O Tomato chlorosis virus (ToCV) é uma espécie do gênero Crinivirus que causa danos, principalmente na cultura do tomateiro (Solanum lycopersicum). Foi primeiramente isolado e descrito em 1998, nos Estados Unidos, e em seguida foi reportado em doze países. No Brasil, foi constatado primeiramente no Estado de São Paulo, na região de Sumaré, em 2008, e posteriormente nos Estados da Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais e Rio de Janeiro. Há evidência da sua presença também nos Estados do Paraná e Santa Catarina. O ToCV pode infectar outras solanáceas além do tomateiro e, recentemente, foi observado infectando plantas de batata (Solanum tuberosum) no Brasil. Esse crinivirus é transmitido no Brasil principalmente pelo aleirodídeo (mosca branca) Bemisia tabaci MEAM1. Considerando o patossistema batateira/ToCV, não há estudos sobre a ocorrência, sintomatologia em diferentes variedades e danos provocados por esse crinivirus. Também não há antissoro policlonal para o isolado brasileiro do ToCV para uso na diagnose da doença em solanáceas. Esse trabalho teve por objetivos: purificar o ToCV e produzir antissoro policlonal; avaliar a reação de genótipos de batateira à infecção com o ToCV; avaliar o dano provocado por esse vírus em duas variedades de batateira. A purificação do vírus a partir de folhas de tomateiro e a produção de antissoro policlonal em coelho foram satisfatórias. No entanto, o antissoro não foi eficiente em ELISA, mas sim em dot-blot e somente na diluição de 1:20. Foi avaliada a reação de 21 genótipos de batateira à infecção com o ToCV, por meio da inoculação com B. tabaci MEAM1, com chance de escolha do vetor. Nenhum genótipo exibiu resistência à infecção; enquanto a variedade Camila foi assintomática e não apresentou alteração na fotossíntese. Plantas de batateira das variedades Ágata e Asterix sadias foram inoculadas com o ToCV, por meio da B. tabaci MEAM1 e ao final foram avaliadas a massa fresca da parte aérea, peso e número dos tubérculos colhidos. Em dois experimentos independentes, as reduções médias no peso fresco da parte aérea foram de 60,1% para Ágata e 46% para Asterix. Porém, as reduções nas produções dessas variedades, no primeiro experimento foram de 99,5% e 98,1%, respectivamente; enquanto no segundo os valores foram de 82,3% e 56,2%, respectivamente. / Tomato chlorosis virus (ToCV) is a species of the genus Crinivirus, which is causing considerable losses mainly on tomato crop (Solanum lycopersicum). It was first isolated and described on 1998 in the United States and subsequently reported in twelve countries. In Brazil, it was first reported in São Paulo State, in Sumaré region in 2008, and after that on the states of Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais and Rio de Janeiro. There is evidence of the presence of ToCV on the states of Paraná and Santa Catarina. ToCV can also infect other solanaceae and more recently, it was reported infecting potato plants (Solanum tuberosum) in Brazil. This crinivirus is transmitted by Bemisia tabaci MEAM1. Considering the patosystem potato/ToCV, there are no studies on the occurrence, symptomatology in different varieties, and damages caused by this crinivirus. In addition, there is no polyclonal antiserum for the Brazilian isolate of ToCV for use in diagnosis. The objectives of the present work were: to purify the virus and produce a polyclonal antiserum; to evaluate the reaction of potato genotypes to ToCV infection; to evaluate the yield loss caused by this crinivirus on two potato cultivars. The virus purification from tomato leaves and the production of polyclonal antiserum in rabbit were satisfactorily accomplished. However, the antiserum was not efficient on ELISA test, but in dot-blot, only when diluted 1:20. The reaction of 21 potato genotypes to infection with ToCV was evaluated by inoculation with B. tabaci MEAM1, with chance of choice for the vector. All genotypes were infected with ToCV and Camila was the only one asymptomatic. Plants of cultivars Ágata and Asterix were inoculated with ToCV, by means of viruliferous vector, and at the end were evaluated for the fresh mass of the aerial part, weight and number of harvested tubers. In two independent experiments, average reductions in aerial fresh weight were 60.1% for Ágata and 46% for Asterix. However, reductions in yield of these varieties in the first experiment were 99.5% and 98.1%, respectively; while in the second the values were 82.3% and 56.2%, respectively.

O Tomato chlorosis virus (ToCV) é uma espécie do gênero Crinivirus que causa danos, principalmente na cultura do tomateiro (Solanum lycopersicum). Foi primeiramente isolado e descrito em 1998, nos Estados Unidos, e em seguida foi reportado em doze países. No Brasil, foi constatado primeiramente no Estado de São Paulo, na região de Sumaré, em 2008, e posteriormente nos Estados da Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais e Rio de Janeiro. Há evidência da sua presença também nos Estados do Paraná e Santa Catarina. O ToCV pode infectar outras solanáceas além do tomateiro e, recentemente, foi observado infectando plantas de batata (Solanum tuberosum) no Brasil. Esse crinivirus é transmitido no Brasil principalmente pelo aleirodídeo (mosca branca) Bemisia tabaci MEAM1. Considerando o patossistema batateira/ToCV, não há estudos sobre a ocorrência, sintomatologia em diferentes variedades e danos provocados por esse crinivirus. Também não há antissoro policlonal para o isolado brasileiro do ToCV para uso na diagnose da doença em solanáceas. Esse trabalho teve por objetivos: purificar o ToCV e produzir antissoro policlonal; avaliar a reação de genótipos de batateira à infecção com o ToCV; avaliar o dano provocado por esse vírus em duas variedades de batateira. A purificação do vírus a partir de folhas de tomateiro e a produção de antissoro policlonal em coelho foram satisfatórias. No entanto, o antissoro não foi eficiente em ELISA, mas sim em dot-blot e somente na diluição de 1:20. Foi avaliada a reação de 21 genótipos de batateira à infecção com o ToCV, por meio da inoculação com B. tabaci MEAM1, com chance de escolha do vetor. Nenhum genótipo exibiu resistência à infecção; enquanto a variedade Camila foi assintomática e não apresentou alteração na fotossíntese. Plantas de batateira das variedades Ágata e Asterix sadias foram inoculadas com o ToCV, por meio da B. tabaci MEAM1 e ao final foram avaliadas a massa fresca da parte aérea, peso e número dos tubérculos colhidos. Em dois experimentos independentes, as reduções médias no peso fresco da parte aérea foram de 60,1% para Ágata e 46% para Asterix. Porém, as reduções nas produções dessas variedades, no primeiro experimento foram de 99,5% e 98,1%, respectivamente; enquanto no segundo os valores foram de 82,3% e 56,2%, respectivamente. / Tomato chlorosis virus (ToCV) is a species of the genus Crinivirus, which is causing considerable losses mainly on tomato crop (Solanum lycopersicum). It was first isolated and described on 1998 in the United States and subsequently reported in twelve countries. In Brazil, it was first reported in São Paulo State, in Sumaré region in 2008, and after that on the states of Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais and Rio de Janeiro. There is evidence of the presence of ToCV on the states of Paraná and Santa Catarina. ToCV can also infect other solanaceae and more recently, it was reported infecting potato plants (Solanum tuberosum) in Brazil. This crinivirus is transmitted by Bemisia tabaci MEAM1. Considering the patosystem potato/ToCV, there are no studies on the occurrence, symptomatology in different varieties, and damages caused by this crinivirus. In addition, there is no polyclonal antiserum for the Brazilian isolate of ToCV for use in diagnosis. The objectives of the present work were: to purify the virus and produce a polyclonal antiserum; to evaluate the reaction of potato genotypes to ToCV infection; to evaluate the yield loss caused by this crinivirus on two potato cultivars. The virus purification from tomato leaves and the production of polyclonal antiserum in rabbit were satisfactorily accomplished. However, the antiserum was not efficient on ELISA test, but in dot-blot, only when diluted 1:20. The reaction of 21 potato genotypes to infection with ToCV was evaluated by inoculation with B. tabaci MEAM1, with chance of choice for the vector. All genotypes were infected with ToCV and Camila was the only one asymptomatic. Plants of cultivars Ágata and Asterix were inoculated with ToCV, by means of viruliferous vector, and at the end were evaluated for the fresh mass of the aerial part, weight and number of harvested tubers. In two independent experiments, average reductions in aerial fresh weight were 60.1% for Ágata and 46% for Asterix. However, reductions in yield of these varieties in the first experiment were 99.5% and 98.1%, respectively; while in the second the values were 82.3% and 56.2%, respectively.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1056837 bytes, checksum: 147af3aea5c0fd4d6961921a210a152c (MD5) Previous issue date: 2012-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cowpea mild mottle virus (CpMMV), the causal agent of stem necrosis disease, has drawn attention of soybean producers in recent years due to productivity losses in the main producing regions of Brazil. The disease was first recorded in the Midwest region of Brazil in the 2000/01 soybean season and rapidly spread throughout the country in the following years. CpMMV is usually hard to diagnose due to its wide range of symptoms while the occurrence of asymptomatic soybean cultivars complicates genotypic selection in breeding programs. Serological methods for viral detection require the use of an antiserum of good quality to achieve specificity and sensitivity. The entire coat protein sequence of a Brazilian CpMMV isolate was cloned into a bacterial expression vector and transformed into Escherichia coli BL21::DE3 for in vitro expression. The coat protein, fused to a 6 His-tag, was purified under denaturing conditions by affinity chromatography using a Ni-NTA resin. After renaturation, the integrity and identity of purified recombinant protein was confirmed by SDS-Page and MALDI-ToF/Tof mass spectrometer analyses. New Zealand rabbits were immunized with increasing amounts of the recombinant protein. The specificity and sensitivity of the antisera was shown by Western blot and indirect ELISA assays. The polyclonal antisera raised against recombinant coat protein proved to be a reliable tool for CpMMV detection. / O Cowpea mild mottle virus (CpMMV), agente causal da necrose da haste, tem chamado a atenção dos produtores de soja nos últimos anos devido às perdas de produtividade geradas nas principais regiões produtoras do Brasil. A doença foi relatada pela primeira vez na região Centro-Oeste do Brasil, na safra de 2000/01, e rapidamente se espalhou por todo o país nos anos seguintes. Além disso, tem sido relatada a ocorrência de cultivares de soja assintomáticas, o que dificulta a seleção de genótipos para programas de melhoramento. Os métodos sorológicos para a detecção viral requerem o uso de um antissoro de boa qualidade para alcançar especificidade e sensibilidade. A sequência completa da capa proteica de um isolado brasileiro de CpMMV (Bahia) foi clonado em um vetor de expressão bacteriano e transformado em Escherichia coli BL21: DE3 para expressão in vitro. A proteína capsidial ligada a uma cauda de histidina foi purificada sob condições desnaturantes através de cromatografia de afinidade, utilizando uma resina Ni-NTA. Depois da renaturação, a integridade e a identidade da proteína recombinante purificada foi confirmada por SDS-PAGE e análise de espectrometria de massa (MALDI-ToF/ToF). Dois coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados com quantidades crescentes da proteína recombinante. A especificidade e sensibilidade do antissoro foram avaliadas por Western blot e ELISA indireto. O antissoro policlonal a partir da proteína recombinante da capa proteica provou ser uma ferramenta confiável e eficiente para a detecção CpMMV.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Passion fruit (Passiflora edulis) and cowpea (Vigna unguiculata) are important crops of economical impact for the Northeast of Brazil. Fruit woodiness is an important virus disease of passion fruit, caused by Passionfruit woodiness virus (PWV) and Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), both from the genus Potyvirus. CABMV is also responsible for important disease on cowpea. The present research had the objective to study and compare the biological, serological and molecular properties of isolates of CABMV obtained from passion fruit (CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb and CABMV-P Uba) and from cowpea (CABMV-C Fort and CABMV-C Bv). CABMV-C Fort and CABMV-C Bv were purified from infected cowpea cv. Pitiuba systemically infected. The obtained purified preparations presented concentrations of 16.4 mg of virus per mL (CABMV-C Bv) and 15.9 mg of virus per mL (CABMV-C Fort). Both purified virus preparations were used for rabbit immunizations to produce polyclonal antisera with reactive titers of 1:128.000 in PTA-ELISA. Electrophoresis analyses of the virus purified preparations revealed the presence of only one capsidial protein with molecular weight of 34 kDa for both virus isolates. Parts of the genomes, corresponding to the coat protein gene (cp), from the virus isolates obtained from cowpea and from passion fruit were amplified by RT-PCR. The philogenetic analyses of the amplified cDNA fragments grouped with the CABMV isolates sequences deposited in the GenBank, according to their original host. Based on the biological, serological and molecular results, the virus isolates studied were classified into two biotypes: Biotype Cowpea (CABMV-C) including CABMV-C Bv and CABMV-C Fort obtained from cowpea, and biotype Passion fruit (CABMV-P) including CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb and CABMV-P Uba obtained from passion fruit. Source of immunity to CABMV-C Bv and CABMV-C Fort was identified in cowpea and the genotype was designate Lab-Poty. Studies of virus interaction in cowpea demonstrated strong synergistic effect among CABMV-C, Cucumber mosaic virus (CMV) and Cowpea severe mosaic virus (CPSMV). / O maracujazeiro (Passiflora edulis) e o feijoeiro caupi (Vigna unguiculata) sÃo culturas de elevada importÃncia econÃmica para o Nordeste brasileiro. Entre as viroses que se manifestam no maracujazeiro, destaca-se o endurecimento dos frutos causado por Passionfruit woodiness virus (PWV) e Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), ambos pertencentes ao gÃnero Potyvirus, sendo o CABMV responsÃvel por importante doenÃa do feijoeiro caupi. A presente pesquisa teve como objetivo estudar e comparar as propriedades biolÃgicas, sorolÃgicas e moleculares de isolados de CABMV obtidos de maracujazeiro (CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb e CABMV-P Uba) e isolados obtidos de feijoeiro caupi (CABMV-C Fort e CABMV-C Bv). Os isolados CABMV-C Fort e CABMV-C Bv foram purificados a partir de plantas de feijoeiro caupi cv. Pitiuba sistemicamente infetadas. As preparaÃÃes purificadas obtidas apresentaram concentraÃÃes de 16,4 mg de vÃrus por mL (CABMV-C Bv) e 15, 9 mg de vÃrus por mL (CABMV-C Fort), as quais foram usadas na imunizaÃÃo de coelhos, para a produÃÃo de antissoros policlonais, com tÃtulo de 1:128.000 em PTA-ELISA. AnÃlises eletroforÃtica das preparaÃÃes virais revelaram uma Ãnica proteÃna capisidial com peso molecular de 34 kDa. Partes do genoma correspondente ao gene da capa protÃica (cp) dos isolados virais obtidos de feijoeiro caupi e de maracujazeiro foram amplificadas por RT-PCR. AnÃlises filogenÃticas dos fragmentos dos cDNA amplificados se agruparam com sequencias de isolados do CABMV depositadas no GenBank, de acordo com os hospedeiros originais. Com base nos resultados de estudos biolÃgicos, sorolÃgicos e moleculares, os isolados virais estudados foram classificados em dois biÃtipos: BiÃtipo Cowpea (CABMV-C) incluindo CABMV-C Bv and CABMV-C Fort obtidos de feijoeiro caupi e biÃtipo Passion fruit (CABMV-P) incluindo CABMV-P Pet, CABMV-P Gua, CABMV-P Sb e CABMV-P Uba obtidos de maracujazeiro. Fontes de imunidade a CABMV-C Bv e CABMV-C Fort foi identificada em feijoeiro caupi e o genÃtipo foi designado de Lab-Poty. Estudos de interaÃÃo viral em feijoeiro caupi, mostraram forte sinergismo entre CABMV-C, Cucumber mosaic virus (CMV) e Cowpea severe mosaic virus (CPSMV).

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Plant virus identification and characterization can be achived by several methods based in the biological, morphological, cytological, serological and molecular virus properties. The molecular properties have been used with frequency for vÃrus identification and characterization and the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) has constituted an efficient and precise method for researches with RNA plant viruses. On the other hand, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is the most used serological method for virus detection in plant tissues. A techncal innovation developed for plant virus identification represents a great technological development and support for plant virus research. A new approach involving virus particle immune precipitation to be used for RNA amplification by RT-PCR named IP-RT-PCR was sucessefuly used for amplification of RNA fragments from five virus species from the genera Comovirus, Cucumovirus, Potyvirus and Sobemovirus. Considering that the immune biological Companies have developed several DAS-ELISA kits, but neither of them produce and commercialize PTA-ELISA kits, a simple and practical PTA-ELISA kit was developed and validated for plant virus detection. The second part of the research had the objective to study, comparatively, the biological, serological and molecular properties of four plant virus isolates obtained from naturally infected Passiflora edulis (PWV-PET and PWV-GUA) and from naturally infected Vigna unguiculata (CABMV-BV and CABMV-FOR) with the objective to elucidate the identity of the causal agent of passion fruit woodiness in Brazil. In host range studies onle Canavalia ensiformes and Macroptilium lathyroides were infected by virus isolates obtained from cowpea and from passion fruit. The isolate PWV-GUA was purified from systemically infected M. lathyroides plants and the virus purified preparation (18.24 mg of virus.ml-1) was used for rabitt immunization for polyclonal antiserum production, which showed a title of 1:128,000 in PTA-ELISA. The electrophoresis analysis of the purified virus showed a unique capsidial protein with 34 kDA. Plant virus interaction studies in C. ensiformis indicated unilateral cross protection between PWV-GUA and CABMV-FOR. On the other hand, the isolate PWV-PET did not cross protect passion fruit plants against PWV-GUA. Filogenetic analysis of nucleotiode sequencies from cDNA fragments corresponding to coat protein (CP) genes amplified by IP-RT-PCR from the genomic virus isolates compared with virus sequencies from the Genbank grouped according to the host specifities. Based on the biological, serological and mainly molecular results, the virus isolates studied were classified into two biotypes: Biotype CABMC-C (Cowpea) to include isolates obtained from cowpea that do not infect passion fruit, and biotype CABMV-P (Passion fruit) to include the virus isolates responsible for the passion fruit woodiness in Brazil. / A identificaÃÃo e a caracterizaÃÃo de vÃrus de planta podem ser realizadas por vÃrios mÃtodos envolvendo propriedades morfolÃgicas, biolÃgicas, citolÃgicas, moleculares e sorolÃgicas. As tÃcnicas moleculares tÃm sido usadas com frequencia para identificaÃÃo e caracterizaÃÃo de vÃrus, e a tÃcnica de âreverse transcription polymerase chain reactionâ (RT-PCR) tem se constituÃdo em mÃtodo eficiente e preciso para pesquisas com vÃrus de planta com genoma de RNA. De outra parte, a tÃcnica de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) constitui o mÃtodo sorolÃgico mais usado para detecÃÃo de vÃrus em tecidos vegetais. Uma inovaÃÃo tecnolÃgica desenvolvida nesta pesquisa para diagnose de vÃrus de planta representa grande avanÃo tecnolÃgico e suporte para pesquisa em virologia vegetal. A inovaÃÃo envolvendo a imunoprecipitaÃÃo (IP) de partÃculas de vÃrus para uso na RT-PCR denominada de IP-RT-PCR foi usada com sucesso para amplificaÃÃo de fragmentos de RNA de cinco espÃcies de vÃrus dos gÃneros Comovirus, Cucumovirus, Potyvirus e Sobemovirus. Considerando que kits de DAS-ELISA tÃm sido produzidos e comercializados por companhias de imunobiologicos, mas nenhuma companhia produz kits de PTA-ELISA, um kit simples e prÃtico de PTA-ELISA foi desenvolvido e validado para detecÃÃo de vÃrus de planta. A segunda etapa da pesquisa teve como objetivo estudar as propriedades biolÃgicas, sorolÃgicas e moleculares de isolados de vÃrus do gÃnero Potyvirus obtidos de maracujazeiro (Passiflora edulis) (PWV-PET e PWV-GUA) e isolados de Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV-FOR e CABMV-BV) obtidos de feijoeiro caupi (Vigna unguiculata), visando elucidar a identidade do agente causal do endurecimento dos frutos do maracujazeiro no Brasil. Em estudos de gama de plantas hospedeiras, somente Canavalia ensiformis e Macroptilium lathyroides foram infetadas por isolados obtidos de maracujazeiro e de feijoeiro caupi. O PWV-GUA foi purificado a partir de plantas de M. lathyroides sistemicamente infetadas e a preparaÃÃo viral purificada (18,24 mg de vÃrus.ml-1) foi usada para imunizaÃÃo de coelho com a produÃÃo de antissoro policlonal com tÃtulo de 1:128.000 em PTA-ELISA. AnÃlise eletroforÃtica da preparaÃÃo viral purificada revelou uma Ãnica proteÃna capisidial com peso molecular de 34 kDa. Experimentos de interaÃÃo entre os isolados virais em C. ensiformis indicaram proteÃÃo unilateral entre PWV-GUA e CABMV-FOR. De outra parte, o isolado PWV-PET nÃo protegeu plantas de maracujazeiro contra a super infecÃÃo de PWV-GUA. AnÃlises filogenÃticas das seqÃÃncias dos fragmentos de cDNA correspondentes Ãs capas protÃicas (CP), amplificados a partir dos genomas dos isolados virais de maracujazeiro e de feijoeiro caupi por IP-RT-PCR, agruparam-se com as seqÃÃncias de isolados virais de referidas culturas depositadas no GenBank, apresentando um agrupamento em funÃÃo da especificidade de hospedeiros. Com base nos resultados dos estudos biolÃgicos, sorolÃgicos e, sobretudo moleculares, os isolados virais estudados foram classificados em dois biÃtipos: BiÃtipo CABMV-C (Cowpea) incluindo os isolados obtidos de feijoeiro caupi e biÃtipo CABMV-P (Passion fruit) para incluir os isolados responsÃveis pelo endurecimento dos frutos do maracujazeiro no Brasil.

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), destaca-se como um importante patógeno emergente causador de diarréia persistente em países em desenvolvimento e de diarréia aguda em países desenvolvidos. A grande heterogeneidade dos fatores de virulência caracteriza esta categoria, porém não foi estabelecido um marcador genético comum a todas as amostras de EAEC. O padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2 e HeLa é a forma de caracterização e diagnóstico mais precisos desta categoria. Uma das toxinas envolvidas na patogênese é Plasmid-encoded toxin (Pet) pertencente à classe das proteínas autotransportadoras com características de uma serino protease denominada SPATEs. Iniciou-se este estudo com a determinação do padrão de adesão de 164 amostras EAEC, previamente caracterizadas como sonda pCVD432 ou onda AA positiva. Assim, 141 (86%) amostras, que apresentaram padrão de adesão agregativo, foram caracterizadas como EAEC. Face aos resultados obtidos, confirmou-se a baixa especificidade da sonda AA. A pesquisa do gene pet, por meio de ensaio de PCR, resultou na positividade de 12 (8,5%) amostras. Prosseguiu-se esse estudo com a padronização da reação de immuno-dot. Utilizando-se 300 µL do sobrenadante bacteriano, soro policlonal anti-Pet e o conjugado nas diluições 1/50 e 1/2.500, respectivamente, resultados bastante reprodutíveis foram obtidos. O método foi mais sensível que a detecção do gene por PCR. Por esse ensaio, detectou-se a toxina Pet em 16 (11,3%) das 141 amostras EAEC. Nenhuma das amostras controle negativo foi reconhecida pelo soro anti-Pet, assim como as amostras de E. coli produtoras das mais diversas toxinas. Apesar da baixa prevalência de amostras de EAEC produtoras da toxina Pet, neste estudo padronizou-se um método rápido, sensível, específico e de baixo custo para pesquisa desta toxina mostrando o potencial diagnóstico deste ensaio para uso em inquéritos epidemiológicos, o que poderá permitir determinar o papel da Pet no desenvolvimento de diarréia aquosa. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAggEC) is an emerging diarrheal pathogen, whose pathogenesis is thought to comprise colonization of the intestinal mucosa with the release of secretogenic toxins. One of the toxin involved is the plasmid-encoded toxin (Pet), which is secreted by the autotransporter mechanism and belongs to a growing class of Enterobacteriaceae autotransporter proteins. Since the characteristic aggregative adherence pattern of EAggEC is associated with the presence of a large plasmid called pCVD432, DNA probes and PCR primers derived from this plasmid have been recommended as a screening method for EAggEC in the clinicai laboratory. In this study 164 E. coli isolates positive for the pCVD432 probe were tested for adherence to HEp-2 cells in which 141 isolates showed aggregative pattern, 12 isolates from them amplify a 1037-bp DNA fragment corresponding to pet gene by PCR. Using this samples we standardized an immuno-dot assay for EAggEC detection through Pet toxin as target antigen. 300 µl of bacterial supernatant were applied in a PVDF membrane, and using a rabbit polyclonal sera anti-Pet the expression of the toxin by immuno-dot was in the same isolates in which the gene was detected. Besides no negative controls reacted with Pet antisera, in which we included 40 isolates with no virulence markers for diarrheagenic E. coli and E. coli expressing toxins other than Pet. This method proves to be rapid, sensitive, specific and low cost, demonstrating this potential as diagnosis for Pet expression and its association with diarrhea.

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), destaca-se como um importante patógeno emergente causador de diarréia persistente em países em desenvolvimento e de diarréia aguda em países desenvolvidos. A grande heterogeneidade dos fatores de virulência caracteriza esta categoria, porém não foi estabelecido um marcador genético comum a todas as amostras de EAEC. O padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2 e HeLa é a forma de caracterização e diagnóstico mais precisos desta categoria. Uma das toxinas envolvidas na patogênese é Plasmid-encoded toxin (Pet) pertencente à classe das proteínas autotransportadoras com características de uma serino protease denominada SPATEs. Iniciou-se este estudo com a determinação do padrão de adesão de 164 amostras EAEC, previamente caracterizadas como sonda pCVD432 ou onda AA positiva. Assim, 141 (86%) amostras, que apresentaram padrão de adesão agregativo, foram caracterizadas como EAEC. Face aos resultados obtidos, confirmou-se a baixa especificidade da sonda AA. A pesquisa do gene pet, por meio de ensaio de PCR, resultou na positividade de 12 (8,5%) amostras. Prosseguiu-se esse estudo com a padronização da reação de immuno-dot. Utilizando-se 300 µL do sobrenadante bacteriano, soro policlonal anti-Pet e o conjugado nas diluições 1/50 e 1/2.500, respectivamente, resultados bastante reprodutíveis foram obtidos. O método foi mais sensível que a detecção do gene por PCR. Por esse ensaio, detectou-se a toxina Pet em 16 (11,3%) das 141 amostras EAEC. Nenhuma das amostras controle negativo foi reconhecida pelo soro anti-Pet, assim como as amostras de E. coli produtoras das mais diversas toxinas. Apesar da baixa prevalência de amostras de EAEC produtoras da toxina Pet, neste estudo padronizou-se um método rápido, sensível, específico e de baixo custo para pesquisa desta toxina mostrando o potencial diagnóstico deste ensaio para uso em inquéritos epidemiológicos, o que poderá permitir determinar o papel da Pet no desenvolvimento de diarréia aquosa. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAggEC) is an emerging diarrheal pathogen, whose pathogenesis is thought to comprise colonization of the intestinal mucosa with the release of secretogenic toxins. One of the toxin involved is the plasmid-encoded toxin (Pet), which is secreted by the autotransporter mechanism and belongs to a growing class of Enterobacteriaceae autotransporter proteins. Since the characteristic aggregative adherence pattern of EAggEC is associated with the presence of a large plasmid called pCVD432, DNA probes and PCR primers derived from this plasmid have been recommended as a screening method for EAggEC in the clinicai laboratory. In this study 164 E. coli isolates positive for the pCVD432 probe were tested for adherence to HEp-2 cells in which 141 isolates showed aggregative pattern, 12 isolates from them amplify a 1037-bp DNA fragment corresponding to pet gene by PCR. Using this samples we standardized an immuno-dot assay for EAggEC detection through Pet toxin as target antigen. 300 µl of bacterial supernatant were applied in a PVDF membrane, and using a rabbit polyclonal sera anti-Pet the expression of the toxin by immuno-dot was in the same isolates in which the gene was detected. Besides no negative controls reacted with Pet antisera, in which we included 40 isolates with no virulence markers for diarrheagenic E. coli and E. coli expressing toxins other than Pet. This method proves to be rapid, sensitive, specific and low cost, demonstrating this potential as diagnosis for Pet expression and its association with diarrhea.