várias frações de PM acima de 21 kDa da cepa RGA e com componentes de PM de 21-22 kDa e de 75-82 kDa da cepa M-20. Os monoclonais foram empregados em provas imunoenzimáticas para a detecção de anticorpos específicos em amostras séricas pareadas coletadas de 52 pacientes com leptospirose, e do grupo controle que incluiu amostras séricas de 57 pacientes com outras doenças consideradas no diagnóstico diferencial, e de 68 indivíduos normais. Estas provas, no entanto, não foram satisfatórias. Finalmente, um novo ELISA foi desenvolvido no presente estudo que utiliza a suspensão de antígenos “AgMc", purificados por cromatografia de afinidade utilizando a Sepharose 4B ativada com CNBr acoplada aos anticorpos monoclonais descritos acima. Os resultados obtidos com esta prova foram comparados aos obtidos com outros testes disponíveis em nosso meio, como a SAM e o ELISA clássico (ELISA c). Este novo método, o “ELISA AgMc", com 80,70 % e 83,33 % de sensibilidade e especifidade, respectivamente, em relação à SAM; valores preditivos positivo e negativo de 69,70% e 90,10% respectivamente e índice de concordância geral de 82,49%, não parece ser um protocolo promissor para o diagnóstico rápido na leptospirose humana. Além disso, tomando-se a SAM como diagnóstico verdadeiro, os resultados obtidos no novo teste, após a conclusão diagnóstica do grupo de pacientes com a leptospirose, mostrou uma discordância significativa. São discutidas as possíveis explicações para os resultados encontrados. / The best serological test for leptospirosis laboratory diagnosis remains the microscopic agglutination test (MAT). Because of the complexity of MAT, we have been developed some rapid screening tests for leptospiral antibodies detection in the acute phase of infection. In the decade of 80, a passive hemagglutination test employing polysaccharide fractions of leptospires was considered appropriate for early diagnosis, but its antigen preparation included “common antigens" recognized by antibodies from 4% of healthy individuals. A new ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) employing proteinase K resistant immunodominant antigens was developed and its potential diagnosis evaluated. This technique, the PK-ELISA, presented 89.9% sensitivity and 97.4% specificity, and satisfied the requeriments needed for serological screening tests of human leptospirosis. However, some of the reagents used in its antigen preparation are imported and very unstable. So, it was proposed, in a “Cooperative Research Accordance" between Instituto Adolfo Lutz and Laboratório Fleury, to try new approaches with monoclonal antibodies. Two hibridomas secreting specific monoclonal antibodies (MAb) were selected: one, against an epitope detected in 16 of 23 members of the genus Leptospira (clone A12P4) and the other, specific to the icterohaemorragiae serogroup (clone H7P1). The MAb A12P4, a G2 (IgG2B) immunoglobulin, reacted with an epitope present in the 16-18 kDa components of icterohaemorragiae serogroup and with the 75-84 kDa components of serovars copenhageni and canicola, after whole-cell lysates of the leptospires were separated by sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis. The MAb H7P1, which is an IgG, reacted with an epitope common to several fractions of molecular weight above 21 kDa of strain RGA and with the 21-22 kDa and the 75-82 kDa components of strain M-20. Both monoclonal antibodies were employed in enzyme immunoassays for detecting specific antibodies in serum samples serially colleted from 52 patients with leptospirosis, and from the control group, which consisted of sera from 57 patients with other diseases included in the differential diagnosis, and from 68 healthy individuals. These tests, however, were not satisfactory. A new ELISA was developed in the present study employing an antigen suspension “AgMc", purified by affinity chromatography with CNBr-activated Sepharose 4B coupled to the monoclonal antibodies described above. The results obtained with this test were compared to the MAT and to the classical IgM ELISA (ELISA c). The new method, “AgMc ELISA", presented serological indices, relatively to reference test MAT, of 80.70 % and 83.33 % of sensitivity and specificity, respectively; positive and negative predictive values of 69.70 % and 90.10 %, respectively, and general agreement index of 82.49 %. So, this test was not considered a promising approach to rapid diagnosis of human leptospirosis. Moreover, the proportion of patients diagnosed as having leptospirosis by the “AgMc ELISA" and the MAT differ significantly. The possible explanations for the results obtained are discussed.

Submitted by Pós graduação Farmácia (ppgfar@ufba.br) on 2017-05-25T20:04:40Z No. of bitstreams: 1 MILENA SANTANA CABRAL.pdf: 2324817 bytes, checksum: efec4e0396dc2673dceb720f82342942 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2017-06-01T17:35:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MILENA SANTANA CABRAL.pdf: 2324817 bytes, checksum: efec4e0396dc2673dceb720f82342942 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T17:35:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MILENA SANTANA CABRAL.pdf: 2324817 bytes, checksum: efec4e0396dc2673dceb720f82342942 (MD5) / FAPESB e CNPq / A infeção crônica pelo VHC tem como principal característica a associação com diversas manifestações autoimunes. Dentre estas, a aumentada expressão de autoanticorpos não-órgão específicos, como os anticorpos antimúsculo liso, com possível importância na patogênese da doença. Objetivos: (1) Determinar a prevalência de anticorpos antimúsculo liso e sua distribuição conforme o gênero em portadores de HCC; (2) caracterizar a reatividade sorológica dos anticorpos antimúsculo liso usando como referência os padrões de fluorescência previamente determinados; (3) estabelecer as associações entre a reatividade sorológica dos anticorpos antimúsculo liso com os dados clínicos e laboratoriais dos portadores de hepatite C; (4) caracterizar imunoquimicamente os anticorpos frente a antígenos purificados. Pacientes: Foram avaliados 100 portadores de HCC, sem tratamento antiviral prévio, com diagnóstico clínico, sorológico, virológico, e histopatológico, acompanhados no C-HUPES. Métodos: Anticorpos antimúsculo liso e antinúcleo foram pesquisados por imunofluorescência indireta e a especificidade imunoquímica investigada através de imunoblot. Dosagens de fator reumatóide, haptoglobina e IgG foram realizadas por nefelometria. Crioglobulinas foram determinadas por crioprecipitação em tubo e por gel-difusão e a ALT por método cinético. Os dados de genótipo e histopatológico foram obtidos dos prontuários. Resultados: Anticorpos antimúsculo liso foram detectados em 21% dos pacientes (55 homens, 45 mulheres), sendo o padrão de fluorescência AML-v o mais frequentemente observado (81%). A associação de padrões mais prevalente foi AML-v e AML-m (71%). A maioria dos títulos dos autoanticorpos foi baixa, com apenas quatro amostras apresentando títulos superiores a 1/40. Apenas uma amostra apresentou padrão glomerular com título maior que 1/40, e não foi encontrado padrão tubular. Das três proteínas associadas aos AML, os portadores de HCC com AML positivos apresentaram maior frequência de reatividade para a actina-F, ocorrendo em 29% das amostras. A associação entre os AML e este antígeno alvo foi significante (P=0,005). Não houve associação estatisticamente significante entre os antígenos desmina e miosina, com os AML, e a prevalência de reatividade para esses antígenos foi inferior. Com o uso do imunoblot comercial, foi encontrada a presença do autoanticorpo anti-LC1 em 52% das amostras positivas para AML e em 15% das amostras negativas para esse mesmo anticorpo. Foi encontrada também a presença do anti-SLA/LP em 14% das amostras positivas para AML e em 8% das amostras que não apresentavam este autoanticorpo. Os anticorpos AMA-M2 e anti-LKM1 não foram encontrados em nenhum dos grupos avaliados. Conclusões: Uma prevalência de 21% para AML foi encontrada neste estudo, com uma relação homem/mulher de 1,1/1. A presença de AML não foi associada a qualquer dos dados demográficos, clínicos e laboratoriais deste grupo de portadores de HCC, nem associada à lesão tecidual. Determinar os padrões de fluorescência e título das amostras é relevante na detecção dos AML. Apenas a minoria dos AML de portadores de HCC reconhecem as proteínas actina-F, desmina e miosina. Foi documentado elevada expressão de anticorpos anti-LC1 neste grupo de portadores de HCC. / The main characteristic in HCV chronic infection is the association with various autoimmune manifestations. Among them, the increased expression of non-organ specific autoantibodies, such smooth muscle antibody, which possible role in HCV pathogenesis. Objectives: (1) Determine the prevalence of smooth muscle antibodies and their distribution according gender in patients with chronic hepatitis C; (2) characterize the serological reactivity of these autoantibodies in accordance with predetermined patterns of fluorescence; (3) establish associations between serologic reactivity of them with clinical and laboratory data from these patients; (4) characterize the antibodies immunochemically with purified antigens. Patients: 100 HCV carriers before treatment had been evaluated, with previous clinical, serological, virological and histopathological diagnosis, from C-HUPES. Methods: Smooth muscle and antinuclear antibodies were performed by indirect immunofluorescence and immunochemical reactivity was determined by immunoblot. Rheumatoid factor, haptoglobin and IgG were quantified by nephelometry. Cryoglobulins were determined by cryoprecipitation in tube and gel-diffusion and the determination of ALT by UV kinetics. Genotype and histophatological data were obtained from medical records. Results: 21% of HCV carriers presented anti-smooth muscle antibodies (55 men, 45 women); with the AML-v pattern the most found (81%). Also, the AML-v and AML-m patterns were the association more prevalent (71%). The titles of most autoantibodies were low, but four samples showed titles above 1/40. Only one sample showed glomeruli pattern with titles greater than 1/40, and no tubular pattern was found. In the imunoblot, the HCV carriers AML positive presented a major reactivity for F-actin (29%), which association with these autoantibody was significant (P=0.005). There was no association between AML with desmin and myosin, which reactivities of the AML to these proteins were low. Autoantibodies anti-LC1 was found in 52% of samples AML positive and in 15% of samples AML negative. It was also found the presence of anti-SLA/LP in 14% of positive samples for AML and in 8% of the negative samples. AMA-M2 antibodies and anti-LKM1 were not found in any of these groups. Conclusions: This study found an AML prevalence of 21%, with 1.1/1 men/women relation. The AML presence was not associated with any of the demographic, clinical and laboratory data from the HCV carries evaluated or associated with tissue lesion. Determine fluorescence patterns and sample titles are relevant to detect these antibodies. Only the minority of the AML from HCV carriers evaluated recognized the proteins F-actin, desmin and myosin. High expression of anti-LC1 antibodies were found in these HCV carries.

Made available in DSpace on 2016-03-04T13:55:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 9.pdf: 3952596 bytes, checksum: cfcd87da861ff1eb06b00de845149fc4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos/Farmanguinhos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A caxumba é uma doença infecto-contagiosa imunoprevinível por vacinação. A imunogenicidade vacinal é avaliada através de testes sorológicos que detectam anticorpos neutralizantes, que são considerados correlatos de proteção. O Teste de Neutralização (PRNT) apresenta vantagens frente a outros testes por ser mais específico na detecção desses anticorpos neutralizantes. O presente estudo visou padronizar e validar a técnica. Durante a padronização foram definidos o M.O.I de 0,001 e o melhor dia de pico de vírus infeciosos (3 dias), para definir um protocolo de produção viral. A partir do vírus produzido foram avaliados qualitativamente o fenótipo da placa de lise e a diluição viral em diferentes condições analíticas. Os seguintes parâmetros foram definidos: diluição viral de 1:1600 para obter 30 placas de lise/poço, bicarbonato de sódio como tampão no meio de cultura, meio semi-sólido com carboximetilcelulose (CMC) 1,5%, tempo de adsorção de 3 horas e tempo de incubação final de 4 dias. Para avaliar o impacto do tempo de neutralização na potência viral e no de título de anticorpos neutralizantes, dois intervalos de tempo (1 e 2 horas) foram testados e a neutralização por 2 horas se demonstrou mais adequada ao ensaio. Posteriormente, foi definido um ponto de corte de 23, utilizando um painel sorológico contendo 126 soros pré e pós-vacinais de crianças imunizadas com a vacina tríplice viral. O ponto de corte foi determinado como a área sob a curva ROC usando os resultados de ELISA previamente avaliados em comparados com os resultados de PRNT. Dentre os resultados analisados, 35% foram concordantes na positividade dos resultados em ambos os testes. Valores preditivos positivos de 95,373 e valores negativos 97,680 determinam a real presença ou não da doença. Critérios de aceitação para o teste foram estabelecidos como: faixas de variação do end point do vírus (13 a 22) e faixas de variação dos controles (baixo, médio e alto). Também foi estabelecido como as amostras indeterminadas devem ser tratadas. Posteriormente, o PRNT foi submetido ao processo de validação, avaliando os parâmetros de linearidade, especificidade, exatidão e precisão, conforme preconizado pela RDC 27 da ANVISA. Nas análises de precisão foram obtidos coeficientes de variação a 15% para o limite inferior de quantificação do método (LIQ) e 20% para as demais concentrações. O mesmo ocorreu nas análises de exatidão. Quanto a seletividade, não foi detectada reação cruzada nas amostras quando desafiadas com o vírus de sarampo. / Mumps is an infectious disease preventable by an available vaccine. Vaccine immunogenicity is evaluated by serological tests for detection of neutralizing antibodies, which are considered the correlate of protection. Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT) shows advantages for neutralizing antibodies’ dosage because of its better specificity when compared to other tests. The present study aims to standardize and validate this technique. During the standardization process, it was defined the multiplicity of infection of 0,001 and the viral peak production on the third day, for defining a viral production protocol. From the virus lot produced, it were qualitatively evaluated the plaque phenotypes and viral dilutions under different analytical conditions. The following parameters were defined: viral dilution of 1:1600 to achieve 30 plaques per well; sodium bicarbonate as buffer of the culture media, semisolid overlay media content of 1,5% of carboxymethylcellulose (CMC); adsorption time of 3 hours and final incubation of 4 days. In order to evaluate the impact of incubation time for neutralization step on viral potency and neutralizing antibodies’ titers, two intervals (1 and 2 hours) were evaluated and the 2-hour neutralization time was considered more appropriate. After that, a cutoff value of 23 was defined using a serological panel containing 126 pre and post- vaccination sera of children immunized with MMR vaccine. The cutoff value was defined from the area under the ROC curve using ELISA data previously analyzed in comparison with PRNT results. Among the results, there were 35% of positive results in agreement in both tests. Positive predictive value of 95.373 and negative predictive value of 97.680 determine the actual presence or absence of disease. Acceptance criteria for the test were established such as: viral endpoint range (13 to 22) and titer variation ranges for control samples (low, medium and high titer). It was also determined how indeterminate samples should be treated. Finally, PRNT were submitted to validation regarding linearity, specificity, accuracy and precision as recommended by RDC 27 of ANVISA. Regarding the precision analyses, coefficient of variations lower than 15% were achieved for the sample with the lower limit of quantification, and lower than 20% for the other sample concentrations tested. The same occurred in the accuracy analyses. Regarding specificity, no cross reaction was detected in the samples when challenged with measles virus.

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T10:09:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scuro_LorenSemionatto_M.pdf: 980651 bytes, checksum: f54e323b2050cb528e7e829af26086ad (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi a obtenção e caracterização de anticorpos monoclonais contra a IL6 humana recombinante (hr) para serem empregados em ensaios imunoenzimáticos do tipo ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) de detecção da IL6 humana nativa, presente em fluídos biológicos de pacientes portadores de quadros onde os níveis de IL6 encontram-se elevados, ou então produzida por monócitos humanos e murinos ativados in vitro. Dois grupos de hibridomas (1A6 e 3B1) secretores de anticorpos monoclonais anti-IL6 foram obtidos pela fusão de células de mieloma da linhagem SP2 Ag14/0 com esplenócitos de camundongos BALB/c, previamente imunizados com a IL6 humana recombinante. Esses hibridomas foram selecionados com base em sua reatividade com a hrIL6, através de ensaios do tipo ELISA indireto. As imunoglobulinas (Igs) monoclonais produzidas pelos hibridomas dos dois grupos são do isotipo IgG1 Kappa e foram purificadas de líquidos ascíticos e dos sobrenadantes de cultura por cromatografia de afinidade. As proteínas purificadas foram conjugadas com biotina para uso em ensaios de ELISA de captura da hrIL6, de modo a se identificar um ou mais pares de anticorpos adequados a esse tipo de teste, bem como para definir a sensibilidade de detecção da citocina. O par de anticorpos monoclonais 3B1E4 x 1A6F10-biotinilado se mostrou mais promissor nos ensaios de ELISA, detectando a citocina recombinante entre 8 e 512 ng/mL, liberando densidades óticas mais elevadas. Todos os anticorpos monoclonais (AcMos) anti IL6 estudados foram capazes de neutralizar a atividade biológica da citocina em ensaios empregando o hibridoma B13.9, uma célula dependente de IL-6 para seu crescimento. Finalmente, o par de hibridomas anti IL6 3B1E4 e 1A6F10 foi estudado quanto às suas principais características de cultivo: crescimento, produção in vitro dos anticorpos, consumo de glicose e produção de lactato e amônia. O seqüênciamento da porção N-terminal do par 3B1E4 e 1A6F10 revelou que as cadeias leves dos dois anticorpos apresentam seqüência idêntica de aminoácidos. Porém, a análise dos dez resíduos de aminoácidos presentes na região variável das cadeias pesadas resultou em seqüências completamente distintas nos dois monoclonais, sendo um forte indício de diferença nos sítios de ligação ao antígeno dos anticorpos estudados / Abstract: In the present study we have developed monoclonal antibodies against human recombinant (hr) IL6, for the use in ELISA assays to detect the human native IL6 present in biological fluid of patients or in supernatant of activated human and rodent monocytes. Two families of hibridomas (1A6 and 3B1) secreting MAb against-IL6 were obtained from the fusion of mieloma cells from SP2 Ag14/0 lineage with spleen cells from BALB/c mice, previously immunized with human recombinant IL6. Those hibridomas were selected on the basis of their reactivity with the hrIL6, through an ELISA indirect assay. The monoclonal immunoglobulins (Igs) produced by these hibridomas are from IgG1 Kappa isotype and were purified from ascitic fluid and culture supernatant by affinity chromatography. The purified proteins from the ascitic fluid were conjugated with biotin for the use in ELISA hrIL6 capture assay, to identify one or more pairs of antibodies appropriated to this kind of test, as well to define the sensibility of cytokine detection. The pair of MAbs 3B1E4 x 1A6F10-biotinilates was shown promising in ELISA assays, detecting the recombinant cytokine between 8 and 512 ng/mL, liberating elevated optical densities. All of the a-IL6 MAbs studied were capable to neutralize the biological activity of the cytokine in attempt employing the hibridoma B13.9 IL-6 dependent. Finally, the pair of hibridomas a-IL6 3B1E4 and 1A6F10 was studied as regards his main cultivation characteristics: growth, MAb production in vitro, lactate and ammonia production and glucose consumption. The N-Terminal portion sequence of 3B1E4 and 1A6F10 revealed that both light-chains present identical amino acid sequence. However, the analysis of the ten amino acid residues present in variable region of heavy-chains resulted in completely distinct sequences in both antibodies, being a strong indication of difference in their ability to recognize the antigen / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A prova sorológica de referência na leptospirose ainda é a soroaglutinação microscópica (SAM). Devido à complexidade desta prova avaliamos alguns testes rápidos para triagem dos anticorpos anti-leptospiras na fase aguda da infecção. Na década de 80, uma hemaglutinação passiva, utilizando frações polissacarídicas de leptospiras, foi considerada apropriada ao diagnóstico precoce, porém esta preparação antigênica incluía muitos “antígenos comuns” reconhecidos por anticorpos de 4% dos indivíduos normais. Um novo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) utilizando uma suspensão de antígenos imunodominantes, resistentes à proteinase K, foi padronizado e avaliado quanto ao seu valor diagnóstico. Com 89,9% de sensibilidade e 97,4% de especificidade, esta técnica, referida como PK-ELISA, satisfaz os requisitos necessários para as provas de triagem da leptospirose humana. No entanto, em virtude de alguns reagentes usados nesta preparação antigênica serem importados e muito instáveis, foi proposta a introdução de novos métodos empregando-se anticorpos monoclonais. Em um “Acordo de Pesquisa Cooperativa” entre o Instituto Adolfo Lutz e o Laboratório Fleury foram produzidos hibridomas contra leptospiras. Dois deles foram selecionados para dar continuidade ao estudo: um, secretando anticorpos monoclonais (AcM) para um epítopo detectado em 16 de 23 sorovares do gênero Leptospira mais freqüentes em nosso meio (clone A12P4), e outro específico a somente um sorogrupo patogênico, icterohaemorragiae (clone H7P1). O AcM A12P4, uma imunoglobulina G2B (IgG2B), reagiu com epítopo presente nos componentes de pesos moleculares (PM) de 16-18 kDa dos lisados de leptospiras das cepas RGA e M-20, quando separados na eletroforese em gel de poliacrilamida, e com componentes de PM de 75-84kDa dos sorovares copenhageni e canicola. Por sua vez, o AcM H7P1, uma imunoglobulina G, reagiu com um epítopo comum a várias frações de PM acima de 21 kDa da cepa RGA e com componentes de PM de 21-22 kDa e de 75-82 kDa da cepa M-20. Os monoclonais foram empregados em provas imunoenzimáticas para a detecção de anticorpos específicos em amostras séricas pareadas coletadas de 52 pacientes com leptospirose, e do grupo controle que incluiu amostras séricas de 57 pacientes com outras doenças consideradas no diagnóstico diferencial, e de 68 indivíduos normais. Estas provas, no entanto, não foram satisfatórias. Finalmente, um novo ELISA foi desenvolvido no presente estudo que utiliza a suspensão de antígenos “AgMc”, purificados por cromatografia de afinidade utilizando a Sepharose 4B ativada com CNBr acoplada aos anticorpos monoclonais descritos acima. Os resultados obtidos com esta prova foram comparados aos obtidos com outros testes disponíveis em nosso meio, como a SAM e o ELISA clássico (ELISA c). Este novo método, o “ELISA AgMc”, com 80,70 % e 83,33 % de sensibilidade e especifidade, respectivamente, em relação à SAM; valores preditivos positivo e negativo de 69,70% e 90,10% respectivamente e índice de concordância geral de 82,49%, não parece ser um protocolo promissor para o diagnóstico rápido na leptospirose humana. Além disso, tomando-se a SAM como diagnóstico verdadeiro, os resultados obtidos no novo teste, após a conclusão diagnóstica do grupo de pacientes com a leptospirose, mostrou uma discordância significativa. São discutidas as possíveis explicações para os resultados encontrados. / The best serological test for leptospirosis laboratory diagnosis remains the microscopic agglutination test (MAT). Because of the complexity of MAT, we have been developed some rapid screening tests for leptospiral antibodies detection in the acute phase of infection. In the decade of 80, a passive hemagglutination test employing polysaccharide fractions of leptospires was considered appropriate for early diagnosis, but its antigen preparation included “common antigens” recognized by antibodies from 4% of healthy individuals. A new ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) employing proteinase K resistant immunodominant antigens was developed and its potential diagnosis evaluated. This technique, the PK-ELISA, presented 89.9% sensitivity and 97.4% specificity, and satisfied the requeriments needed for serological screening tests of human leptospirosis. However, some of the reagents used in its antigen preparation are imported and very unstable. So, it was proposed, in a “Cooperative Research Accordance” between Instituto Adolfo Lutz and Laboratório Fleury, to try new approaches with monoclonal antibodies. Two hibridomas secreting specific monoclonal antibodies (MAb) were selected: one, against an epitope detected in 16 of 23 members of the genus Leptospira (clone A12P4) and the other, specific to the icterohaemorragiae serogroup (clone H7P1). The MAb A12P4, a G2 (IgG2B) immunoglobulin, reacted with an epitope present in the 16-18 kDa components of icterohaemorragiae serogroup and with the 75-84 kDa components of serovars copenhageni and canicola, after whole-cell lysates of the leptospires were separated by sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis. The MAb H7P1, which is an IgG, reacted with an epitope common to several fractions of molecular weight above 21 kDa of strain RGA and with the 21-22 kDa and the 75-82 kDa components of strain M-20. Both monoclonal antibodies were employed in enzyme immunoassays for detecting specific antibodies in serum samples serially colleted from 52 patients with leptospirosis, and from the control group, which consisted of sera from 57 patients with other diseases included in the differential diagnosis, and from 68 healthy individuals. These tests, however, were not satisfactory. A new ELISA was developed in the present study employing an antigen suspension “AgMc”, purified by affinity chromatography with CNBr-activated Sepharose 4B coupled to the monoclonal antibodies described above. The results obtained with this test were compared to the MAT and to the classical IgM ELISA (ELISA c). The new method, “AgMc ELISA”, presented serological indices, relatively to reference test MAT, of 80.70 % and 83.33 % of sensitivity and specificity, respectively; positive and negative predictive values of 69.70 % and 90.10 %, respectively, and general agreement index of 82.49 %. So, this test was not considered a promising approach to rapid diagnosis of human leptospirosis. Moreover, the proportion of patients diagnosed as having leptospirosis by the “AgMc ELISA” and the MAT differ significantly. The possible explanations for the results obtained are discussed.

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-09T16:36:26Z No. of bitstreams: 1 carlos-humberto-marques.pdf: 2761227 bytes, checksum: cf168e11c904e07038251644b2018901 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-09T16:36:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carlos-humberto-marques.pdf: 2761227 bytes, checksum: cf168e11c904e07038251644b2018901 (MD5) Previous issue date: 2005-05 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os anticorpos monoclonais possuem diversasaplicações em transplantes, na composição de conjuntosde reativos para diagnóstico, grande variedade de doenças auto-imunes e, principalmente, na terapia do câncer. A tecnologia de produção de anticorpos monoclonais recombinantes revolucionou a geração de imunoglobulinas, possibilitando a obtenção de anticorpos humanizados dirigidos a uma grande variedade de antígenos específicos. A baixa seletividade das metodologias atuais para diagnóstico e terapia de neoplasiasconstitui um dos principais empecilhospara a prática oncológica. Nesse particular, a utilização de imunoglobulinas submetidas à engenharia genética já é uma realidade e significa um avanço estratégico, abrangendo cerca de 25% do mercado biofarmacêutico global de proteínas terapêuticas. Este trabalho aponta os aspectos fundamentais à concretização da metodologia de humanização de anticorpos por transplante das regiões determinantes de complementaridade – CDR, com ênfase em uma proposta de produção do anticorpo anti – CD20 contrao Linfoma Não-Hodgkin. A introdução do Instituto de Tecnologia emImunobiológicos - Bio-Manguinhos nesse promissor e importante mercado de biofármacos através da implantação da metodologia de humanização do anticorpo monoclonal murino anti-CD20 é objeto desta dissertação. Viabilizar sua produção torna-se extremamente importante, tanto para a identificação precisa e precoce da enfermidade, quanto para atender um segmento do mercado brasileiro ainda desprovido de tratamento abrangente e eficaz. A apresentação do estudo dos anticorpos, sua estrutura e características, o estudo dosdiferentes sistemas de expressão, cultivo, purificação,bem como a proposta de reestruturação e redimensionamento do Laboratório de Tecnologia de Anticorpos Monoclonais, parcerias, colaborações, recursos humanos necessários e aspectos de mercado, são aqui considerados. / Monoclonal antibodies (Mabs) have several applications in transplants, reagents for diagnosis, a great variety ofauto-immune diseases and mainly, in cancer therapy. Mabs production employing recombinant echnologymade a revolution in immunoglobulinsgeneration, enabling the production of humanized antibodiesthat recognize specific antigens. The low selectivity of the current techniquesfor neoplasm diagnosis and therapy is one of the major impediments for oncology practice. In this regard, the use of eneticallyengineered immunoglobulins has become a reality and meansa strategic development comprising around 25% of the global biopharmaceutical market. This work shows the most important aspects in Mabs humanization through complementary determining regions (CDR) graft methodology, emphasizing a proposal ofanti-CD20 Mab production against non-Hodgkin lymphoma. Introducing the Instituto de Tecnologia emImunobiológicos – Bio-Manguinhos in this important and promising biopharmaceutical market through the establishment of humanization methodology is the main object of this dissertation. Making humanized Mabs production feasible is veryimportant not only for the earlyand precise identification of illnesses, but also to meet a demand of the Brazilian market that still lacks comprehensive and efficient treatment. The study of Mabs, their structureand properties, expression systems, cultivation, purification, new dimensions and structure of the laboratory, partnerships, cooperation,human resources and market analysis are considered herein.