Les systèmes de sécrétion de NO3– de la membrane plasmique des cellules végétales jouent un rôle important dans l'activité stomatique et la réponse des plantes à des stress biotiques et abiotiques. Malgré quelques avancées récentes, ces systèmes restent mal connus sur le plan moléculaire. Mon travail de thèse a consisté à caractériser le rôle physiologique de NAXT2, un membre du sous-groupe NAXT (NitrAte eXcretion Transporter) de la famille des transporteurs NRT1/PTR chez Arabidopsis thaliana. Mes résultats montrent que NAXT2 est un transporteur de NO3– et qu'il est principalement exprimé dans les cellules du péricycle de la racine, au voisinage des vaisseaux xylémiens. Sous contrainte saline et comparativement aux plantes sauvages (WT), un mutant knock-out pour NAXT2 (naxt2-1) présente un défaut de distribution du NO3– vers les feuilles et de sécrétion du NO3– dans la sève xylémienne, qui se traduisent par une diminution des teneurs en NO3– foliaires. NAXT2 est donc impliqué dans la charge du xylème en NO3– sous contrainte saline. Aucune des différences phénotypiques mises en évidence entre le mutant et WT sous contrainte saline n'a été observée sous stress osmotique ou en condition standard, suggérant que NAXT2 est essentiellement impliqué dans la réponse à la composante ionique du stress salin. Enfin, après un traitement salin prolongé, la biomasse foliaire de naxt2-1 est inférieure à celle de WT, ce qui indique que NAXT2 joue un rôle important dans l'adaptation des plantes aux contraintes salines modérées. Dans l'ensemble, ce travail suggère que NAXT2 est impliqué dans une fonction physiologique majeure, la translocation du NO3–, point de contrôle de la distribution du nitrate, et dans l'adaptation de la plante aux contraintes salines. / NO3– secretion systems at the plasma membrane of plant cells play an important role in stomata activity and plant response to biotic and abiotic stresses. Despite of few recent advances, these systems are still poorly known at the molecular level. During my thesis, I worked on the characterization of the physiological role of NAXT2, a member of the NAXT (NitrAte eXcretion Transporter) sub-group from the large NRT1/PTR transporters family in Arabidopsis thaliana. The results presented here show that NAXT2 is a NO3– transporter and that it is mainly expressed in root pericycle cells, close to the xylem vessels. Under salinity constraint and relatively to wild type plants (WT), a NAXT2 knock-out mutant (naxt2-1) displayed a defect in NO3– distribution towards the shoots and in NO3– secretion into the xylem sap, which lead to a decrease in shoot NO3– content. Thus, NAXT2 is involved in NO3– xylem loading under salinity constraint. None of the phenotypic differences described in this work between WT and mutant was observed under osmotic stress or standard culture conditions, suggesting that NAXT2 is specifically involved in response to the ionic component of salt stress. Finally, after a prolonged salt treatment, naxt2-1 shoot biomass was lower than that of WT, indicating that NAXT2 plays an important role in plant adaptation to mild salinity constraint. Altogether, this work suggests that NAXT2 is involved in a major physiological function, the NO3– translocation, control point of nitrate distribution and in plant adaptation to salinity constraint.

Chez les plantes supérieures, l’organogénèse est principalement post-embryonnaire et assurée par les méristèmes. Les familles de gènes CLE (CLAVATA3/ENDOSPERMSURROUNDING REGION related) et WOX (WUSCHEL-LIKE HOMEOBOX) sont des régulateurs majeurs de l’activité des méristèmes. Des analyses phylogénétiques des gènes WOX de différentes espèces ont identifié trois groupes d’orthologie, dont le groupe WOX13OG. Ce dernier contient le seul gène WOX d’Ostreococcus tauri, les trois gènes WOX de Physcomitrella patens, ainsi que trois des gènes WOX parmi les quinze que compte Arabidopsis thaliana. L’objectif de ma thèse a été de caractériser la fonction des gènes du groupe WOX13 OG chez A. thaliana.Parmi les mutants nuls identifiés pour ces gènes, seul le mutant wox14 présente des phénotypes forts, à savoir un retard de transition florale et des défauts de développement vasculaire. Ces résultats sont en accord avec l’induction de l’expression de WOX14 à la jonction des faisceaux vasculaires lors de la transition florale. Les résultats indiquent que WOX14 est impliqué dans le contrôle du nombre de faisceaux vasculaires initiés lors de cette dernière. La restauration conjointe de la transition florale et du nombre de faisceaux vasculaires, par complémentation du mutant wox14 ou application de gibbérellines (GA),suggère un lien direct entre ces deux processus. Cette étude nous a permis d’identifier le gène CLE46 comme étant dérégulé dans le mutant wox14. Son expression dans les cellules du xylème, associée à l’augmentation du nombre de faisceaux vasculaires chez wox14, suggèrent que CLE46 est un élément d’une voie de signalisation de contrôle du nombre de faisceaux vasculaires. L’importance des interactions WOX-CLE dans le développement vasculaire est soulignée par l’induction de WOX4 et WOX14 par le peptide CLE41. Les analyses du transcriptome du mutant wox14 révèlent que la signalisation des GA est déficiente. Ce qui confirme les résultats de la complémentation du phénotype wox14 par les GA. De plus, le gène GA3ox1 a été identifié comme une cible potentielle de régulation de la biosynthèse de GA par le gène WOX14. / Whilst primary meristems are initiated during embryogenesis, in higher plants additionalsecondary meristems initiate post-embryonically and contribute to the plant architecture andthe vascular strand development. Differentiation of the plant vascular cambium into xylemand phloem was shown to be regulated by cell to cell communication. The large CLE(CLAVATA3/ENDOSPERM SURROUNDING REGION related) signaling peptide familyand the WOX (WUSCHEL-LIKE HOMEOBOX) transcription factor family are thought to beconserved regulators of stem cell fate. In this thesis we report the presence of supernumeraryvascular bundles in the young inflorescence stem of the wox14 mutant. Our data indicate thatWOX14 prevents additional cambium cell to differentiate into vascular bundles during floraltransition. Moreover, the data suggest that vascular differentiation and floral transition arelinked. Consistently, WOX14 expression is induced within the connecting vascular strandduring floral transition. Furthermore, the application of gibberellins (GA) fully rescued boththe floral transition and the vascular bundle phenotype of the wox14 mutants. A detail analysisof GA biosynthesis and target genes showed that WOX14 controls the amount of bioactiveGA within the vasculature. However, WOX14 is also specifically expressed in the phloem ofthe inflorescence stem indicating a function in late vascular bundle development. We alsoshowed that not only WOX4 but also WOX14 are the target of the CLE41 peptide duringvascular development. Furthermore, the data indicate that another CLE gene, namely CLE46,is misregulated in the wox14 mutant. These results suggest that CLE46 might be the firstidentified CLE signal from the xylem that impacts vascular differentiation.

Le remodelage de la chromatine et la modification des histones jouent des rôles très importants dans l’établissement et la reprogrammation de l’état de l’expression génique. Il reste largement inconnu concernant les mécanismes de la régulation de ces processus chromatiniens dans le contrôle de l’expression génique impliquée dans le développement de la plante et son adaptation à l’environnement. Mon sujet de thèse se focalise sur l’analyse fonctionnelle d’un facteur de remodelage de la chromatine de type Chromodomain/Hélicase/DNA-binding 1 (CHD1) d’Arabidopsis, appelé CHR5 et une histone démethylase qui est spécifiquement impliquée dans la démethylation de l’histone H3 lysine 4 (H3K4), appelée JMJ15. Dans la première partie de cette étude, nous avons montré que le gène CHR5 est activé au cours de l’embryogénèse et que son expression se maintient élevé dans les tissues/organes en développement. L’analyse de mutants révèle que la perte de fonction de ce gène fait réprimer l’expression de gènes régulateurs de la maturation de l’embryon tels que LEC1, ABI3 et FUS3 pendant le développement des graines, et fait baisser l’accumulation des protéines de réserve. L’analyse de double mutants a permis de démontrer une fonction antagoniste entre CHR5 et PKL, une protéine du groupe « CHD3 », dans l’activité du promoteur de gènes régulateurs du développement de l’embryon et l’accumulation de réserve de graine. Nous avons montré que la protéine CHR5 s’associe directement avec les promoteurs d’ABI3 et FUS3 et que la mutation du gène CHR5 conduit à l’augmentation de présence de nucléosome dans la région du départ de transcription. Ces résultats suggèrent que CHR5 est impliquée dans le positionnement de nucléosome pour stimuler l’expression de gènes de la maturation de l’embryon, ce qui est contrebalancé par l’action de PKL au cours du développement de l’embryon. La deuxième partie de cette étude a permis de montrer que l’expression du gène de l’histone démethylase JMJ15 manifeste une forte spécificité tissulaire. L’analyse de mutants du gène a permis de l’identification de 2 allèles de gain de fonction (avec surexpression du gène), et un allèle de perte de fonction. La surexpression du gène réduit la croissance d’hypocotyle et de tige de la plante avec accumulation de lignine dans la tige, mais le perte de fonction du gène ne produise pas de phénotype apparent. Par ailleurs, la surexpression du gène renforce la tolérance de la plante au stress salin, alors la perte de fonction du gène rend la plante plus sensible. L’analyse du transcriptome a révélé beaucoup plus de gènes réprimés qu’activés par la surexpression du gène JMJ15. Ces gènes réprimés sont préférentiellement marqué la H3K4me2 ou H3K4me3, parmi lesquels beaucoup codent de facteurs de transcription. Ces données suggèrent que l’induction de JMJ15 pourrait réguler le programme de l’expression génique qui coordonne la restriction de la croissance de la plante et la tolérance au stress. Ces travaux de thèse a permis ‘identifier quelques nouveaux éléments dans la compréhension de la fonction de régulateurs chromatiniens dans l’expression génique de la plante. / Chromatin remodeling and histone modification play important roles in the establishment and dynamic regulation of gene expression states. However, little is known regarding to the regulatory mechanism of chromatin modification and remodeling that control gene expression involved in plant development and responses to environmental cues. My thesis work concerns functional analysis of an Arabidopsis Chromodomain/Helicase/DNA-binding 1 (CHD1) type chromatin remodeling gene known as CHR5 and a histone demethylase gene that specifically removes methyl groups from methylated histone H3 lysine 4 (H3K4me), called JMJ15 in regulating chromatin structure or in resetting chromatin modifications that control the expression of plant developmental and stress responsive genes. In the first part of the study we found that CHR5 expression is activated during embryogenesis and remained to be expressed in developing organs/tissues. Analysis of mutants revealed that loss-of-function of the genes led to decreased expression of key embryo maturation genes LEC1, ABI3 and FUS3 in developing seeds and reduced seed storage protein accumulation. Analysis of double mutants revealed an antagonistic function between CHR5 and PKL, a CHD3 gene, in embryo gene promoter activity and seed storage protein accumulation. CHR5 was directly associated with the promoters of ABI3 and FUS3 and chr5 mutations led to increased nucleosome occupancy near the transcriptional start site. The results suggest that CHR5 is involved in nucleosome occupancy to regulate embryo identity genes expression, which is counterbalanced by PKL during embryo development. The second part of this study showed that expression of JMJ15 was restricted to a few tissues during vegetative growth. The jmj15 gain-of-function mutations reduced the length of seedling hypocotyls and inflorescence stems with higher accumulation of lignin in the stem, while the loss-of-function mutants did not show any visible phenotype. The gain-of-function mutants enhanced salt tolerance, whereas the loss-of-function mutants were more sensitive to salt. Transcriptomic analysis revealed a much higher number of genes down-regulated in JMJ15 over-expression plants, which are highly enriched for H3K4me3 and H3K4me2. Among the down-regulated genes, many encode transcription regulators of stress responsive genes. The data suggest that increased JMJ15 levels may regulate the gene expression program that may coordinate plant growth restrains and enhances stress tolerance. Taken together, my thesis work brought a few new elements to the current understanding of chromatin regulators function in plant gene expression.

Les plantes sont des organismes sessiles se développant dans un environnement hétérogène et fluctuant. La capacité d'acquisition des nutriments par le système racinaire est donc un caractère important pour leur croissance et leur développement.L'azote (N), notamment sous forme nitrate (NO3-), fait partie de ces éléments qui sont limitant pour la croissance des plantes mais aussi très mobiles dans le sol donc fréquemment distribués de façon hétérogène. Les plantes s'adaptent à cette contrainte en modulant le développement racinaire ainsi que la capacité de transport de ce nutriment dans les différentes parties du système racinaire en fonction de la disponibilité en NO3- et du besoin en azote (N) de la plante entière. Cette adaptation repose donc sur la combinaison de deux voies de signalisation, i) une signalisation locale dépendante de la disponibilité en NO3- dans le milieu extérieur ii) une signalisation longue distance (ou systémique) racines-feuilles-racines relative au besoin en N de la plante entière.Toutefois, les bases moléculaires de la signalisation longue distance comme les mécanismes de régulation qui y sont associés ne sont pas totalement connus. Ils reposent sur l'intégration au niveau des parties aériennes de signaux d'origine racinaire, provenant des racines exposées au NO3- mais aussi de celles qui en sont privées. Les parties aériennes jouent alors un rôle majeur dans la modulation de la physiologie et du développement racinaire en condition de disponibilité hétérogène en NO3-. Des études précédentes ont montré que la biosynthèse de cytokinines est essentielle pour la mise en place de cette réponse adaptative. De plus, il est connu qu'après un apport de NO3-, la biosynthèse de cette hormone dans les racines puis son accumulation dans les parties aériennes est augmentée. Dans ce contexte, nous avons émis l'hypothèse que les cytokinines pourraient correspondre à un messager racines/feuilles important pour la signalisation systémique NO3--dépendante.L'objectif de mon projet de thèse consistait à comprendre comment les parties aériennes contrôlent l'acquisition racinaire du NO3- en condition de disponibilité hétérogène en NO3-. Pour reproduire cette condition en laboratoire, le système de 'split-root', permettant de séparer le système racinaire en deux parties isolées pouvant être traitées différemment, a été utilisé pour exposer les plantes à différentes conditions de disponibilité en NO3-. Dans ces différentes conditions, les réponses moléculaires, métaboliques et physiologiques ont été caractérisées chez des plantes sauvages d'Arabidopsis et comparées à celles de mutants affectés dans la biosynthèse, le transport acropetal ou encore dans la perception des cytokinines. La combinaison de ces différentes approches m'a ainsi permis de démontrer que les cytokinines, et plus précisément les trans-zéatines, sont effectivement un messager racines-feuilles crucial pour la mise en place des réponses de la racine à une disponibilité hétérogène en NO3-. De plus, j'ai montré que l'apport hétérogène en NO3- comparé à l'apport homogène entraîne une importante reprogrammation de l'expression génique dans les parties aériennes qui est largement dépendante de ce transport de trans-zéatines vers les feuilles. Enfin, l'intégration de ces données transcriptomiques au sein de réseaux géniques a permis d'identifier des gènes candidats intéressants comme acteurs possibles de la signalisation feuilles-racines. / Plants are sessile organisms growing in a heterogeneous and fluctuating environment. Thus, foraging for nutrients is an important trait for plant growth and development. Nitrogen (N), especially as nitrate (NO3-) form, is one limiting element for plant growth but is also highly mobile in the soil leading to frequent heterogeneity distribution. Plants are managing this constraint through the regulation of root development and NO3- uptake in the different parts of the root system according to the spatial NO3- availability and the N needs of the whole plant. This adaptation relies on a dual signaling pathway involving i) a local signaling related to external NO3- supply and ii) a root-shoot-root long-distance (systemic) signaling related to the plant N needs..However, the molecular basis of the long-distance signaling as well as the regulatory mechanisms associated with, are not fully understood. They rely on the integration at the shoot level of signals originating from both NO3--supplied and N-deprived root parts. Therefore, the shoots have a key role for an efficient adaptation to heterogeneous NO3- environment through the adjustment of root physiology and development. Previously, cytokinin biosynthesis has been shown to be essential for both molecular and morphological root responses to NO3- heterogeneous environment. Moreover, it is known that upon NO3- supply, de novo biosynthesis of this hormone in the roots is increased along with its accumulation in the shoots. In this context, we hypothesized that cytokinins could correspond to an important root to shoot signal involved in NO3--dependent systemic signaling.The main objective of my PhD project was to decipher and understand how the shoots control root NO3- acquisition in response to spatial NO3- heterogeneity. To do so, we used the 'split-root' system, in which physically isolated roots of a same plant are challenged with different NO3- environments. In this framework, we characterized physiological, metabolic and molecular responses of Arabidopsis wild-type plants that we compared to responses of mutants impaired in cytokinin biosynthesis, acropetal transport or perception. The combination of these different approaches allowed me to demonstrate that cytokinins, and especially trans-zeatin species are indeed a root to shoot messenger that is crucial for root responses to spatial NO3- heterogeneity. Moreover, I have shown that NO3- heterogeneous supply compared to homogeneous supply triggers a substantial reprogramming of gene expression in aerial part, which largely depends on this trans-zeatin transport toward the shoots. Finally, the integration of these transcriptomic modifications into gene networks led to the identification of interesting candidate genes to characterize the shoot-to-root signaling.

Les plantes sont continuellement exposées à plusieurs stress biotiques et abiotiques. Les réponses des plantes à ces stress sont très complexes et impliquent des changements au niveau physiologique, moléculaire et cellulaire. Parmi ces stress, la sécheresse (déficit hydrique) est l'un des facteurs les plus préjudiciables à la croissance et à la productivité des plantes. Ce stress est considéré comme une menace sérieuse pour la production de cultures durables, en particulier dans la perspective du changement climatique. Le but de ce travail a d’abord été d'étudier les traits et / ou les mécanismes impliqués dans la réponse des plantes au déficit hydrique sous condition de zinc en utilisant l’espèce extremophile Arabidopsis halleri. Les plantes de l’espèce A. halleri sont hypertolérantes et hyperaccumulatrice des métaux zinc et cadmium; cette caractéristique évolutive représente un potentiel précieux pour étudier les réponses des plantes à des contraintes multiples. Ici, nous avons développé une approche comparative en utilisant A. halleri et deux espèces qui sont étroitement apparentées: A. thaliana et A. lyrata, tous les deux sensibles à l'excès de zinc. Nous avons caractérisé les caractères morpho-physiologiques de ces trois espèces en réponse à des combinaisons de déficit hydrique et d'excès de zinc. Les résultats ont montré que les plantes de l’espèce A. halleri ont une tolérance accrue au déficit hydrique par rapport à ce qui est observé chez A. thaliana et A. lyrata lorsqu'elles sont cultivées sous forte concentration de zinc dans le sol. Les plantes A. halleri ont montré une plus grande capacité à contrôler la teneur en eau des feuilles en réduisant la perte d'eau par transpiration due à la réduction de la conductance stomatique, ce qui a finalement augmenté positivement l'efficacité d'utilisation de l'eau. Notre étude montre que l'excès de zinc et le déficit hydrique ont des effets négatifs additifs sur la croissance des plantes des espèces A. thaliana alors qu'A. lyrata est moins affecté par l'addition de Zn au sol conditions WD. La combinaison de ces stress a effet interactif positif sur la croissance des plantes A. halleri. D'autre part, les défensines de plantes (PDF) sont impliquées dans la réponse des plantes aux stress biotiques et abiotiques. Le but de ce travail a également été de comprendre la contribution des PDF type 1 (PDF1s) dans la réponse des plantes à l'excès de zinc en utilisant comparativement des plantes A. thaliana sauvages et des plantes transgéniques amiRNA ciblant la diminution des transcrits PDF1s. Nous avons comparé les caractéristiques physiologiques de plantes matures cultivées en présence d’un excès de zinc dans le sol, et dans des conditions hydroponiques. Nos résultats montrent que, sous l’effet du zinc, la diminution des transcrits AtPDF1s est associée à une tolérance au zinc plus faible que celle observée chez les plantes A. thaliana sauvages sans changement du contenu en zinc. / Plants are continuously exposed to several biotic and abiotic stresses. Plant responses to these stresses are highly complex and involve changes at the transcriptome, cellular, as well as physiological levels. Among these stresses, drought is one of the most detrimental factors for plant growth and productivity and is considered a severe threat for sustainable crop production, especially under current changing climate. The aim of this study is to investigate traits and/or mechanisms involved in plants response to water deficit under zinc condition using plant material A. halleri. Arabidopsis halleri is a hypertolerant and hyperaccumulator plant species for zinc and cadmium; this evolutionary feature represents a valuable potential to investigate plant responses to multiple stresses. Here, we developed a comparative approach using this particular species and two closely related species, A. thaliana and A. lyrata, both sensitive to zinc excess. We characterized morpho-physiological traits of three Arabidopsis species in response to combinations of water deficit and zinc excess. The findings showed that, A. halleri plants has increased tolerance to water deficit compared to A. thaliana and A. lyrata when grown under high zinc concentration in the soil. A. halleri showed higher ability to control leaf water content by reduced water loss through transpiration due to reduction of stomatal conductance which ultimately positively increased water use efficiency. Our study shows that, zinc excess and water deficit have additive negative effects on the growth of A. thaliana species plants, whereas A. lyrata is less affected by the addition of Zn under conditions of WD compared to WW conditions. The combination of these stresses has a positive interactive effect on the growth of A. halleri plants. In other hand, plant defensins (PDF) are involved in plant responses to biotic and abiotic stresses. The purpose of this work was also to understand the contribution of PDF Type 1 (PDF1s) in the response of plants to zinc excess using comparatively wild-type A. thaliana plants and transgenic amiRNA plants targeting the reduction of transcripts PDF1s. We compared the physiological characteristics of mature plants grown in the presence of excess zinc in the soil, and under hydroponic conditions. Our results show that, under the effect of zinc, the decrease in AtPDF1s transcripts is associated with a lower zinc tolerance than that observed in wild-type A. thaliana plants without a change in zinc content.

The relationship between leaf and its environment has resulted in a tremendous diversification of leaf shape within and between plants species, which is important to cope with the differing environmental conditions. Arabidopsis lyrata is a prime model plant that shows leaf shape variation within species and between related species. In Cardamine and Capsella, the RCO genes (homeodomain leucine zipper family transcription factors) are involved in shaping leaves, yielding more complex shaped leaves (leaflets). In A. thaliana, over the course of evolution, the RCO-A and RCO-B paralogous genes have been deleted that led to the loss of lobes (leaf simplification). Based on previous quantitative trait locus (QTL) mapping results, these gene family members are thought to control leaf shape variation also in A. lyrata. Since the paralog involved in leaf shape variation is unknown, both copies of the RCO genes (AL6G13350 and AL6G13360) were sequenced. The study aimed to identify whether DNA sequence variation exists in the two paralogous RCO genes, which could explain the phenotype variation both within population and between A. lyrata populations, along with related species A. arenosa. The results showed limited variation in the coding regions in the form of indels, single nucleotide polymorphisms (SNPs) and amino acid substitutions resulting in no significant difference in phenotype between genotype (p>0.139). The most variants were rare and increasing the number of individuals within the populations, to cover the full phenotypic spectrum, may lead to different results. Not being able to obtain the nucleotide sequence of the promotor region, further analysis is required since it is an important region for gene expression, which could explain phenotype variation for leaf shape in Arabidopsis lyrata.

Chez les plantes, les stress biotiques et abiotiques causent la surproduction d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les chloroplastes et les mitochondries. Ces ROS provoquent des dommages parfois irrémédiables pour la cellule ou déclenchent des voies de signalisation rétrogrades qui induisent la tolérance au stress. En parallèle, le génome nucléaire contrôle le développement et l’activité des organites grâce à la signalisation antérograde. Dans ce contexte, le complexe nucléaire Topoisomérase VI (Topo VI) a été étudié chez Arabidopsis thaliana. Topo VI est un régulateur des gènes de réponse à la signalisation rétrograde de la ROS oxygène singulet ; toutefois, les mécanismes qui régissent cette régulation sont inconnus. Afin de les déterminer, des interacteurs de la Topo VI ont été mis en évidence dont la sous-unité alpha du facteur général de transcription TFIIF (TFIIFα). Après caractérisation de l’expression du gène TFIIFα et des isoformes protéiques codées, des analyses transcriptomiques réalisées en condition standard de croissance et en condition de stress photo-oxydant ont montré que Topo VI et TFIIFα co-régulent la majorité des gènes de réponse à ce stress. De plus, ces interacteurs ont un rôle opposé dans la régulation de l’expression de gènes « PentatricoPeptide Repeat » (PPR). Les protéines PPR sont adressées aux chloroplastes et aux mitochondries dans lesquels elles participent à la régulation post-transcriptionnelle ; chez des mutants tfIIfα, des gènes PPR impliquées dans l’édition des ARN sont réprimés et l’édition de sites cibles associés est parfois altérée. Les conséquences de ces altérations sont discutées par l’analyse de fonctions chloroplastiques. / Under biotic and abiotic stress, plants overproduce reactive oxygen species (ROS) in plastids and mitochondria. ROS can cause damages sometimes definitive for cells or trigger retrograde signalling pathways to the nucleus that provide stress tolerance. Concurrently, the nuclear genome controls the development and the activity of organelles through anterograde signalling. In this context, the nuclear complex Topoisomerase VI (Topo VI) is studied in Arabidopsis thaliana. Topo VI is a regulator of stress responsive genes in the retrograde signalling triggered by the singlet oxygen ROS; nevertheless, the mechanisms controlling this regulation are still unknown. To determine them, Topo VI interactors were found out, including the alpha subunit of the general transcription factor TFIIF (TFIIFα). TFIIFα gene expression and the encoded protein isoforms were first characterized and then, transcriptomic analysis in standard growth conditions and under photo-oxidative stress showed that Topo VI and TFIIFα co-regulate most of stress responsive genes. Moreover, these interactors have an opposite role in the expression of "PentatricoPeptide Repeat" (PPR) genes. PPR proteins are targeted to plastids or mitochondria in which they contribute to post-transcriptional regulation mechanisms; in tfIIfα mutants, PPR genes involved in organellar RNA editing are down-regulated, and the editing of associated target sites was sometimes impaired. Possible consequences of this impairment were discussed through the analysis of plastidial functions.

O gene thi1 foi isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de A. thaliana devido à sua capacidade de complementar mutantes de E. coli para rotas de reparo de DNA. O posterior seqüenciamento desse gene permitiu a identificação de similaridade com genes de fungos ativados em condições de estresse ou ativados na ausência de tiamina (vitamina B1). A síntese de tiamina é de grande importância já que na forma pirofosfatada é coenzima essencial para vários processos vitais das células. No presente estudo, foi realizada a caracterização funcional do gene thi1 utilizando-se, para tanto, linhagens de A. thaliana mutante e/ou com expressão diferencial desse gene. Foram analisados parâmetros biológicos como viabilidade de sementes, antioxidantes, danos no DNA, e atividade transcricional e traducional do gene thi1. Foi iniciado, também, o processo de padronização da quantificação de tiamina em plantas. Foi observado, para a linhagem mutante, menor viabilidade de sementes, maior produção de antioxidantes e maior quantidade de danos no DNA de cloroplastos. Quanto à atividade transcricional e traducional, foi observado que o gene thi1 apresenta um pico de expressão no período da tarde com um ritmo circadiano em potencial. Além disso, o acúmulo da proteína nos tecidos acompanha o perfil de expressão de RNAm thi1, o que sugere que o modo de regulação primária do gene é em nível transcricional. A análise comparativa de proteína por gel bi-dimensional entre as linhagens selvagem e mutante permitiu a identificação de quatro proteínas em maior quantidade na mutante, sendo duas identificadas por seqüenciamento: enolase e fosfoglicerato desidrogenase. Na análise de tiamina foi observado que a linhagem mutante acumula um composto, não identificado, que emite fluorescência no mesmo comprimento de onda que as tiaminas, sendo, provavelmente, um precursor do tiazol. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que THI1 defectivo acarretaria em desbalanço metabólico e, não necessariamente, que o gene thi1 estaria envolvido em dupla função. Em bactérias, entre os precursores de tiazol, estão a cisteína e o gliceraldeído 3-fosfato (G3P). O G3P em excesso seria deslocado para o ciclo de Calvin a fim de regenerar a ribulose 1,5-bisfosfato. Maior quantidade de G3P, maior taxa fotossintética, maior produção de ROS, maior produção de antioxidantes na mutante. A maior disponibilidade de G3P aumentaria o fluxo de glicólise e, consequentemente, de respiração mitocondrial, aumentando a taxa de ROS. A fosfoglicerato desidrogenase, em maior quantidade na mutante, está envolvida na síntese de cisteina que acarreta na produção de glutationa. A glutationa e a cisteína, por sua vez, atuariam induzindo o promotor da SOD, acarretando, então, na produção de mais antioxidantes. Todos esses antioxidantes estariam envolvidos na detoxificação de ROS presente em excesso na linhagem mutante, que levaria à menor viabilidade de sementes e maior quantidade de danos no DNA. Devido à grande quantidade de ROS, haveria superexpressão de enolase, envolvida no bloqueio da proliferação celular e, subsequentemente, em morte celular programada, o que explicaria o retardo no desenvolvimento da linhagem mutante / thi1 gene was previously isolated from A. thaliana cDNA library due to its capacity to complement mutant Escherichia coli defective in DNA repair. The late analyse of this gene showed its similarity with yeast genes activated under stress conditions or activated in the absence of thiamine. It means that THI1 has bifunctional activity, being involved in thiamine biosynthesis and repair/tolerance to DNA damage. The thiamine biosynthesis is important because its phosphorilated form is a coenzyme essential to several vital process at the cell. The repair/tolerance to DNA damage shows its importance because it is necessary to maintenance the genetic stability of the individual. In the present study, we report the functional characterization of thi1 gene using A. thaliana lines with differential expression of this gene. We analyzed the seed viability, the fresh weight of different lines, thi1 mRNA expression, the amount of protein produced and the expression in situ using the thi1-GUS construction in different conditions. Besides that we quantified free radicals in the wild-type (WT) and mutant lines and analysed the response of the mutant line, with defective THI1, to the production of antioxidant enzymes and non-enzimatics antioxidants. We also quantified DNA damage in chloroplast of WT and mutant lines and we did comparative proteomic analysis between and began the standardization of the thiamine quantification in plants. All these results together lead us up to a better understanding about THI1 activity at the cellular metabolism. Previous results suggested that besides thiamine synthesis, THI1 would be involved in repair/tolerance to DNA damage. Results obtained in this study strengthen the hypothesis of this another function of the thi1 gene. Considering that the mutant line does not produce a higher quantity of ROS, as indicated by hydrogen peroxide quantification, but shows more antioxidants and more DNA damage, probably the genetic material of this line is more susceptible to damage, showing that the defective THI1 protein could not protect it efficiently.

Dans cette thèse, j’ai cherché à étudier l’impact du contenu et de la structure du nucléole sur les fonctions nucléolaires chez A. thaliana. Pour cela je me suis appuyée sur deux cas concrets : 1- J’ai réalisé le protéome du nucléole et caractérisé une de ces activités non-ribosomales / 2- J’ai étudié l’impact du fer nucléolaire dans la biogenèse des ribosomes.D’une part, le protéome nucléolaire d’A. thaliana m’a permis d’identifier des protéines nucléolaires dont les fonctions connues sont extra-ribosomales. Ainsi j’ai démontré que l’activité du protéasome 26S peut être régulée par le nucléole. Plus précisément l’activité du protéasome diminue lors d’une déstructuration du nucléole. De plus, j’ai constaté que le protéasome 26S, conjointement avec la protéine Nucléoline, pourrait avoir un rôle dans la transcription et/ou la maturation des ARNr.D’autre part, j’ai démontré que l’absence de fer nucléolaire (chez des plantes mutantes nas1,2,4) provoque une augmentation des structures nucléolaires propices à la transcription (les centres fibrillaires). Cette observation est corrélée à la transcription de l’ADNr du NOR2, normalement réprimé. Et, de manière inattendue, est liée avec l’hyperméthylation des promoteurs des ADNr en contexte CHH. Il se peut alors que le fer régule des facteurs impliqués dans les mécanismes épigénétiques responsables de la répression ou de l’activation des ADNr. / The aim of this thesis work is to highlight the impact of both nucleolus content and structure on nucleolar functions in A. thaliana. For this I followed two approaches: 1- I performed nucleolus proteome and characterized one of its non-ribosomal activity / 2- I studied nucleolar iron impact on ribosomes biogenesis.Firstly, the A. thaliana nucleolar proteome allowed me to identify nucleolar proteins with non-ribosomal functions. Among these, I showed that 26S proteasome activity can be regulated by nucleolus. More precisely, proteasome activity decreases with nucleolus disorganization. Moreover, I also showed that 26S proteasome, together with Nucleolin, might play a role in ribosomal RNA transcription and/or maturation.Secondly, I proved that loss of nucleolar iron (in nas1,2,4 mutant plants) induces an increase of nucleolar transcriptional structures (fibrillar centers). This observation is correlated with the transcription of normally silenced rDNA from NOR2 and, interestingly, with hypermethylation of rDNA promoters in CHH context. And so, iron might regulate factors implicated in epigenetic pathways responsible of either rDNA transcription or repression.

La recombinaison homologue est essentielle à la réparation des lésions de l’ADN ainsi qu’à la ségrégation correcte des chromosomes en méiose. Une étape importante de la recombinaison méiotique est la formation des crossovers (CO). Au cours de ma thèse, j’ai mis en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la recombinaison méiotique. J'ai montré que les cycles d'activation et de désactivation des cullin-RING ligases (CRL) sont absolument nécessaires à la recombinaison méiotique. Les CRL sont activées par neddylation et désactivées par la deneddylation. De plus, elles peuvent aussi être inhibées par la séquestration via la protéine CAND1. Mon travail a démontré que ces trois niveaux de régulation des CRL jouent des rôles cruciaux dans la recombinaison homologue méiotique chez A. thaliana. J’ai montré qu'AXR1, un composant clé de la machinerie de neddylation, est nécessaire à la localisation correcte des CO méiotiques et à la recombinaison homologue somatique. J’ai aussi prouvé que le processus de deneddylation médié par CSN5A est nécessaire à la formation des CO. J'ai obtenu des données montrant que cette régulation de la localisation des CO agit à travers la régulation d’un complexe CRL4. Enfin, j’ai pu montrer que l'inhibiteur des CRL, CAND1, est requis pour la formation de plus de 90 % des CO. En utilisant des outils génétiques et cytologiques, j'ai montré que CAND1 agit probablement sur la régulation du biais inter-homologue. L’ensemble de ces données, met l’accent sur un nouveau mécanisme de la régulation de la recombinaison homologue, connectant pour la première fois la méiose et l’ubiquitination via les cullin-RING Ligases. / Homologous recombination is essential to all living organisms in order to repair DNA damages. In addition, a large majority of organisms use homologous recombination in meiosis to ensure proper chromosome segregation. A main step of meiotic recombination is crossover (CO) formation. During my PhD, I was able to highlight a new pathway controlling meiotic recombination. I showed that cycles of activation and deactivation of cullin-RING ligases (CRLs) are absolutely required for correct meiosis. CRLs are activated by neddylation, and deactivated by deneddylation. In addition, they can also be inhibited by sequestration by the CAND1 protein. My work demonstrated that these three levels of CRL regulation play crucial roles in meiotic homologous recombination in A. thaliana. First, I showed that AXR1, a key component of the neddylation machinery, is required for the correct localisation of meiotic COs and for somatic homologous recombination. Second, I showed that the deneddylation process mediated by CSN5A is also necessary for normal CO formation. I obtained evidence that this regulation of CO position is likely to be mediated by a CRL4 complex. Last, I could show that the CRL inhibitor, CAND1, is required for the formation of up to 90% of the COs. Using genetic and cytological tools, I showed that CAND1 probably acts on the regulation of the inter-homolog bias. Considering all these data, my work draws the attention to a new mechanism regulating meiotic homologous recombination, connecting for the first time meiosis to CRL-mediated ubiquitylation.