O splicing alternativo do pré-mRNA de BCL-X produz duas isoformas de mRNAs com funções antagônicas, a pró-apoptótica BCL-XS e a anti-apoptótica BCL-XL, cujo balanço regula a homeostasia celular. Entretanto, o mecanismo que regula esse processamento ainda é desconhecido. Nesse trabalho, nós identificamos e caracterizamos um longo RNA não codificador de proteínas (lncRNA) nomeado INXS, que é transcrito a partir da fita oposta do locus genômico de BCL-X, sendo menos abundante em linhagens celulares tumorais e tecidos tumorais de pacientes quando comparados com os respectivos pares não tumorais. INXS é um RNA unspliced de 1903 nts, é transcrito pela RNA Polimerase II, possui cap 5\', está enriquecido na fração nuclear das células e se liga à proteína Sam68 do complexo modulador de splicing. O tratamento de células tumorais 786-O com cada um de três agentes indutores de apoptose aumentou a expressão endógena do INXS, levando ao aumento expressivo da proporção entre os mRNAs de BCL-XS / BCL-XL, e ativação das caspases 3, 7 e 9. Estes efeitos foram anulados na presença do knockdown do INXS. Da mesma forma, a superexpressão ectópica do INXS causou uma mudança no splicing favorecendo a isoforma BCL-XS e ativação das caspases, aumentando os níveis da proteína BCL-XS e conduzindo as células à apoptose. Utilizando um modelo in vivo, cinco injeções intra-tumorais do INXS durante 15 dias causaram uma regressão acentuada no volume dos xenotumores. Portanto, INXS é um lncRNA que induz a apoptose, sugerindo que essa molécula seja um possível alvo a ser explorado na terapia contra o câncer. / BCL-X mRNA alternative splicing generates pro-apoptotic BCL-XS or anti-apoptotic BCL-XL, whose balance regulates cell homeostasis. However, the mechanism that regulates the splice shifting is incompletely understood. Here, we identified and characterized a long noncoding RNA (lncRNA) named INXS, transcribed from the opposite genomic strand of BCL-X, that was less abundant in tumor cell lines and patient tumor tissues compared with non-tumors. INXS is an unspliced 1903 nt-long RNA, is transcribed by RNA Polymerase II, 5\'-capped, nuclear enriched and binds Sam68 splicing-modulator. The treatment of tumor cell line 786-O with each of three apoptosis-inducing agents increased endogenous INXS lncRNA, increased BCL-XS / BCL-XL mRNA ratio, and activated caspases 3, 7 and 9. These effects were abrogated in the presence of INXS knockdown. Similarly, ectopic INXS overexpression caused a shift in splicing towards BCL-XS and activation of caspases, increasing the levels of BCL-XS protein and then leading the cells to apoptosis. In a mouse xenograft model, five intra-tumor injections of INXS along 15 days caused a marked regression in tumor volume. INXS is an lncRNA that induces apoptosis, suggesting that INXS is a possible target to be explored in cancer therapies.

O gene, uma seqüência de nucleotídeos necessária para a síntese de moléculas funcionais, é transcrito e regulado por um conjunto de processos e fatores extremamente complexos. Entender o momento e o tecido em que os genes são expressos, as isoformas funcionais, as regiões controladoras e os fatores envolvidos na regulação da expressão de cada gene é um dos grandes desafios da biologia molecular moderna. Hoje, com a enorme quantidade de informações de seqüências genômicas e de transcriptomas, aliado ao desenvolvimento de métodos computacionais para agrupar e analisar estes dados em larga escala, o estudo dos fenômenos relacionados à transcrição e regulação gênica está passando por uma revolução. Por exemplo, é possível medir, concomitantemente, a expressão gênica de milhares de genes em diferentes tecidos, assim como identificar diversos fenômenos que atuam nestes genes. Neste trabalho nós desenvolvemos e aplicamos métodos computacionais no estudo de quatro temas envolvendo aspectos chave da transcrição e regulação gênica. No primeiro trabalho, nós abordamos a expressão gênica tecido-específica através do estudo dos genes expressos no cérebro e em dez regiões cerebrais de camundongo. No segundo trabalho, nós identificamos seqüências potencialmente envolvidas no controle da transcrição gênica através do estudo de motivos sobre representados na região promotora dos genes de receptores olfativos. No terceiro trabalho, analisamos o transcriptoma humano quanto a presença de eventos de retenção de intron, um tipo de splicing alternativo. No quarto trabalho, nós abordamos a complexidade do transcriptoma e a regulação da expressão gênica através do estudo de pares de genes senso-antisenso em humanos e camundongos. Em todos os trabalhos, obtivemos resultados que nos permitiram tirar conclusões específicas sobre cada fenômeno estudado e nos mostraram a importância de estudá-los através de uma abordagem em larga escala. Adicionalmente, verificamos que os nossos métodos computacionais foram eficientes e adequados para o estudo da transcrição e regulação gênica em Homo sapiens e Mus musculus. / Genes, nucleotide sequences necessary for the synthesis of functional molecules, are transcribed and regulated by extremely complex cellular and molecular processes. To understand when and in which tissues the genes are expressed, their functional isoforms, control regions and the factors involved in gene regulation is one of major challenges of modern molecular biology. Today, the availability of complete genome sequences and transcriptomes, together with the development of new computational methods allows the study of phenomena related to the transcription and gene regulation in a large scale. For example, it is possible to quantify, concomitantly, gene expression of thousands of genes in different tissues and analyze different aspects of their regulation. In this work we developed and applied computational methods to the study of four key aspects of gene transcription and regulation. In the first study, we addressed tissue specific gene expression through the study of genes that are preferentially expressed in the brain and ten different mouse brain regions. In the second study, we identified sequences that are potentially involved in the control of gene transcription through the study of motifs that are over represented in the promoter region of olfactory receptor genes. In the third study, we browsed the human for the presence of intron retention, a type of alternative splicing. In the fourth study, we addressed the transcriptoma complexity and gene expression regulation through the study of pair of sense-antisense genes in human and mouse. In all studies, our results allowed us to make specific conclusions about each phenomenon analyzed which showed us the importance of a large scale approach. In addition, we verified that our computational methods can be efficiently applied to the study of transcription and gene regulation in Homo sapiens and Mus musculus.

O splicing alternativo do pré-mRNA de BCL-X produz duas isoformas de mRNAs com funções antagônicas, a pró-apoptótica BCL-XS e a anti-apoptótica BCL-XL, cujo balanço regula a homeostasia celular. Entretanto, o mecanismo que regula esse processamento ainda é desconhecido. Nesse trabalho, nós identificamos e caracterizamos um longo RNA não codificador de proteínas (lncRNA) nomeado INXS, que é transcrito a partir da fita oposta do locus genômico de BCL-X, sendo menos abundante em linhagens celulares tumorais e tecidos tumorais de pacientes quando comparados com os respectivos pares não tumorais. INXS é um RNA unspliced de 1903 nts, é transcrito pela RNA Polimerase II, possui cap 5\', está enriquecido na fração nuclear das células e se liga à proteína Sam68 do complexo modulador de splicing. O tratamento de células tumorais 786-O com cada um de três agentes indutores de apoptose aumentou a expressão endógena do INXS, levando ao aumento expressivo da proporção entre os mRNAs de BCL-XS / BCL-XL, e ativação das caspases 3, 7 e 9. Estes efeitos foram anulados na presença do knockdown do INXS. Da mesma forma, a superexpressão ectópica do INXS causou uma mudança no splicing favorecendo a isoforma BCL-XS e ativação das caspases, aumentando os níveis da proteína BCL-XS e conduzindo as células à apoptose. Utilizando um modelo in vivo, cinco injeções intra-tumorais do INXS durante 15 dias causaram uma regressão acentuada no volume dos xenotumores. Portanto, INXS é um lncRNA que induz a apoptose, sugerindo que essa molécula seja um possível alvo a ser explorado na terapia contra o câncer. / BCL-X mRNA alternative splicing generates pro-apoptotic BCL-XS or anti-apoptotic BCL-XL, whose balance regulates cell homeostasis. However, the mechanism that regulates the splice shifting is incompletely understood. Here, we identified and characterized a long noncoding RNA (lncRNA) named INXS, transcribed from the opposite genomic strand of BCL-X, that was less abundant in tumor cell lines and patient tumor tissues compared with non-tumors. INXS is an unspliced 1903 nt-long RNA, is transcribed by RNA Polymerase II, 5\'-capped, nuclear enriched and binds Sam68 splicing-modulator. The treatment of tumor cell line 786-O with each of three apoptosis-inducing agents increased endogenous INXS lncRNA, increased BCL-XS / BCL-XL mRNA ratio, and activated caspases 3, 7 and 9. These effects were abrogated in the presence of INXS knockdown. Similarly, ectopic INXS overexpression caused a shift in splicing towards BCL-XS and activation of caspases, increasing the levels of BCL-XS protein and then leading the cells to apoptosis. In a mouse xenograft model, five intra-tumor injections of INXS along 15 days caused a marked regression in tumor volume. INXS is an lncRNA that induces apoptosis, suggesting that INXS is a possible target to be explored in cancer therapies.

O gene, uma seqüência de nucleotídeos necessária para a síntese de moléculas funcionais, é transcrito e regulado por um conjunto de processos e fatores extremamente complexos. Entender o momento e o tecido em que os genes são expressos, as isoformas funcionais, as regiões controladoras e os fatores envolvidos na regulação da expressão de cada gene é um dos grandes desafios da biologia molecular moderna. Hoje, com a enorme quantidade de informações de seqüências genômicas e de transcriptomas, aliado ao desenvolvimento de métodos computacionais para agrupar e analisar estes dados em larga escala, o estudo dos fenômenos relacionados à transcrição e regulação gênica está passando por uma revolução. Por exemplo, é possível medir, concomitantemente, a expressão gênica de milhares de genes em diferentes tecidos, assim como identificar diversos fenômenos que atuam nestes genes. Neste trabalho nós desenvolvemos e aplicamos métodos computacionais no estudo de quatro temas envolvendo aspectos chave da transcrição e regulação gênica. No primeiro trabalho, nós abordamos a expressão gênica tecido-específica através do estudo dos genes expressos no cérebro e em dez regiões cerebrais de camundongo. No segundo trabalho, nós identificamos seqüências potencialmente envolvidas no controle da transcrição gênica através do estudo de motivos sobre representados na região promotora dos genes de receptores olfativos. No terceiro trabalho, analisamos o transcriptoma humano quanto a presença de eventos de retenção de intron, um tipo de splicing alternativo. No quarto trabalho, nós abordamos a complexidade do transcriptoma e a regulação da expressão gênica através do estudo de pares de genes senso-antisenso em humanos e camundongos. Em todos os trabalhos, obtivemos resultados que nos permitiram tirar conclusões específicas sobre cada fenômeno estudado e nos mostraram a importância de estudá-los através de uma abordagem em larga escala. Adicionalmente, verificamos que os nossos métodos computacionais foram eficientes e adequados para o estudo da transcrição e regulação gênica em Homo sapiens e Mus musculus. / Genes, nucleotide sequences necessary for the synthesis of functional molecules, are transcribed and regulated by extremely complex cellular and molecular processes. To understand when and in which tissues the genes are expressed, their functional isoforms, control regions and the factors involved in gene regulation is one of major challenges of modern molecular biology. Today, the availability of complete genome sequences and transcriptomes, together with the development of new computational methods allows the study of phenomena related to the transcription and gene regulation in a large scale. For example, it is possible to quantify, concomitantly, gene expression of thousands of genes in different tissues and analyze different aspects of their regulation. In this work we developed and applied computational methods to the study of four key aspects of gene transcription and regulation. In the first study, we addressed tissue specific gene expression through the study of genes that are preferentially expressed in the brain and ten different mouse brain regions. In the second study, we identified sequences that are potentially involved in the control of gene transcription through the study of motifs that are over represented in the promoter region of olfactory receptor genes. In the third study, we browsed the human for the presence of intron retention, a type of alternative splicing. In the fourth study, we addressed the transcriptoma complexity and gene expression regulation through the study of pair of sense-antisense genes in human and mouse. In all studies, our results allowed us to make specific conclusions about each phenomenon analyzed which showed us the importance of a large scale approach. In addition, we verified that our computational methods can be efficiently applied to the study of transcription and gene regulation in Homo sapiens and Mus musculus.

O objetivo deste trabalho foi estudar a utilização de uma nanoemulsão lipídica (LDE) como vetor de oligonucleotídeos antissenso (OAS). A LDE é uma nanoemulsão constituída por 48% de éster de colesterol, 47,8% de fosfolipídeos, 2,3% de triglicérides e 1,9% de colesterol não-esterificado. É capaz de adquirir apoE de HDL e, desta forma, a emulsão pode interagir com o receptor B/E. O comportamento metabólico da LDE se assemelha ao da LDL. OAS agem como inibidores da função de genes, ligando-se à fita oposta (complementar) do RNA mensageiro (mRNA) ou à dupla fita do DNA. Previnem que o mRNA codifique uma proteína funcional. Os mecanismos celulares de resistência a drogas representam diversas formas de proteção da célula e do organismo e estão presentes na maioria das células normais, exercendo funções fisiológicas. Infelizmente, muitos tumores utilizam esses mecanismos para sua própria proteção. A proteína codificada pelo gene MDR1 (ABCB1), a P-gp, é uma glicoproteína de membrana com peso molecular de 170Kda, que funciona como uma bomba orgânica catiônica. Neste trabalho foi observado que o OAS se ligam à LDE, sendo a constante de ligação de 4,2 X 10-3M-1. O complexo OAS/LDE foi capaz de se ligar especificamente ao receptor de LDL e através desta via ser internalizado, pelas células de sarcoma uterino resistentes a doxorrubicina. Os OAS apresentaram após 24 horas distribuição citoplasmática e nuclear e após 48 horas, somente distribuição citoplasmática. Utilizando-se dois diferentes OAS, verificou-se que ambos foram capaz de inibir (70%) a expressão do gene de resistência a múltiplas drogas após 48 horas de incubação, tornando as células mais susceptíveis à ação da doxorrubicina. Assim, o complexo OAS/LDE é um sistema potencialmente promissor para ser utilizado em terapia gênica. / The objective of this study was to evaluate the usefulness of a nanolipid emulsion (LDE) as a vector to carry antisense oligonucleotides (OAS). LDE is a nanoemulsion consisting of 48% cholesterol esters, 47,8% phospholipid, 2,3% triglycerides and 1,9% unesterified cholesterol. It is able to obtain apoE from HDL and interact with B/E receptor. The metabolic behavior of LDE is similar to LDL. OAS are able to inhibit specific gene expression since they bind to a complementary sequence in the mRNA or in the DNA. This binding impairs the synthesis of a functional protein. The cell resistance mechanisms are present in most of normal cells, been involved in physiological process. Tumors are able to use these mechanisms to their own protection. The protein P-gp (MDR1 gene) is a glycoprotein with 170Kda that works as an organic cationic pump. We have observed that LDE was able to bind to the OAS; the binding constant was 4,2 X 10-3M-1. The complex was shown to bind to LDL receptors and then been internalized into a human sarcoma cell line resistant to doxirrubicine. After 24 hours the complex have shown citoplasmatic and nuclear distribution, after 48 hours only citoplasmatic distribution was observed. Two OAS were used. Both OAS strongly inhibited (by 70%) the cell MDR-1 gene expression after 48 hours of incubation and cells turned out to be more susceptible to doxorrubicine action. Therefore, OAS/LDE is promising complex to be used in gene therapy studies.

There is a growing appreciation that eukaryotic genomes are transcribed into numerous, previously undetected - and thus uncharacterized regulatory long non-coding RNAs (lncRNAs). Recent studies are primarily focused on lncRNAs transcribed from intergenic regions and enhancers, leaving antisense lncRNAs the least studied group of lncRNAs. At the same time, antisense transcription occurs in up to 74 % of human gene loci, frequently - from the opposite strand of genes encoding proteins involved in regulation of transcription. Here, we identified HIPSTAR (Heterogeneously expressed from the Intronic Plus Strand of the TFAP2A-locus RNA), a novel conserved lncRNA that is transcribed antisense to the TFAP2A gene. Unlike previously reported antisense lncRNAs, HIPSTR expression does not correlate with the expression of its antisense counterpart. Although HIPSTAR and TFAP2A are co-expressed in in vitro derived neural crest and trophoblast cells, only HIPSTAR and not TFAP2A is specifically expressed in a subset of cells within 8-cell- and morula-stage human embryos. We show that, similar to HIPSTAR, in the individual cells of developing human embryos or of stable cell lines the expression of lncRNAs is more highly heterogeneous than the expression of mRNAs. Finally, we demonstrate that HIPSTAR depletion in HEK293 and H1BP, a human embryonic stem cell line, predominantly affects the expression levels of genes involved in early organismal development and cell differentiation. Together, we show that expression of HIPSTAR and hundreds other lncRNAs is highly heterogeneous in human embryos and cell lines. We use HIPSTAR to exemplify the functional relevance of lncRNAs with heterogeneous and developmental stage-specific expression patterns. / Tem sido cada vez mais reconhecido que a transcrição dos genomas eucarióticos produz múltiplos transcritos novos, anteriormente não detectados e ainda não caracterizados, sendo que a maioria é constituida de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs) regulatórios. Estudos recentes estão focados principalmente nos lncRNAs transcritos de regiões intergênicas e enhancers; assim, o grupo dos lncRNAs antisenso permanece o menos estudado de todos. Ao mesmo tempo, a transcrição antisenso ocorre em até 74% dos loci de genes humanos, frequentemente - a partir da fita oposta de genes que codificam proteínas envolvidas na regulação da transcrição. No presente trabalho, nós identificamos HIPSTR (Heterogeneously expressed from the Intronic Plus Strand of the TFAP2A-locus RNA), um lncRNA novo conservado que é transcrito a partir da fita antisenso do gene TFAP2A. Ao contrário do anteriormente relatado para os lncRNAs antisenso, a expressão de HIPSTR não está correlacionada com a expressão do gene da fita oposta. HIPSTR e TFAP2A são co-expressos em células da crista neural e em trofoblastos derivadas in vitro, mas somente HIPSTR e não TFAP2A está especificamente expresso num subconjunto de células de embriões humanos nos estágios de 8-células e mórula. Mostramos que, semelhante a HIPSTR, a expressão de lncRNAs é mais altamente heterogênea que a expressão de mRNAs em células individuais de embriões humanos em desenvolvimento ou em linhagens estáveis de células. Finalmente, nós demonstramos que a depleção de HIPSTAR em células HEK293 e H1BP, uma linhagem de células tronco embrionárias humanas, afeta predominantemente os níveis de genes envolvidos no início do desenvolvimento do organismo e na diferenciação de células. No conjunto, nós mostramos que a expressão de HIPSTR e de centenas de outros lncRNAs é altamente heterogênea em embriões humanos e linhagens celulares. Usamos HIPSTR para exemplificar a relevância funcional de lncRNAs com padrões de expressão heterogêneos e estágio-de-desenvolvimento específicos.

There is a growing appreciation that eukaryotic genomes are transcribed into numerous, previously undetected - and thus uncharacterized regulatory long non-coding RNAs (lncRNAs). Recent studies are primarily focused on lncRNAs transcribed from intergenic regions and enhancers, leaving antisense lncRNAs the least studied group of lncRNAs. At the same time, antisense transcription occurs in up to 74 % of human gene loci, frequently - from the opposite strand of genes encoding proteins involved in regulation of transcription. Here, we identified HIPSTAR (Heterogeneously expressed from the Intronic Plus Strand of the TFAP2A-locus RNA), a novel conserved lncRNA that is transcribed antisense to the TFAP2A gene. Unlike previously reported antisense lncRNAs, HIPSTR expression does not correlate with the expression of its antisense counterpart. Although HIPSTAR and TFAP2A are co-expressed in in vitro derived neural crest and trophoblast cells, only HIPSTAR and not TFAP2A is specifically expressed in a subset of cells within 8-cell- and morula-stage human embryos. We show that, similar to HIPSTAR, in the individual cells of developing human embryos or of stable cell lines the expression of lncRNAs is more highly heterogeneous than the expression of mRNAs. Finally, we demonstrate that HIPSTAR depletion in HEK293 and H1BP, a human embryonic stem cell line, predominantly affects the expression levels of genes involved in early organismal development and cell differentiation. Together, we show that expression of HIPSTAR and hundreds other lncRNAs is highly heterogeneous in human embryos and cell lines. We use HIPSTAR to exemplify the functional relevance of lncRNAs with heterogeneous and developmental stage-specific expression patterns. / Tem sido cada vez mais reconhecido que a transcrição dos genomas eucarióticos produz múltiplos transcritos novos, anteriormente não detectados e ainda não caracterizados, sendo que a maioria é constituida de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs) regulatórios. Estudos recentes estão focados principalmente nos lncRNAs transcritos de regiões intergênicas e enhancers; assim, o grupo dos lncRNAs antisenso permanece o menos estudado de todos. Ao mesmo tempo, a transcrição antisenso ocorre em até 74% dos loci de genes humanos, frequentemente - a partir da fita oposta de genes que codificam proteínas envolvidas na regulação da transcrição. No presente trabalho, nós identificamos HIPSTR (Heterogeneously expressed from the Intronic Plus Strand of the TFAP2A-locus RNA), um lncRNA novo conservado que é transcrito a partir da fita antisenso do gene TFAP2A. Ao contrário do anteriormente relatado para os lncRNAs antisenso, a expressão de HIPSTR não está correlacionada com a expressão do gene da fita oposta. HIPSTR e TFAP2A são co-expressos em células da crista neural e em trofoblastos derivadas in vitro, mas somente HIPSTR e não TFAP2A está especificamente expresso num subconjunto de células de embriões humanos nos estágios de 8-células e mórula. Mostramos que, semelhante a HIPSTR, a expressão de lncRNAs é mais altamente heterogênea que a expressão de mRNAs em células individuais de embriões humanos em desenvolvimento ou em linhagens estáveis de células. Finalmente, nós demonstramos que a depleção de HIPSTAR em células HEK293 e H1BP, uma linhagem de células tronco embrionárias humanas, afeta predominantemente os níveis de genes envolvidos no início do desenvolvimento do organismo e na diferenciação de células. No conjunto, nós mostramos que a expressão de HIPSTR e de centenas de outros lncRNAs é altamente heterogênea em embriões humanos e linhagens celulares. Usamos HIPSTR para exemplificar a relevância funcional de lncRNAs com padrões de expressão heterogêneos e estágio-de-desenvolvimento específicos.

O objetivo deste trabalho foi estudar a utilização de uma nanoemulsão lipídica (LDE) como vetor de oligonucleotídeos antissenso (OAS). A LDE é uma nanoemulsão constituída por 48% de éster de colesterol, 47,8% de fosfolipídeos, 2,3% de triglicérides e 1,9% de colesterol não-esterificado. É capaz de adquirir apoE de HDL e, desta forma, a emulsão pode interagir com o receptor B/E. O comportamento metabólico da LDE se assemelha ao da LDL. OAS agem como inibidores da função de genes, ligando-se à fita oposta (complementar) do RNA mensageiro (mRNA) ou à dupla fita do DNA. Previnem que o mRNA codifique uma proteína funcional. Os mecanismos celulares de resistência a drogas representam diversas formas de proteção da célula e do organismo e estão presentes na maioria das células normais, exercendo funções fisiológicas. Infelizmente, muitos tumores utilizam esses mecanismos para sua própria proteção. A proteína codificada pelo gene MDR1 (ABCB1), a P-gp, é uma glicoproteína de membrana com peso molecular de 170Kda, que funciona como uma bomba orgânica catiônica. Neste trabalho foi observado que o OAS se ligam à LDE, sendo a constante de ligação de 4,2 X 10-3M-1. O complexo OAS/LDE foi capaz de se ligar especificamente ao receptor de LDL e através desta via ser internalizado, pelas células de sarcoma uterino resistentes a doxorrubicina. Os OAS apresentaram após 24 horas distribuição citoplasmática e nuclear e após 48 horas, somente distribuição citoplasmática. Utilizando-se dois diferentes OAS, verificou-se que ambos foram capaz de inibir (70%) a expressão do gene de resistência a múltiplas drogas após 48 horas de incubação, tornando as células mais susceptíveis à ação da doxorrubicina. Assim, o complexo OAS/LDE é um sistema potencialmente promissor para ser utilizado em terapia gênica. / The objective of this study was to evaluate the usefulness of a nanolipid emulsion (LDE) as a vector to carry antisense oligonucleotides (OAS). LDE is a nanoemulsion consisting of 48% cholesterol esters, 47,8% phospholipid, 2,3% triglycerides and 1,9% unesterified cholesterol. It is able to obtain apoE from HDL and interact with B/E receptor. The metabolic behavior of LDE is similar to LDL. OAS are able to inhibit specific gene expression since they bind to a complementary sequence in the mRNA or in the DNA. This binding impairs the synthesis of a functional protein. The cell resistance mechanisms are present in most of normal cells, been involved in physiological process. Tumors are able to use these mechanisms to their own protection. The protein P-gp (MDR1 gene) is a glycoprotein with 170Kda that works as an organic cationic pump. We have observed that LDE was able to bind to the OAS; the binding constant was 4,2 X 10-3M-1. The complex was shown to bind to LDL receptors and then been internalized into a human sarcoma cell line resistant to doxirrubicine. After 24 hours the complex have shown citoplasmatic and nuclear distribution, after 48 hours only citoplasmatic distribution was observed. Two OAS were used. Both OAS strongly inhibited (by 70%) the cell MDR-1 gene expression after 48 hours of incubation and cells turned out to be more susceptible to doxorrubicine action. Therefore, OAS/LDE is promising complex to be used in gene therapy studies.

O câncer de mama é o carcinoma que mais acomete mulheres no Brasil. Os tratamentos disponíveis são recomendados a partir da análise de fatores de prognóstico como a classificação pelo sistema TNM, tipo histológico, status de receptores hormonais e marcadores de proliferação tumoral. No entanto, a classificação dos tumores de mama é muito variável e o poder prognóstico dos marcadores tumorais atuais ainda é limitado, levando muitas pacientes à terapia adjuvante desnecessária. Portanto, novos métodos de prognóstico mais sensíveis são necessários para melhorar a tomada de decisão na clínica oncológica de pacientes com câncer de mama. Do ponto de vista de ciência básica, as modificações transcricionais associadas à oncogênese e progressão do câncer de mama ainda são pouco conhecidas. Além da alteração na expressão de genes codificadores para proteínas, evidências recentes sugerem que RNAs não-codificadores (ncRNAs) podem ter um papel importante na transformação maligna. Este projeto teve como principais objetivos: i) investigar a expressão de ncRNAs intrônicos em amostras de adenocarcinoma de mama e ii) identificar assinaturas de expressão gênica associadas a características anatomo-patológicas e clínicas de tumores de mama com potencial aplicação clínica. Para isso, foram comparados os perfis de expressão gênica de 58 amostras de tecido tumoral de mama, com seguimento clínico conhecido, utilizando uma plataforma de microarranjos de cDNA, enriquecida em ncRNAs provenientes de regiões intrônicas de genes humanos conhecidos. 9 Durante o projeto foram testadas diferentes metodologias para análise da expressão gênica utilizando microarranjos de cDNA com uma ou duas cores. O desenho experimental das hibridizações incluiu a co-hibridização de cada microarranjo com alvos fluorescentes representando o transcritoma da amostra de tumor juntamente com um oligonucleotídeo referência complementar a uma região presente em todas as sondas de cDNA (RefOligo). Este desenho experimental permitiu a avaliação de duas abordagens de análise da expressão gênica: a primeira baseada nas intensidades diretas de cada transcrito (One-Color) e a segunda baseada em razões de expressão onde a intensidade de cada transcrito foi normalizada pelo oligonucleotídeo referência (RefOligo). A utilização direta das intensidades se mostrou mais reprodutível e sensível para a detecção de assinaturas de expressão correlacionadas com características das amostras de mama, e essa abordagem foi escolhida para as análises subseqüentes. Os dados provenientes dos experimentos de microarranjos revelaram níveis de expressão ubíqüos dos transcritos intrônicos nas amostras analisadas, extendendo para o câncer de mama a relevância do estudo desta classe de ncRNAs. Além disso, foi identificada uma assinatura contendo 95 transcritos, correlacionada com o status de expressão do receptor de estrogênio (REr), dos quais cerca de 15% correspondem a ncRNAs. Utilizando apenas amostras com seguimento clínico superior a 4 anos, foi identificada uma assinatura com 113 transcritos, dos quais cerca de 30% são ncRNAs intrônicos, capaz de distinguir com 100% de acurácia pacientes que desenvolveram metástase daqueles que permaneceram livres da doença. Além de contribuir com novos candidatos a marcadores de prognóstico no câncer de mama, este estudo aponta para a participação de ncRNAs intrônicos em complexas redes transcricionais, possivelmente modulando a expressão de genes codificadores para proteínas. A caracterização detalhada da função de ncRNAs com expressão correlacionada a características fenotípicas e clínicas dos tumores de mama deverá fornecer novas informações sobre as bases moleculares da tumorigênese e progressão desta neoplasia. / Breast carcinoma is the most frequently occurring cancer amongst women in Brazil. The treatments available for breast cancer are prescribed based on the results of prognostic factors, such as the TNM classification system, histological type, hormonal receptor status and tumoral markers for cell proliferation. Nevertheless, breast cancer classification can be variable and inconsistent, and the prognosis power of tumoral markers is still limited, resulting in many patients unnecessarily undergoing adjuvant therapy. Therefore, there is an urge for new prognosis methods that are more sensitive, as well as accurate, in order to improve treatment decisions for breast cancer patients. From a basic science perspective, transcriptional modifications associated with oncogenesis and breast cancer progression are still poorly understood. Beyond alterations of the expression of protein-coding genes, recent evidences suggest that non-coding RNAs (ncRNAs) might have an important role in malignant transformation. The main goals of this project are: i) to investigate the expression of intronic ncRNAs in breast cancer tissue and ii) to identify gene expression signatures correlated to anatomo-pathological and clinical characteristics of human breast tumors, with a potential clinical aplication. To achieve this, gene expression profiles of 58 breast tumor samples with clinical follow-up were compared using a microarray platform enriched in non-coding RNAs (ncRNAs) derived from intronic regions of known human genes. During this project different gene expression methodologies were tested for the analysis of one- or two-color cDNA microarrays. The experimental design included the co-hybridization of the microarrays with fluorescent targets representing the tumor sample transcriptome with a reference oligonucleotide that is complementary to a 12 common region present in all cDNA probes (RefOligo). This experimental design permited the evaluation of two gene expression analysis approaches: the first based on direct intensities of each transcript (One-Color) and the second based in expression ratios where the intensity of each transcript is normalized by the reference oligonucleotide (RefOligo). One-Color methodology has shown to provide a more reproducible and sensitive gene expression signatures correlated to the breast samples characteristics and, therefore, this approach was chosen for subsequent analysis. The data provided by the microarray experiments revealed that ubiquitous expression of intronic ncRNAs was observed, confirming the relevance of investigating the role of this class of ncRNAs in breast cancer. Furthermore, a gene expression signature comprising 95 transcripts and correlated to the estrogen receptor status of breast tumor samples was identified, from which approximately 15% are ncRNAs. Using only samples from patients with known follow-up, a signature of 113 transcripts was identified, of which 30% are ncRNAs. This gene expression signature was able to distinguish with 100% accuracy patients that developed metastasis from those that remained disease-free up to 4 years after surgery. Besides the contribution of new molecular prognostic markers for breast cancer, the present study indicates that intronic ncRNAs might play a role in complex transcriptional networks, possibly regulating the expression of protein-coding genes. The detailed caracterization of the functional roles of ncRNAs, whose expression levels are correlated to fenotypical and clinical characteristics of breast tumors, is likely to provide new insigths on the molecular basis of tumorigenesis and progression of this neoplasia.

O câncer de mama é o carcinoma que mais acomete mulheres no Brasil. Os tratamentos disponíveis são recomendados a partir da análise de fatores de prognóstico como a classificação pelo sistema TNM, tipo histológico, status de receptores hormonais e marcadores de proliferação tumoral. No entanto, a classificação dos tumores de mama é muito variável e o poder prognóstico dos marcadores tumorais atuais ainda é limitado, levando muitas pacientes à terapia adjuvante desnecessária. Portanto, novos métodos de prognóstico mais sensíveis são necessários para melhorar a tomada de decisão na clínica oncológica de pacientes com câncer de mama. Do ponto de vista de ciência básica, as modificações transcricionais associadas à oncogênese e progressão do câncer de mama ainda são pouco conhecidas. Além da alteração na expressão de genes codificadores para proteínas, evidências recentes sugerem que RNAs não-codificadores (ncRNAs) podem ter um papel importante na transformação maligna. Este projeto teve como principais objetivos: i) investigar a expressão de ncRNAs intrônicos em amostras de adenocarcinoma de mama e ii) identificar assinaturas de expressão gênica associadas a características anatomo-patológicas e clínicas de tumores de mama com potencial aplicação clínica. Para isso, foram comparados os perfis de expressão gênica de 58 amostras de tecido tumoral de mama, com seguimento clínico conhecido, utilizando uma plataforma de microarranjos de cDNA, enriquecida em ncRNAs provenientes de regiões intrônicas de genes humanos conhecidos. 9 Durante o projeto foram testadas diferentes metodologias para análise da expressão gênica utilizando microarranjos de cDNA com uma ou duas cores. O desenho experimental das hibridizações incluiu a co-hibridização de cada microarranjo com alvos fluorescentes representando o transcritoma da amostra de tumor juntamente com um oligonucleotídeo referência complementar a uma região presente em todas as sondas de cDNA (RefOligo). Este desenho experimental permitiu a avaliação de duas abordagens de análise da expressão gênica: a primeira baseada nas intensidades diretas de cada transcrito (One-Color) e a segunda baseada em razões de expressão onde a intensidade de cada transcrito foi normalizada pelo oligonucleotídeo referência (RefOligo). A utilização direta das intensidades se mostrou mais reprodutível e sensível para a detecção de assinaturas de expressão correlacionadas com características das amostras de mama, e essa abordagem foi escolhida para as análises subseqüentes. Os dados provenientes dos experimentos de microarranjos revelaram níveis de expressão ubíqüos dos transcritos intrônicos nas amostras analisadas, extendendo para o câncer de mama a relevância do estudo desta classe de ncRNAs. Além disso, foi identificada uma assinatura contendo 95 transcritos, correlacionada com o status de expressão do receptor de estrogênio (REr), dos quais cerca de 15% correspondem a ncRNAs. Utilizando apenas amostras com seguimento clínico superior a 4 anos, foi identificada uma assinatura com 113 transcritos, dos quais cerca de 30% são ncRNAs intrônicos, capaz de distinguir com 100% de acurácia pacientes que desenvolveram metástase daqueles que permaneceram livres da doença. Além de contribuir com novos candidatos a marcadores de prognóstico no câncer de mama, este estudo aponta para a participação de ncRNAs intrônicos em complexas redes transcricionais, possivelmente modulando a expressão de genes codificadores para proteínas. A caracterização detalhada da função de ncRNAs com expressão correlacionada a características fenotípicas e clínicas dos tumores de mama deverá fornecer novas informações sobre as bases moleculares da tumorigênese e progressão desta neoplasia. / Breast carcinoma is the most frequently occurring cancer amongst women in Brazil. The treatments available for breast cancer are prescribed based on the results of prognostic factors, such as the TNM classification system, histological type, hormonal receptor status and tumoral markers for cell proliferation. Nevertheless, breast cancer classification can be variable and inconsistent, and the prognosis power of tumoral markers is still limited, resulting in many patients unnecessarily undergoing adjuvant therapy. Therefore, there is an urge for new prognosis methods that are more sensitive, as well as accurate, in order to improve treatment decisions for breast cancer patients. From a basic science perspective, transcriptional modifications associated with oncogenesis and breast cancer progression are still poorly understood. Beyond alterations of the expression of protein-coding genes, recent evidences suggest that non-coding RNAs (ncRNAs) might have an important role in malignant transformation. The main goals of this project are: i) to investigate the expression of intronic ncRNAs in breast cancer tissue and ii) to identify gene expression signatures correlated to anatomo-pathological and clinical characteristics of human breast tumors, with a potential clinical aplication. To achieve this, gene expression profiles of 58 breast tumor samples with clinical follow-up were compared using a microarray platform enriched in non-coding RNAs (ncRNAs) derived from intronic regions of known human genes. During this project different gene expression methodologies were tested for the analysis of one- or two-color cDNA microarrays. The experimental design included the co-hybridization of the microarrays with fluorescent targets representing the tumor sample transcriptome with a reference oligonucleotide that is complementary to a 12 common region present in all cDNA probes (RefOligo). This experimental design permited the evaluation of two gene expression analysis approaches: the first based on direct intensities of each transcript (One-Color) and the second based in expression ratios where the intensity of each transcript is normalized by the reference oligonucleotide (RefOligo). One-Color methodology has shown to provide a more reproducible and sensitive gene expression signatures correlated to the breast samples characteristics and, therefore, this approach was chosen for subsequent analysis. The data provided by the microarray experiments revealed that ubiquitous expression of intronic ncRNAs was observed, confirming the relevance of investigating the role of this class of ncRNAs in breast cancer. Furthermore, a gene expression signature comprising 95 transcripts and correlated to the estrogen receptor status of breast tumor samples was identified, from which approximately 15% are ncRNAs. Using only samples from patients with known follow-up, a signature of 113 transcripts was identified, of which 30% are ncRNAs. This gene expression signature was able to distinguish with 100% accuracy patients that developed metastasis from those that remained disease-free up to 4 years after surgery. Besides the contribution of new molecular prognostic markers for breast cancer, the present study indicates that intronic ncRNAs might play a role in complex transcriptional networks, possibly regulating the expression of protein-coding genes. The detailed caracterization of the functional roles of ncRNAs, whose expression levels are correlated to fenotypical and clinical characteristics of breast tumors, is likely to provide new insigths on the molecular basis of tumorigenesis and progression of this neoplasia.