PERDIGÃO, Anne Carolinne Bezerra. Caracterização molecular dos vírus sincicial respiratório humano circulantes em Fortaleza-ceará durante cinco períodos epidêmicos consecutivos (2004-2008). 2009. 125 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-01-04T12:39:15Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_acbperdigão.pdf: 3269788 bytes, checksum: eff321085767d9a25b4cb27fb0afa18d (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-01T12:46:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_acbperdigão.pdf: 3269788 bytes, checksum: eff321085767d9a25b4cb27fb0afa18d (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-01T12:46:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_acbperdigão.pdf: 3269788 bytes, checksum: eff321085767d9a25b4cb27fb0afa18d (MD5) Previous issue date: 2009 / The human respiratory syncytial virus (HRSV) is the major agent of lower respiratory tract in children under two years old. HRSV is characterized antigenically into two groups: A and B, and each group has several subgroups. Glycoprotein G is primarily responsible for the antigenic variation between and within groups of viruses. The aims of this study were to characterize the epidemic periods and the antigenic and genomic diversity of circulating HRSV in Fortaleza, Ceará - Brazil, for five consecutive epidemic periods (2004-2008). The screening of positive samples to HRSV and other viruses analyzed, as the antigenic characterization of HRSV was carried out by indirect immunofluorescence. RT-nested-PCR followed by partial sequencing of the gene G was used for genomic characterization of HRSV. The HRSV was detected in 456 of 2885 samples (15.8%). The peak of the epidemic periods of HRSV occurred from March to May related to rainfall. A total of 282 HRSV (62.8%) were characterized antigenically, with 170 HRSVA (60.3%) and 112 HRSVB (39.7%). Both groups circulated throughout the period analyzed with a predominance of HRSVA in all years of study. A total of 250 HRSV (54.8%) were submitted to RT-nested-PCR with amplification of 133 and sequencing of 86. The genomic characterization of HRSV identified subgroups GA2 and GA5 for HRSVA and subgroups GB3 and BA for HRSVB. In the years 2004, 2005 and 2007 both subgroups of HRSVA circulated. In 2008 only GA2 circulated. In 2004, 2007 and 2008 only the subgroup BA was present. In 2005 only the GB3 circulated. The HRSV A showed a higher variability in nucleotide sequences, indicating a possible positive selective pressure. There were variations in the beginning, end and duration of each epidemic period of HRSV, as well as in the occurrence of groups and subgroups. / vírus sincicial respiratório humano (VSRh) é o agente viral mais freqüentemente relacionado a infecções do trato respiratório inferior em crianças menores de dois anos de idade. O VSRh é caracterizado antigenicamente em dois grupos: A e B, e cada grupo apresenta vários subgrupos. A glicoproteína G é a principal responsável pela a variação antigênica inter e intragrupos desse vírus. Os objetivos desse estudo foram caracterizar os períodos epidêmicos e a diversidade antigênica e genômica dos VSRh circulantes em Fortaleza, Ceará – Brasil, durante cinco períodos epidêmicos consecutivos (2004-2008). A imunofluorescência indireta (IFI) foi utilizada para a triagem de VSRh e de todos os vírus analisados e para a caracterização antigênica dos VSRh. A RT-nested-PCR seguida do seqüenciamento parcial do gene G foi utilizada para a caracterização gênomica dos VSRh. O VSRh foi detectado em 456 das 2885 (15.8%) amostras. O pico dos períodos epidêmicos de VSRh ocorreu nos meses de março a maio relacionado à ocorrência de chuvas. Um total de 282 VSRh (62,8%) foram caracterizados antigenicamente por IFI, sendo 170 VSRhA (60,3%) e 112 VSRhB (39,7%). Ambos os grupos circularam durante todo o período analisado sendo observado o predomínio de A em todos os anos. Um total de 250 VSRh (54,8%) foi submetido à RT-nested-PCR com amplificação de 133 e seqüenciamento de 86. A caracterização genômica dos VSRh identificou os subgrupos GA2 e GA5 para o VSRhA e os subgrupos GB3 e BA para o VSRhB. Esses quatro subgrupos co-circularam durante o ano de 2006. Nos anos de 2004, 2005 e 2007 verificou-se a presença dos dois subgrupos de VSRhA. Em 2008 somente o GA2 circulou. Em 2004, 2007 e 2008 somente o subgrupo BA esteve presente. Em 2005 somente o GB3 circulou. Os VSRhA apresentaram uma maior variabilidade nas seqüências nucleotídicas, indicando uma possível pressão seletiva positiva. Houve variações no ínicio, fim e duração de cada período epidêmico de VSRh, assim como na circulação de grupos e subgrupos.

Orientador: José Maurício Sforcin / Resumo: A própolis é um produto resinoso, elaborado pelas abelhas a partir de diferentes partes das plantas, e se destaca por suas inúmeras propriedades biológicas, e pela possibilidade de aplicação na indústria farmacêutica. Recentemente, nosso grupo tem estudado sua ação sobre monócitos – células do sistema fagocítico mononuclear que exercem importante função na resposta imune. Neste projeto, visamos investigar a possível ação moduladora da própolis na apresentação de antígenos por monócitos humanos, utilizando um antígeno infeccioso (subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli - EtxB), um antígeno tumoral (MAGE-1), o ácido retinóico (AR) e lipopolissacarídeo (LPS), simultaneamente ou não a própolis, avaliando o possível efeito citotóxico dos tratamentos, a expressão de receptores celulares (TLR-2, TLR-4, HLA-DR, CD40, CD80) e a produção de citocinas (TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12). A modulação da autofagia foi avaliada através da expressão de genes que codificam as proteínas Beclin-1 e LC3-II, utilizando a rapamicina simultaneamente ou não a própolis. A própolis não alterou a viabilidade dos monócitos humanos e exerceu efeito citoprotetor nas células incubadas com os estímulos. A própolis manteve a expressão basal dos receptores de superfície celular; porém, em associação com MAGE-1 e LPS, diminuiu a expressão de CD40 estimulada pelos antígenos isoladamente. Em associação com AR, a própolis manteve a ação do antígeno sobre os receptores. Já a associação da própolis co... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Após a resposta imune, a expansão dos linfócitos T CD4 é seguida de uma fase de retração chamada Morte Celular induzida por Ativação (AICD), para que a homeostasia seja reestabelecida. Nosso grupo demonstrou que DCs estimuladas com LPS produzem PGE2 que inibe a expressão de FASL e bloqueia a AICD dos linfócitos T CD4. Nossa hipótese é que a apresentação de antígenos em contexto de infecção tenha um impacto na expressão de FASL e na sobrevivência das células T CD4, de maneira dependente de TLRPGE2. Para comprovar nossa hipótese nós estudamos a apresentação de OVA in vitro e in vivo. Observamos que a adição de LPS durante a apresentação de OVA aumenta a ativação e proliferação das células T CD4 específicas. O pré-tratamento dos camundongos com Indometacina, um inibidor da enzima COX, reduz a frequência das células específicas através do aumento na expressão de FASL e da apoptose, mas sem interferir com a proliferação. Nós sugerimos que a PGE2 produzida em resposta ao LPS regule a sobrevivência dos linfócitos T CD4 durante a persistência do estímulo antigênico. / After immune response, expansion of antigen-specific CD4 T cells is followed by a contraction phase due to Activation-Induced Cell Death (AICD) to reestablish homeostasis. Our group demonstrated that LPS stimulated-DCs produce PGE2 that protects CD4 T cells from AICD by preventing TCR/CD3-mediated FASL upregulation. Our hypothesis is that antigen presentation in the context of infection impacts on FASL expression and survival of CD4 T cells, dependently on TLR-mediated PGE2 release. To approach our hypothesis we studied OVA presentation in vitro and in vivo. We observed that the addition of LPS during OVA presentation increased specific CD4+ T cells activation and proliferation. Pretreatment of mice with indomethacin, an inhibitor of COX enzyme, reduces the frequency of specific T cells by increasing FASL expression and apoptosis, but did not interfere with proliferation. We suggest that PGE2 produced in response to LPS regulates the survival of CD4 T lymphocytes during persistent antigen stimulation.

Anticorpos monoclonais (AcMo) contra proteínas do vírus da raiva (RABV) foram produzidos para adequar a caracterização antigênica dos isolados no Brasil. Foram selecionados dois isolados de morcegos insetívoros, sendo um de Nyctinomops laticaudatus e outro de Eptesicus furinalis que apresentaram perfis não compatíveis (NC) com os pré-estabelecidos. As suspensões virais foram adaptadas para crescimento em cultura de células N2A. Para o preparo de AcMo foram utilizadas como antígeno as ribonucleoproteínas dos isolados selecionados. Foram obtidos dois AcMo, o 3A7 e o 4E10. Analisando 57 isolados de RABV com esses AcMo, o 3A7 reagiu com 21 (36,84%) e o 4E10 com 25 (43,85%). Dos 13 isolados caracterizados como variante antigênica 3 (Desmodus rotundus) o 3A7 reagiu com 8 (61,53%) e o 4E10 com 11 (84,61%). Dos 9 isolados com perfil NC em morcegos o 3A7 reagiu com 5 (55,55%) e o 4E10 com 4 (44,44%). Os anticorpos produzidos poderão auxiliar na complementação do painel existente de caracterização antigênica o que poderá aprimorar a vigilância epidemiológica da doença. / Monoclonal antibodies (MAb) against the rabies virus (RABV) proteins were produced to improve the antigenic characterization of the isolates in Brazil. Two isolates from insectivorous bats were selected; one was from the species Nyctinomops laticaudatus and the other from Eptesicus furinalis, which showed non-compatible (NC) profiles from pre-established ones. The viral suspensions were adapted for growth in N2A cells. Ribonucleoproteins from selected isolates were used as antigen for the preparation of Mab. We obtained two Mab, the 3A7 and the 4E10. Of the 57 RABV isolates analyzed with these MAb, the 3A7 reacted with 21 (36.84%) and 4E10 with 25 (43.85%). Of the 13 isolates characterized as antigenic variant 3 (Desmodus rotundus), the 3A7 MAb reacted with 8 (61.53%) and 4E10 with 11 (84.61%). Of the nine isolates with the profile NC of bats the 3A7 reacted with 5 (55.55%) and the 4E10 with 4 (44.44%). The antibodies produced may help to complement the existing panel to antigenic characterization which could improve the disease epidemiological surveillance.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT) / A ausência de um modelo animal adequado de infecção crônica para estudo da cromoblastomicose experimental e o desconhecimento sobre as formas fúngicas infectantes de Fonsecaea pedrosoi estimularam a realização da presente investigação. Inicialmente, diferentes formas micelianas de F. pedrosoi, hifas, conídios e células conidiogênicas, foram testadas quanto ao seu potencial infectivo em camundongos BALB/c. Cada estrutura demonstrou capacidade distinta de sobrevida frente à resposta tecidual do hospedeiro. A transformação in vivo do inóculo fúngico para corpos escleróticos somente foi verificada nas infecções com células conidiogênicas. Neutrófilos parecem ser importantes no controle de F. pedrosoi, possivelmente pela degranulação e liberação de produtos tóxicos, enquanto macrófagos podem ser mais relevantes nos processos de clearance. A inoculação do fungo em único sítio produziu resposta inflamatória com formação de abscesso rico em fagócitos, ocorrendo eliminação da infecção em até dois meses. No entanto, coestímulo antigênico em dois sítios distintos, tais como pata s.c. e peritônio, respectivamente, com células fúngicas viáveis e inviáveis, nas diferentes linhagens de camundongos e animais knockouts, provocou a formação de lesões multifocais ricas em histiócitos e infecção persistente por F. pedrosoi, ocorrendo cura clínica e micológica desses animais, em geral, após 4 meses. Nos animais coestimulados, quando o foco primário (abscesso rico em neutrófilos) desaparecia, a migração de neutrófilos se intensificava para o sítio secundário (lesões focais ativas), culminando com a eliminação fúngica. Tais dados corroboraram para hipótese de atuação individualizada da resposta imune em focos múltiplos, porém com resolução, sistemicamente, coordenada das lesões. Após imunização das mucosas e infecção da pata com células de F. pedrosoi também foi verificada maior duração das lesões infecciosas, indicando que a apresentação antigênica de sítios distintos poderia estar envolvida com mecanismos tolerogênicos aos antígenos fúngicos. Camundongos CD4 KO que receberam duplo-estímulo, embora manifestassem agravamento das lesões nos períodos iniciais pós-inoculação fúngica, controlaram a infecção mais tardiamente. Progressão exarcebada e agravamento da infecção foram verificados em animais KO CD8 coestimulados. Camundongos co-estimulados apresentaram lesões com perfil anatomopatológico similar, no entanto, os animais IL-10 KO não desenvolveram infecção prolongada após coestimulação. Animais XID coestimulados desenvolveram infecção crônica, o que demonstrava a possibilidade das células B1 atuarem antagonicamente à resposta imunossupressora. Em outro estudo, selecionamos uma cepa bacteriana com propriedades antagônicas aos fungos filamentosos, identificada como B. subtilis, para ser utilizada em ensaios de interação com a cepa de F. pedrosoi. Em cocultivos, verificamos alterações celulares, como modificação das hifas para formas artroconidiadas, produção de clamidoconídios terminais e indução da síntese de melanina fúngica. Tais células cocultivadas foram inoculadas em camundongos, sendo os clamidoconídios terminais mais resistentes in vivo a ação dos fagócitos. No último experimento, utilizamos culturas axênicas de F. pedrosoi, mantidos em cultivos por seis meses. Formas fúngicas variadas, tais como células arredondadas, clamidoconídios terminais e intercalares, com parede celular composta por múltiplas camadas, foram analisadas por microscopia óptica e eletrônica. Essas células fúngicas foram inoculadas em camundongos BALB/c, produzindo infecção crônica, principalmente em grupo de animais infectados em dois sítios. Por fim, nossos achados evidenciaram que o desenvolvimento de um modelo murino adequado para cromoblastomicose depende de fatores ligados ao parasito e hospedeiro. Células fúngicas ou formas, potencialmente, infectantes devem ser utilizadas de modo preferencial no desenvolvimento dos modelos experimentais, devendo os mecanismos de imunossupressão, como a coestimulação antigênica, ser empregados como “ferramenta auxiliar” para ampliar as chances de sucesso na obtenção de lesões crônicas em animais hígidos. / This study was prompted by the lack of a satisfactory chronic infection animal model for studies of experimental chromoblastomycosis and the fact that very little is known about the infective fungal forms of Fonsecaea pedrosoi. First, we investigated the infective potential of different mycelial forms of F. pedrosoi, hyphae, conidia and conidiogenous cells, in BALB/c mice. The extent to which each structure could survive the host tissue response was found to vary. In vivo transformation of the fungal inoculum into muriform cells was only observed when the mice were infected with conidiogenous cells. Neutrophils appeared to play an important role in the control of F. pedrosoi, possibly by degranulating and releasing toxic products, while macrophages may be of greater importance in clearance. Fungal inoculation of a single site led to an inflammatory response accompanied by the formation of abscesses rich in phagocytes. The fungus was eliminated efficiently in up to two months. However, antigenic co-stimulation with viable and nonviable fungal cells in two different sites, such as the footpad (s.c.) and peritoneum, led to the formation of multifocal lesions rich in histiocytes and to prolonged F. pedrosoi infection in different strains of mice and knockout animals. Clinical and mycological cure in these animals generally occurred after 4 months. When the primary focus in the co-stimulated animals (an abscess rich in neutrophils) disappeared, neutrophil migration to the secondary site (active multifocal lesions) increased, culminating in the elimination of the fungi. These data support the hypothesis that multifocal infections show individual immune responses, while systemic resolution of lesions is coordinated as a whole. After the mucosae had been immunized and footpads had been infected with F. pedrosoi cells, infectious lesions were found to be more prolonged, indicating that antigen presentation at different sites may be involved in peripheral tolerance mechanisms. Although lesions in co-stimulated CD4 KO mice worsened during the initial period following inoculation with the fungus, the mice were found to control the infection later. Exacerbated inflammatory progression and a worsening of the infection were observed in co-stimulated CD8 KO animals. Lesions in co-stimulated KO mice had a similar pathologic profile, but IL-10 KO animals did not developed prolonged infection after co-stimulation. Co-stimulated xid mice developed chronic infection, showing that B1 cells may have an antagonistic effect on the immunosuppressive response. In another study, we selected the bacterial strain B. subtilis, which has known antagonistic properties against filamentous fungi, for use in interaction assays with the F. pedrosoi strain. The main cell changes observed after co-culture were the transformation of hyphae into arthroconidial forms and the production of terminal chlamydoconidia. The induction of synthesis of fungal melanin was also observed. Fungal cells from co-cultures were inoculated into mice. The chlamydoconidia from these co-cultures were more resistant in vivo to the actions of phagocytes. In the final experiment, we used axenic F. pedrosoi cultures that had been maintained for six months. Various fungal forms, such as round cells and terminal and intercalary chlamydoconidia, with cell walls made up of multiple layers, were found in aged cultures. When inoculated into BALB/c mice, these fungal forms produced chronic infection, primarily in the group of animals infected at two sites. Our findings show that the development of a satisfactory murine model of chromoblastomycosis depends on factors associated with the parasite and the host. Potentially infective fungal cells should preferably be used when developing experimental models, and immunosuppression mechanisms such as antigenic costimulation should be used as “auxiliary tools” to increase the likelihood of obtaining chronic lesions in healthy animals. / CNPq: 14170/2004-9 / FAPEMAT: 002.138/2007 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Os fibrócitos foram inicialmente identificados pelo seu recrutamento rápido para os tecidos lesionados e por atuar diretamente na resposta imune através do reconhecimento, apresentação antigênica e produção de citocinas e quimiocinas. Segundo Grab (2004) fibrócitos podem participar da resposta imune na leishmaniaose e por isso no presente estudo propomos analisar a resposta celular e apresentação antigênica dos fibrócitos na infecção por L. (L.) amazonensis. Para os experimentos in vivo camundongos C57BL/6 e knockout para o receptor TLR-2 foram inoculados na derme auricular com 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e 1, 7, 15 dias após a infecção as regiões de inóculo e os linfonodos foram retirados e processados para citometria de fluxo. Para os experimentos in vitro fibrócitos foram obtidos de mononucleares do sangue periférico de camundongos C57BL/6. Os fibrócitos foram avaliados quanto às suas características morfológicas e fenotípicas, infecção, expressão de MHC-II/B7-1/B7-2 e ativação de linfócitos T CD4+. As análises na região de inóculo mostraram o aumento no percentual de fibrócito na derme de camundongos após 15 dias de infecção tanto em animais C57BL/6 quanto em animais KO TLR-2. Neste sítio, os fibrócitos produziram citocinas e expressaram MHC-II, B7-1 e B7-2 podendo participar da resposta imune. As análises no linfonodo mostraram a existência de um alto percentual de fibrócitos nos animais controle, contudo, após infecção este percentual foi reduzido. Após infecção verificamos que os fibrócitos de animais WT C57BL/6 foram capazes de produzir as citocinas IL-4, IL-10 e IFN- durante o primeiro dia. Entretanto, na ausência de TLR-2 os fibrócitos presentes no linfonodo produziram TNF-α e IFN- que podem estar relacionadas com a ativação celular e aumento da capacidade de apresentação antigênica destas células durante a infecção. No linfonodo verificamos que os fibrócitos podem participar da apresentação antigênica após a infecção por L. (L.) amazonensis. Contudo, nos linfonodos de animais WT C57BL/6 observamos a redução significativa no percentual destas células expressando MHC-II e B7-1, o que pode estar relacionada a presença do TLR-2. Nos ensaios in vitro fibrócitos de camundongos C57BL/6 apresentaram alta capacidade endocítica, eliminaram os parasitas nas primeiras 24 horas de infecção, expressaram MHC-II/B7-1/B7-2 e foram capazes de ativar linfócitos T CD4+. Com isso, nossos resultados sugerem que os fibrócitos podem atuar na resposta celular e na apresentação antigênica durante a infecção por L. (L.) amazonensis, contudo estas funções podem ser moduladas pela participação do TLR-2 e pelo microambiente onde estes se encontram. / Fibrocytes were initially identified by their fast recruitment to the injured tissues and by acting directly on the immune response through recognition, antigen presentation and production of cytokines and chemokines. According to Grab et al., 2004 fibrocytes may participate in the immune response to leishmaniasis and therefore, in this study we propose to examine the cellular response and antigen presentation of fibrocytes in infection by L. (L.) amazonensis. In vivo experiments C57BL/6 and knockout receptor TLR-2 animals were inoculated in the ear dermis with 105 promastigotes of L. (L.) amazonensis and 1,7, 15 days after infection ears and lymph nodes were removed and processed for flow cytometry. For in vitro experiments peripheral blood fibrocytes from C57BL/6 mice were evaluated for their morphological and phenotypic, MHC-II/B7-1/B7-2 expression and ability to activate CD4+ T cells. The analyses in the inoculum region showed significant increase in the percentage of fibrocyte in the C57BL/6 and TLR-2 knockout mice after 15 days of infection. At this site fibrocytes part of the immune response by cytokines production and MHC-II, B7-1 and B7-2 expression. The analyses in the lymph node showed the existence of a high percentage of fibrocytes in the control animals, however, after infection, this percentage was reduced. After infection it was verified that the fibrocytes of C57BL/6 were able to produce cytokines IL-4, IL-10 and IFN- during the first days. However, in the absence of TLR-2 fibrocytes in the lymph produced TNF-α and IFN- that may be related to cell activation and increased antigen presentation capacity of these cells during infection. In the lymph node it was found that fibrocytes may participate in antigen presentation after infection with L. (L.) amazonensis. However, in lymph nodes of mice C57BL/6 it was observed the significant reduction in the percentage of those cells expressing MHC-II, B7-1, which can be related to the presence of the TLR-2. In vitro fibrocytes of C57BL/6 showed high endocytic capacity, eliminating the parasites within the first 24 hours after infection, and expressed MHC-II/B7-1/B7-2 being were able to activate CD4 + T cells. Thus, our results suggest that fibrocytes may act in cellular response and antigen presentation during infection by L. (L.) amazonensis, however these functions can be modulated by the involvement of TLR-2 and the in microenvironment.

Os fibrócitos foram inicialmente identificados pelo seu recrutamento rápido para os tecidos lesionados e por atuar diretamente na resposta imune através do reconhecimento, apresentação antigênica e produção de citocinas e quimiocinas. Segundo Grab (2004) fibrócitos podem participar da resposta imune na leishmaniaose e por isso no presente estudo propomos analisar a resposta celular e apresentação antigênica dos fibrócitos na infecção por L. (L.) amazonensis. Para os experimentos in vivo camundongos C57BL/6 e knockout para o receptor TLR-2 foram inoculados na derme auricular com 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e 1, 7, 15 dias após a infecção as regiões de inóculo e os linfonodos foram retirados e processados para citometria de fluxo. Para os experimentos in vitro fibrócitos foram obtidos de mononucleares do sangue periférico de camundongos C57BL/6. Os fibrócitos foram avaliados quanto às suas características morfológicas e fenotípicas, infecção, expressão de MHC-II/B7-1/B7-2 e ativação de linfócitos T CD4+. As análises na região de inóculo mostraram o aumento no percentual de fibrócito na derme de camundongos após 15 dias de infecção tanto em animais C57BL/6 quanto em animais KO TLR-2. Neste sítio, os fibrócitos produziram citocinas e expressaram MHC-II, B7-1 e B7-2 podendo participar da resposta imune. As análises no linfonodo mostraram a existência de um alto percentual de fibrócitos nos animais controle, contudo, após infecção este percentual foi reduzido. Após infecção verificamos que os fibrócitos de animais WT C57BL/6 foram capazes de produzir as citocinas IL-4, IL-10 e IFN- durante o primeiro dia. Entretanto, na ausência de TLR-2 os fibrócitos presentes no linfonodo produziram TNF-α e IFN- que podem estar relacionadas com a ativação celular e aumento da capacidade de apresentação antigênica destas células durante a infecção. No linfonodo verificamos que os fibrócitos podem participar da apresentação antigênica após a infecção por L. (L.) amazonensis. Contudo, nos linfonodos de animais WT C57BL/6 observamos a redução significativa no percentual destas células expressando MHC-II e B7-1, o que pode estar relacionada a presença do TLR-2. Nos ensaios in vitro fibrócitos de camundongos C57BL/6 apresentaram alta capacidade endocítica, eliminaram os parasitas nas primeiras 24 horas de infecção, expressaram MHC-II/B7-1/B7-2 e foram capazes de ativar linfócitos T CD4+. Com isso, nossos resultados sugerem que os fibrócitos podem atuar na resposta celular e na apresentação antigênica durante a infecção por L. (L.) amazonensis, contudo estas funções podem ser moduladas pela participação do TLR-2 e pelo microambiente onde estes se encontram. / Fibrocytes were initially identified by their fast recruitment to the injured tissues and by acting directly on the immune response through recognition, antigen presentation and production of cytokines and chemokines. According to Grab et al., 2004 fibrocytes may participate in the immune response to leishmaniasis and therefore, in this study we propose to examine the cellular response and antigen presentation of fibrocytes in infection by L. (L.) amazonensis. In vivo experiments C57BL/6 and knockout receptor TLR-2 animals were inoculated in the ear dermis with 105 promastigotes of L. (L.) amazonensis and 1,7, 15 days after infection ears and lymph nodes were removed and processed for flow cytometry. For in vitro experiments peripheral blood fibrocytes from C57BL/6 mice were evaluated for their morphological and phenotypic, MHC-II/B7-1/B7-2 expression and ability to activate CD4+ T cells. The analyses in the inoculum region showed significant increase in the percentage of fibrocyte in the C57BL/6 and TLR-2 knockout mice after 15 days of infection. At this site fibrocytes part of the immune response by cytokines production and MHC-II, B7-1 and B7-2 expression. The analyses in the lymph node showed the existence of a high percentage of fibrocytes in the control animals, however, after infection, this percentage was reduced. After infection it was verified that the fibrocytes of C57BL/6 were able to produce cytokines IL-4, IL-10 and IFN- during the first days. However, in the absence of TLR-2 fibrocytes in the lymph produced TNF-α and IFN- that may be related to cell activation and increased antigen presentation capacity of these cells during infection. In the lymph node it was found that fibrocytes may participate in antigen presentation after infection with L. (L.) amazonensis. However, in lymph nodes of mice C57BL/6 it was observed the significant reduction in the percentage of those cells expressing MHC-II, B7-1, which can be related to the presence of the TLR-2. In vitro fibrocytes of C57BL/6 showed high endocytic capacity, eliminating the parasites within the first 24 hours after infection, and expressed MHC-II/B7-1/B7-2 being were able to activate CD4 + T cells. Thus, our results suggest that fibrocytes may act in cellular response and antigen presentation during infection by L. (L.) amazonensis, however these functions can be modulated by the involvement of TLR-2 and the in microenvironment.

Após a resposta imune, a expansão dos linfócitos T CD4 é seguida de uma fase de retração chamada Morte Celular induzida por Ativação (AICD), para que a homeostasia seja reestabelecida. Nosso grupo demonstrou que DCs estimuladas com LPS produzem PGE2 que inibe a expressão de FASL e bloqueia a AICD dos linfócitos T CD4. Nossa hipótese é que a apresentação de antígenos em contexto de infecção tenha um impacto na expressão de FASL e na sobrevivência das células T CD4, de maneira dependente de TLRPGE2. Para comprovar nossa hipótese nós estudamos a apresentação de OVA in vitro e in vivo. Observamos que a adição de LPS durante a apresentação de OVA aumenta a ativação e proliferação das células T CD4 específicas. O pré-tratamento dos camundongos com Indometacina, um inibidor da enzima COX, reduz a frequência das células específicas através do aumento na expressão de FASL e da apoptose, mas sem interferir com a proliferação. Nós sugerimos que a PGE2 produzida em resposta ao LPS regule a sobrevivência dos linfócitos T CD4 durante a persistência do estímulo antigênico. / After immune response, expansion of antigen-specific CD4 T cells is followed by a contraction phase due to Activation-Induced Cell Death (AICD) to reestablish homeostasis. Our group demonstrated that LPS stimulated-DCs produce PGE2 that protects CD4 T cells from AICD by preventing TCR/CD3-mediated FASL upregulation. Our hypothesis is that antigen presentation in the context of infection impacts on FASL expression and survival of CD4 T cells, dependently on TLR-mediated PGE2 release. To approach our hypothesis we studied OVA presentation in vitro and in vivo. We observed that the addition of LPS during OVA presentation increased specific CD4+ T cells activation and proliferation. Pretreatment of mice with indomethacin, an inhibitor of COX enzyme, reduces the frequency of specific T cells by increasing FASL expression and apoptosis, but did not interfere with proliferation. We suggest that PGE2 produced in response to LPS regulates the survival of CD4 T lymphocytes during persistent antigen stimulation.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-06T16:41:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-tese-WanúziaKeylaMirandaMoreira.pdf: 4609405 bytes, checksum: 9cc969ee66d9060546cf0a2611ca597b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-06T16:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-tese-WanúziaKeylaMirandaMoreira.pdf: 4609405 bytes, checksum: 9cc969ee66d9060546cf0a2611ca597b (MD5) Previous issue date: 2011-12-15 / As lesões pré-neoplásicas e neoplásicas do colo uterino induzidas pelo Papilomavírus humano (HPV) estão relacionadas a falhas nos mecanismos imunes de apresentação antigênica. Ciente que alterações na expressão das proteínas do sistema HLA constituem um fator de risco para o desenvolvimento do câncer de colo uterino, o presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão da proteína HLA-DRB1 nas células de Langerhans em portadoras de lesões intraepiteliais cervicais, relacionando-a aos tipos de HPV. Esteestudo foi realizado no Centro Especializado de Diagnóstico do Câncer do estado da Paraíba, no período de janeiro de 2009 a janeiro de 2010 e aprovado pelo comitê de ética. Neleforam incluídas 123 portadoras de lesão de baixo grau e 105 de lesão de alto grau, confirmadas histologicamente depois de submetidas à colposcopia com biópsia e coleta de amostra para PCR. Obtiveram-se três secções histológicas: uma para diagnóstico histopatológico e duas para imuno-histoquímica usando-se o S100 e HLA-DRB1. A imunoexpressão foi quantificada por morfometria através de software específico e relacionadas ao tipo de HPV usando-se o teste U de Mann-Whitney. Para relacionar as atipias epiteliais ao tipo de HPV usou-se o teste qui-quadrado. Nestetrabalho, apenas tipos virais de alto risco foram identificados predominando o 16 (48,1%), 18 (24,6%) e 31 (19,3%), inclusive em lesões intraepiteliais de baixo grau. Constatou-se menor imunoexpressão da HLA-DR que da S100. As portadoras do HPV 31 mostraram redução estatisticamente significativa da expressão de HLA-DRB1, contudo,não houve diferença estatísticamente significativa na expressão de HLA-DRB1 entre lesões intraepiteliais de baixo e alto grau. As portadoras de lesão intraepitelial com PCR negativas igualmente apresentaram expressão de HLA-DRB1. O presente estudo possibilitou observar que a expressão da proteína HLA-DRB1 nas células de Langerhans se mostrou reduzida nas lesões intraepiteliais induzidas pelo HPV 31. / Cervical intraepithelial lesions induced by Human papillomavírus are related to failure in antigen presentation mechanisms. Aware that changes in HLA protein expression is a risk factor for the development of cervical cancer, the aim of this study is to evaluate the HLA-DRB1 expression on Langerhans cells in women with intraepithelial lesions and oncogenic HPV types. ThisstudywasconductedatSpecializedCenterforCancerDiagnosisofParaíba, during January 2009 still January 2010andapprovedbytheethicscommittee. Were included 123 patients with low grade SIL and 105 with high-grade SIL, histopathologically confirmed after undergoing colposcopy with biopsy and PCR collects. Three histological sections were obtained: one for histolopathologic diagnostic and two for immunohistochemistry using S100 and HLA-DRB1. The immunostaining was quantified by morphometry using specific software and related to HPV type by U Mann- Whitney test. To relate HPV type with epithelial atypia was used qui-square test. In thiswork,only high-risk HPV were identified, predominantly 16(48,1%), 18(24,6%) e 31(19,3%), even in low grade intraepithelial lesions. The immunoexpression of S100 was higher than HLA-DRB1. There was no difference on HLA-DRB1 expression between low and high grade intraepithelial lesions. The bearers of intraepithelial lesions with negative PCR also demonstrated HLA-DRB1 expression. Patients with 31 HPV showed a significantly lower expression of HLA-DRB1. Thus, thisstudyallowedobserving that the expression of HLA-DRB1 showed to be reduced in cervical lesions induced by 31 HPV.

Orientador: Domingos da Silva Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:33:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_Claudiade_D.pdf: 2791356 bytes, checksum: 7830cb1ece9ec9ac3c34c2794b264c93 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Escherichia coli é um membro comensal da microbiota de animais, porém podem causar doenças desde diarréias até sepses. A caracterização dos seus antígenos de superfície O (somático) e H (flagelar) auxilia na determinação de linhagens patogênicas dentro da espécie. Contudo, algumas bactérias não expressam flagelo in vitro, demonstrado que a amplificação do gene fliC, a análise dos fragmentos de polimorfismo (PCR-RFLP) e sequenciamento podem ser utilizadas para identificação dos antígenos H, em substituição à sorologia convencional. Até meados de 1980, pensava-se que, diferentemente da Salmonella, E. coli possui um único gene para expressão de flagelina (fliC), mas algumas amostras podem conter genes para expressão de flagelina flkA, fllA, flmA, flnA e fljA (repressor de fliC). Em nosso trabalho, analisamos 31 amostras de E. coli isolados de animais e alimentos que apresentavam o fenótipo HNT em ensaios de sorologia. Utilizamos PCR-RFLP e sequenciamento para descrever novos genes para flagelina, da qual foram obtidos antissoros. Identificamos por PCR e sequenciamento os genes responsáveis pela variação de fase fljA, flkA e flmA, realizamos experimentos de motilidade para determinar a variação de fase flagelar e detectar a expressão dos genes através de RT-PCR. Dezessete amostras tiveram seus antígenos H caracterizados, sendo nove caracterizadas por PCR-RFLP: H2 (duas amostras) H16 (duas amostras), H34 (três amostras), H33 (uma amostra) e H38 (uma amostra). Na análise de sequenciamento identificamos duas amostras portadoras do gene fliCh25, duas amostras fliCh7 e uma amostra apresentando fliCh32. Três novos genes para flagelina foram descritos: fliCh2', fliC4c, fliC40c. Identificamos o gene fljA em duas amostras HNT (3C e 4C) e na amostra padrão H35. O gene das amostras HNT apresentaram homologia ao fljA de Salmonella enterica, cuja variação de fase é bem estabelecida. As amostras padrão H11, H35, H40 e H47, bem como as amostras HNT 3C e 4C foram positivas para o gene flmA. As amostras padrão H3 e H53 são portadoras do gene flkA, contudo apenas a amostra H53 apresentou fljA. A amostra H54 é portadora de fljA e flmA. Nenhuma amostra H padrão mostrou variação de fase, diferentemente da literatura, sugerindo a perda da capacidade de variar a fase flagelar. A amostra 4C mostrou variação de fase positiva quando induzida em meios de cultura contendo antissoros anti-H48, anti-H54 e anti-H4C. Do mesmo modo, a detecção dos RNAm em diferentes condições de cultura confirmou a variação de fase. Como resultado um esquema de identificação para detecção de grupos de antígenos H e identificação de fliC foi testado. A técnica de fliC-RFLP provou ser eficiente e rápida, auxiliando a sorologia clássica para detecção de antígenos H de E. coli. Um modelo geral de variação de fase da amostra 4C é expresso por fliCoff + flmAon ? fliCon + flmAoff. Além disso, nós verificamos que a amostra 4C apresenta um gene novo para expressão de flagelina. Este trabalho é pioneiro em relação à variação de fase flagelar, demonstrando uma nova associação entre os antígenos H48 e H54 / Abstract: Escherichia coli are a species of microflora, and characterization of the cell surface lipopolysaccharide O antigen and the flagellar H antigen allow the grouping of pathogenic clones within this species. Moreover, some bacteria in vitro do not obtain to express its flagella, demonstrated that PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and sequencing analysis has been used for the identification of these antigens, in substitution of traditional serology. Moreover, until middle of years 80, are believed, differently of the Salmonella, E. coli possesss an only gene for flagelin expression (fliC), but some s/strains can contain genes for flagellin expression flkA, fllA, flmA, flnA and fljA (repressor of fliC). In this work, we analyzed 31 strains of E. coli isolated from animals and foods that presented HNT phenotype in serology assays. We use PCR-RFLP and sequencing to describe new genes for flagellin, of which antiserum were obtained. We identify for PCR and sequencing the genes for phase variation fljA, flkA and flmA, we carry through motility experiments to determine the flagellar phase variation and to detect the expression of the genes (RNAm) through RT-PCR. Seventeen strains had had its H antigen characterized and nine of then were characterized for PCR-RFLP: H2 (two strains) H16 (two strains), H34 (three strains), H33 (one strain) and H38 (one strain). Through sequencing analysis we identify to two carrying strains of the gene fliCh25, two strains fliCh7 and one strain presenting fliCh32. Three new genes for flagellin had been described: fliCh2', fliC4c, fliC40c. Using PCR and sequencing, we identify fljA gene in two strains HNT (3C and 4C) and in the H35 control strain. The HNT genes showed homology to fljA of Salmonella enterica, whose variation of phase well is established. The control strains H11, H35, H40 and H47, as well as HNT 3C and 4C strains were positive for flmA gene. The control strains H3 and H53 are carrying of flkA gene, however only the H53 strain presented fljA. The H54 control strain is carrying of fljA and flmA. No H control strain showed phase variation, differently of literature, suggesting the loss of the capacity to flagellar phase variation. The 4C strain showed positive phase variation when cultured with antiserum anti-H48, anti-H54 and anti-H4C. In a similar way, the detention of RNAm in different conditions of culture confirmed the phase variation. As a result, an identification scheme was tested to deduce H antigen groups and new genes of fliC. The fliCRFLP technique proved to be faster than classic serotyping for the deduction of the E. coli H antigen, characterizing the antigens with few days and indicating new putative genes. Thus, a general model for flagellar phase variation in 4C strain can be expressed as fliCoff + flmAon ? fliCon + flmAoff. In addition, we found that strains 3C and 4C express unidentified flagellin antigens. This is the first report of flagellar phase variation in wild E. coli strains. We have also provided evidence that strain 4C, identified here for the first time, expresses three flagellar antigens, H48, H54 and a previously unidentified flagellin / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular