MYB30 est un facteur de transcription d’Arabidopsis thaliana connu pour son rôle de régulateur positif des défenses via la production d’acides gras à très longue chaîne (VLCFA). La cuticule, une couche hydrophobe protectrice qui recouvre les parties aériennes de la plante, est composée majoritairement de molécules lipidiques dérivées des VLCFA. Dans cette thèse, nous avons montré que le gène MYB30 est exprimé dans les cellules épidermiques de l’embryon, à une étape du développement qui coïncide avec la mise en place de la cuticule embryonnaire. Nos travaux révèlent que lors de l’embryogenèse, MYB30 contrôle l’expression de gènes de biosynthèse de la cuticule et la production de composés cuticulaires. En accord avec cela, nous avons montré que MYB30 est requis pour la formation d’une cuticule embryonnaire fonctionnelle. De plus, l’expression de MYB30 est dépendante de GASSHO1 et GASSHO2 (GSO1/2), deux récepteurs de type Receptor Like Kinase (RLK) impliqués dans une voie de signalisation spécifique à la graine, nécessaire pour la formation de la cuticule chez l’embryon. Nos données indiquent également que MYB30 régule négativement l’expression de GSO2, et que MYB30 pourrait agir en aval des deux RLK pour la formation de la cuticule embryonnaire. D’autre part, nous avons montré que ces deux RLK jouent également un rôle positif dans l’activation des réponses immunitaires de la plante adulte. Enfin, notre étude indique que MYB30 est aussi impliqué dans l’élongation cellulaire chez les plantules étiolées probablement via la régulation de la production de composés pariétaux. En conclusion, ces travaux identifient de nouveaux rôles pour MYB30, et le placent à l’interface entre les réponses de défense et le développement de la plante. / MYB30 is an Arabidopsis thaliana transcription factor known for its role of positive regulator of defense responses through the production of very long chain fatty acids (VLCFAs). The cuticle, a hydrophobic and protective layer that covers the aerial parts of the plant, is mainly composed of VLCFA-derived lipid molecules. In this thesis, we have shown that the MYB30 gene is expressed in the epidermal cells of the embryo, at a developmental stage that corresponds to the establishment of the embryonic cuticle. Our work reveals that during embryogenesis, MYB30 controls the expression of cuticle biosynthetic genes and the production of cuticular compounds. In agreement, we have shown that MYB30 is required for the formation of a functional embryonic cuticle. In addition, MYB30 expression is dependent on GASSHO1 and GASSHO2 (GSO1/2), two Receptor Like Kinases (RLKs) involved a seed-specific signaling pathway, necessary for the cuticle formation in the embryo. Our data also indicates that MYB30 negatively regulates GSO2 expression and that MYB30 may act downstream of the two RLKs in embryonic cuticle formation. Moreover, we have shown that these two RLKs also play a positive role in the activation of immune responses in adult plants. Finally, our study indicates that MYB30 is additionally involved in cell elongation in etiolated seedlings, likely by regulating the production of cell wall components. In conclusion, this work identifies new roles of MYB30, placing it at a crossroads between defense responses and plant development.

L’auxine est une hormone essentielle au développement des plantes, tant pour la division quel’expansion cellulaire. La transcription des gènes de réponses à l’auxine est permise par un mécanisme designalisation faisant intervenir des complexes ubiquitine ligase E3 impliquant des protéines à F-boxTIR1/AFBs, qui en présence d’auxine peuvent interagir avec les répresseurs transcriptionnels AUX/IAA pourinduire leur dégradation et activer la transcription de gènes de réponses à l’auxine. Cette transcriptionimplique des facteurs de transcription ARFs (Auxin Response Factors). Dans la feuille, un maximum d’auxinerésultant de l’activité des transporteurs d’efflux d’auxine PIN1 participe à l’initiation des dents à la marge. Lefacteur de transcription CUC2 qui permet la formation des domaines frontières intervient dans le contrôle del’orientation des transporteurs PIN1. L’auxine réprime également CUC2 limitant ainsi son expression au sinus,ce qui semble nécessaire pour la formation des dents. Les acteurs de la signalisation auxinique impliquésdans la formation des dents ne sont néanmoins pas connus chez Arabidopsis.Dans cette thèse, les profils d’expression des ARFs ont été mis en évidence dans les jeunes feuillesd’Arabidopsis au moment de la formation des dents et une cartographie fine a été établie. Trois ARFspotentiellement répresseurs ARF1, ARF3, ARF18 et trois activateurs ARF5, ARF6, ARF8 ont été identifiéscomme étant exprimés dans la zone dent/sinus. La modification de leurs profils d’expression dans des formesde feuilles modifiées par des variations d’expression de CUC2 a également été étudiée. Afin de déterminer sices ARFs sont impliqués dans la morphogénèse foliaire et plus particulièrement dans l’initiation des dents, lesimple mutant arf5-2/mpS319, et les doubles mutants arf6-2 arf8-3, arf1-5 arf3-1, arf1-5 arf18-2 et arf3-1arf18-2 ont été générés et analysés. Les feuilles matures du mutant nul arf5-2/ mpS319 présentent une tailleplus importante que celles de Col-0, suggérant que ARF5 serait impliqué dans l’expansion cellulaire. / Auxin is essential for plant development, more particularly by participating in cellular division andexpansion. Transcription of auxin response genes is allowed by the auxin signaling pathway involving the F-boxTIR1/AFBs proteins associated to ubiquitin ligase E3, which can interact with the AUX/IAA repressors in thepresence of auxin to trigger their degradation and activate transcription of early auxin response genes involvingthe Auxin Response Factors (ARF). At the leaf margin, an auxin maximum resulting from the transport of auxinmediated by the auxin efflux carrier PIN1 is required for teeth formation. The transcription factor CUC2 thatdefines boundary domains, somehow redirects PIN1 to create a convergent flux to the apex of the tooth. Auxinrepresses CUC2 thus limiting its expression to the sinus. In Arabidopsis, the actors of the auxin signalingpathway involved in leaf serration are unknown.In this thesis, the expression profiles of ARFs genes have been investigated in young leaves of Arabidopsis, morespecifically during teeth formation and a detailed map was built. Three ARFs acting as putative repressors ARF1,ARF3 and ARF18 and three activators ARF5, ARF6 and ARF8 were identified as been expressed in thesinus/teeth area. Their expression profiles were also studied in leaves exhibiting modified shapes as a result ofvariations in CUC2 expression. To determine if these ARFs are involved in leaf morphogenesis and moreparticularly in tooth initiation, the arf5-2 null mutant and the double null mutants arf6-2 arf8-3, arf1-5 arf3-1,arf1-5 arf18-2 and arf3-1 arf18-2 were generated and serration was analyzed. Length of arf5-2 mature leaves islonger than the wild type, suggesting that ARF5 could be involved in cell expansion.

La chromatine est le support de l’information génétique et sa structure, ainsi que son activitétranscriptionnelle, peuvent être modulées par des modifications épigénétiques. Le maintien des marquesrépressives telles que la méthylation de l’ADN et des histones, hors du corps des gènes, est nécessairepour le bon développement de la plante. Chez Arabidopsis thaliana, le mutant sg1 présente des défautsdéveloppementaux sévères caractéristiques de mutants affectés dans des mécanismes épigénétiques. Nousavons montré que le phénotype de sg1 est causé par une hyperméthylation CHG et H3K9me2 dans denombreux gènes. En effet, SG1 contrôle la transcription de l’histone déméthylase IBM1 et lesmodifications de l’épigénome observées chez sg1 sont dues à une dérégulation de IBM1. Nous avonsidentifié sept protéines partenaires de SG1, dont certaines se lient aux marques chromatiniennes. Nousavons réalisé un crible suppresseur qui a permis d’identifier FPA, une protéine régulant lapolyadénylation de certains transcrits, comme acteur impliqué dans le contrôle des cibles de SG1, dontIBM1. Nos résultats montrent que le complexe SG1 régule la transcription de ses cibles en influençant,par un mécanisme encore inconnu, le choix du site de polyadénylation, en lien avec les marqueschromatiniennes présentes aux locus cibles. D’autre part, certaines épimutations induites par la mutationsg1 peuvent être maintenues pendant plusieurs générations. Pour rechercher un lien entre méthylation desgènes et conséquences phénotypiques, nous avons caractérisé des épimutations liées à un défaut dedéveloppement de la fleur et identifié un certain nombre de gènes candidats potentiellement responsablesdu phénotype. Les résultats obtenus au cours de ma thèse ont contribué à préciser le rôle joué par lecomplexe SG1 et à comprendre le lien entre celui-ci et les marques épigénétiques. / Chromatin is known to contain the genetic information and its structure and transcriptionalstate can be regulated by epigenetic modifications. Repressive marks such as DNA and histonesmethylation needs to be kept away from gene bodies to enable the proper development of the plant. InArabidopsis thaliana, sg1 mutants show a range of severe developmental defects similar to thoseobserved in mutants affected in epigenetic pathways. We have shown that sg1 mutant phenotype iscaused by an increase of CHG and H3K9me2 methylation in many gene bodies. Indeed, SG1 regulatesthe histone demethylase IBM1 transcription and the impairment observed in sg1 mutant epigenomes iscaused by IBM1 misregulation. We found seven proteins interacting with SG1, among which somepartners are able to bind chromatin marks. Through a suppressor screen we identified FPA, alreadyknown to regulate the polyadenylation of some transcripts, as a player involved in SG1 targetsregulation, including IBM1. Our results show that the SG1 complex regulates target genes transcriptionby affecting polyadenylation site choice, in a way that remains to be determined, in a chromatin marksdependent manner. We also found that some of the sg1-induced epimutations can be maintained throughseveral generations. To investigate the link between gene body methylation and phenotypicconsequences, we have characterized epimutations related to a defect in floral development andidentified some candidate genes potentially responsible for the floral phenotype. Thus, our resultscontributed to clarify the role of SG1 and to understand its connection with epigenetic marks.

Les mitochondries sont le siège de la respiration cellulaire et possèdent un petit nombre de gènes essentiels dont l’expression est dirigée presque exclusivement par des protéines d’origine nucléaire. Les protéines de la famille PPR (PentatricoPeptide Repeat) font partie de ces acteurs et interviennent à toutes les étapes de l’expression des ARNs des organites, allant de la transcription à la traduction. De manière intéressante, les végétaux codent de nombreuses protéines PPR (environ 500 chez l’espèce modèle Arabidopsis thaliana), et sont de fait des modèles idéaux pour comprendre le rôle et le fonctionnement de ces protéines. Elles correspondent à des protéines de liaison aux ARNs très spécifiques, caractérisées par la présence de répétitions en tandem d’environ 35 acides aminés. Au sein de la famille PPR, le sous-groupe de gènes appelé « Restorer of Ferility Like » (ou RFL) s’oppose aux autres PPR car ils subissent une sélection diversifiante, et non purifiante, comme c’est le cas pour les PPR classiques. Certaines protéines RFL décrites chez d’autres espèces modèles telles que le riz ou encore le radis, appelées restauratrices de fertilité, inhibent l’expression de gènes mitochondriaux inducteurs de stérilité mâle. La famille RFL comporte 26 membres chez Arabidopsis thaliana.Afin de mieux comprendre la diversité fonctionnelle des gènes RFL, notre équipe a procédé à la caractérisation de l’ensemble des mutants rfl chez Arabidopsis, et seules les lignées affectées dans les gènes RFL22 et RFL23 affichent des altérations phénotypiques remarquables. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé les protéines RFL22 et RFL23 pour comprendre leur rôle et leur mécanisme d’action moléculaire. L’étude des mutants rfl22 et rfl23 a montré que ces gènes sont essentiels pour la mise en place de la chaine respiratoire. Le mutant rfl22 ne produit plus de cytochromes de type c matures (ce qui affecte l’activité des complexes respiratoires III et IV), tandis que le mutant rfl23 n’accumule plus de complexe I de la chaine respiratoire.Après avoir adapté le protocole de profilage de ribosomes aux mitochondries de plantes, j’ai pu découvrir que les protéines RFL22 et RL23 étaient indispensables à la traduction d’ARNm mitochondriaux spécifiques : ccmFn₂ codant une sous-unité du complexe hème lyase et nad4L codant une sous-unité du complexe I, respectivement. D’autre part, j’ai pu cartographier in vivo et in vitro une région pouvant correspondre au site de liaison de la protéine RFL22 sur l’ARNm ccmFN2.Mes résultats révèlent que quelques rares gènes RFL remplissent des fonctions essentielles chez les Arabidopsis. Contrairement aux autres gènes PPR, la conservation fonctionnelle des gènes RFL22 et RFL23 apparait toutefois limitée aux Brassicaceae. Des modifications particulières dans l’organisation ou l’expression des génomes mitochondriaux de cette famille de plantes pourraient être à l’origine du recrutement de gènes RFL à évolution rapide pour maintenir une expression appropriée de certains gènes mitochondriaux. / Mitochondria are the siege of cellular respiration and code a small number of essential genes whose expression is governed almost exclusively by nuclear-encoded proteins. The proteins PPR family (PentatricoPeptide Repeat) belong to these actors and intervene at all stages of RNAs expression in organelles, from transcription to translation. Interestingly, plants encode numerous PPR proteins (about 500 in the model specie Arabidopsis thaliana), and are therefore ideal models for understanding the role and function of these proteins. They correspond to very specific RNA binding proteins, characterized by the presence of tandem repeats of about 35 amino acids. Within the PPR family, a subgroup of genes called Restorer of Ferility Like (RFL) is opposed to other PPR because they undergo a diversifying, non-purifying selection, as is the case for classical PPR. Some RFL proteins described in other model species such as rice or radish, are known as fertility restorers, and inhibit the expression of mitochondrial genes inducing male sterility. The RFL family consists in 26 members in Arabidopsis thaliana.In order to better understand the functional diversity of RFL genes, our team has characterized all rfl mutants in Arabidopsis, and only two of them, affected in RFL22 and RFL23 genes display remarkable phenotypic alterations. During my thesis, I characterized RFL22 and RFL23 proteins to understand their role and molecular mode of action. The study of the mutants rfl22 and rfl23 showed that these genes are essential for the establishment of the respiratory chain. The mutant rfl22 no longer produces mature c-type cytochromes (which affects the activity of respiratory complexes III and IV), whereas the mutant rfl23 no longer accumulates complex I of the respiratory chain.After adjusting the ribosome profiling protocol to plant mitochondria, I discovered that RFL22 and RL23 proteins were essential for specific mitochondrial mRNAs translation : ccmFN2 mRNA encoding a subunit of heme lyase complex and nad4L transcript encoding a subunit of complex I. Furthermore, I was able to map a region in vivo and in vitro that could correspond to the binding site of the RFL22 protein on the ccmFN2 mRNA.My results show that a few rare RFL genes perform essential functions in Arabidopsis. By opposition to other PPR genes, the functional conservation of RFL22 and RFL23 genes appears limited to Brassicaceae. Specific modifications in organization or expression of the mitochondrial genomes of this family of plants could be at the origin of the recruitment of rapidly changing RFL genes to maintain proper expression of certain mitochondrial genes.

L'expression des ARN mitochondriaux et chloroplastiques des plantes implique un grand nombre de modifications post-transcriptionnelles, parmi lesquelles l'épissage des introns est un processus essentiel. Sur la base de leur structure et des mécanismes d'épissage associés, les introns peuvent être classés en deux familles et ceux présents dans les organites des plantes appartiennent au groupe II. Les introns mitochondriaux et chloroplastiques de groupe II sont fortement dégénérés et ont perdu la capacité de s'auto-épisser in vivo. Leur élimination nécessite l’action de nombreux facteurs protéiques codés dans le noyau et importés dans les organites. Les protéines de liaison à l'ARN jouent un rôle prédominant dans ce processus complexe. Les protéines ribosomales sont des protéines abondantes se liant à l'ARN et peuvent être recrutées pour remplir diverses fonctions annexes. Au cours de ma thèse, j’ai étudié la fonction des protéines de type uL18 chez Arabidopsis, qui comprend 8 membres. Ces protéines partagent un domaine uL18 plutôt dégénéré, mais dont la structure est conservée, et dont la fonction initiale est de permettre l’association avec l’ARNr 5S. Nos résultats ont montré que cinq protéines de type uL18 sont adressées aux mitochondries et trois aux chloroplastes. Deux d’entre elles correspondent à de véritables protéines ribosomales uL18 associées aux ribosomes des organites, tandis que deux autres (uL18-L1 et uL18-L8) se sont transformées en facteurs d'épissage et sont nécessaires à l'élimination d’introns mitochondriaux ou chloroplastiques spécifiques. L'analyse d'un troisième membre de la famille, uL18-L5, a révélé qu'il participait à l'épissage de nombreux introns mitochondriaux. Mes résultats ont permis de révéler que les facteurs dérivés des protéines ribosomales uL18 jouent un rôle essentiel dans l’épissage des introns du groupe II mitochondriaux ou chloroplastiques chez les végétaux et que ces fonctions ciblent sot un seul intron ou bien plusieurs d’entre eux. / RNA expression in plant organelles implies a large number of post-transcriptional modifications in which intron splicing is an essential process. Based on RNA structures and splicing mechanisms, introns can be classified into two families and organellar introns of seed plants are categorized as group II. Organellar group II introns are highly degenerate and have lost the ability to self-splice in vivo. Their removal from transcripts is thus facilitated by numerous nuclear-encoded proteins that are post-translationaly imported into organelles. Among them, RNA binding proteins play predominant roles in this complex process. Ribosomal proteins are abundant RNA-binding proteins and could be recruited to carry out multifarious auxiliary functions. During my thesis, I investigated the function of the uL18 ribosomal-like protein family in Arabidopsis that comprises 8 members. The members of this protein family share a rather degenerate but structurally conserved uL18 domain whose original function is to permit association with the 5S rRNA. Our results showed that five uL18-Like proteins are targeted to mitochondria and three to chloroplasts. Two of these proteins correspond to real ribosomal uL18 proteins that incorporate into organellar ribosomes, while two other members (uL18-L1 and uL18-L8) have turned into splicing factors and are required for the removal of specific mitochondrial or plastid group II introns. The analysis of a third member, uL18-L5, revealed that it participated in the splicing of numerous mitochondrial introns. Our results revealed that uL18-like factors play essential roles in group II intron splicing in both mitochondria and plastids of plants and that these functions could target a single or multiple introns.

Les protéines du groupe Polycomb (PcG) ont initialement été identifiées chez la Drosophile, en tant que facteurs nécessaires au maintien de l’expression spatio-temporelle de gènes homéotiques le long de l’axe antéro-postérieur. Depuis, leur rôle en tant que régulateurs du développement a été mis en évidence chez la plupart des métazoaires ainsi que chez les plantes, chez lesquelles elles orchestrent les transitions développementales, l’organogenèse et la différenciation cellulaire. Les protéines PcG sont nécessaires au maintien de la répression transcriptionnelle de gènes cibles, par la régulation de leur structure chromatinienne via des modifications post-traductionnelles des histones. Elles forment des complexes multiprotéiques, notamment les Complexes Répressifs Polycomb PRC1 et PRC2. PRC2 est responsable de la tri-méthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3) et est constitué de 4 sous-unités principales qui, pour la plupart, sont présentes sous forme de familles multigéniques dans le génome d’Arabidopsis thaliana. Ainsi, il existe plusieurs complexes PRC2 constitués de combinaisons alternatives de ces sous-unités, qui sont potentiellement présents au sein d’une même cellule et dont les rôles sont considérés comme partiellement redondants. En utilisant des approches moléculaires, génétiques et génomiques, nous avons analysé le rôle des sous-unités PRC2 exprimées dans la pointe racinaire d’Arabidopsis. Nous avons montré que l’interaction entre différents PRC2 est nécessaire pour réguler l’activité du méristème, le déroulement temporel de la différenciation cellulaire, ainsi que pour le maintien de l’identité des cellules matures. De plus, notre travail montre que les complexes PRC2 contenant l’une ou l’autre des deux méthyltransférases, CLF et SWN, régulent des groupes de gènes communs ainsi que distincts, à travers des mécanismes différents incluant une fonction non-canonique. Par ailleurs, nos résultats indiquent que les différences fonctionnelles entre CLF-PRC2 et SWN-PRC2 reposent, au moins en partie, sur les sous-unités non-catalytiques avec lesquelles la méthyltransférase interagit. Pour identifier les gènes régulés dynamiquement par PRC2 durant la différenciation cellulaire, nous avons développé des approches permettant d’accéder à la résolution des types cellulaires afin d’analyser les états chromatiniens à l’intérieur de la niche de cellules souches et de la zone de maturation de la racine. Nos données suggèrent que PRC2 participe au maintien de l’identité du Centre Quiescent (QC) en réprimant des voies de signalisations spécifiques. De plus, la différenciation cellulaire en direction de la zone de maturation est accompagnée par un accroissement du répertoire des cibles PRC2, incluant des régulateurs méristématiques ainsi que des gènes spécifiquement exprimés dans différents types cellulaires. Enfin, nos résultats suggèrent qu’une proportion significative des cibles PRC2 sont présentes sous la forme de domaines bivalents H3K27me3-H3K4me3 dans les cellules souches végétales, cette proportion étant moins importante que celle décrite chez les cellules souches embryonnaires de mammifères. Dans l’ensemble, ce travail apporte une vue intégrée de la fonction, la dynamique et la multiplicité de l’activité PRC2 au cours du processus de différenciation cellulaire, dans le contexte d’un organe en développement. Nos résultats mettent en évidence le rôle de PRC2 en tant que régulateur majeur de la différenciation cellulaire, qui apporte à la fois robustesse et plasticité aux programmes transcriptionnels qui sous-tendent l’acquisition spatio-temporelle et le maintien de l’identité cellulaire. / The Polycomb group (PcG) proteins were originally identified in Drosophila as factors required for maintaining the spatio-temporal expression of homeotic genes along the head-to-tail axis. Since then, their role as developmental regulators has been highlighted in most metazoans as well as plants, in which they orchestrate developmental transitions, organogenesis and cell differentiation. PcG proteins are required to maintain the transcriptional repression of target genes by regulating their chromatin structure via post-translational histone modifications. They are found in multiprotein complexes, including Polycomb Repressive Complexes PRC1 and PRC2. PRC2 is responsible for the trimethylation of histone H3 at lysine 27 (H3K27me3) and consists of four core subunits, most of which are represented by multigene families in Arabidopsis thaliana. Thus, distinct PRC2 complexes formed by alternative subunit combinations exist, possibly in the same cell, and are thought to play partly overlapping roles. By combining molecular, genetic and genomic approaches, we have analyzed the role of the PRC2 subunits expressed in the Arabidopsis root tip used as a model. We show that the interplay between distinct PRC2s is necessary to regulate the activity of the meristem and the timing of cell differentiation, as well as the maintenance of cell identity. In addition, our work reveals that PRC2 complexes containing either of the two related methyltransferases CLF or SWN regulate common as well as specific sets of genes through distinct mechanisms, including a non-canonical function. Furthermore, our results indicate that the functional differences between CLF-PRC2 and SWN-PRC2 rely, at least in part, on the non-catalytic subunit they are interacting with. To identify the genes dynamically regulated by PRC2 during cell differentiation, we have developed cell type-specific approaches to analyze chromatin marks in cell populations within the stem cell niche and the maturation zone of the root. Our data suggest that PRC2 participates in the maintenance of the quiescent center (QC) identity by repressing specific signaling pathways. In addition, cell differentiation towards the maturation zone is accompanied by an increase of the repertoire of PRC2 targets including stem cell and meristem regulators, as well as cell type-specific genes. Finally, our findings suggest that bivalent H3K27me3-H3K4me3 domains in the QC represent a significant, though smaller proportion of PRC2 targets in plant stem cells compared to what has been described in mammalian embryonic stem cells. Overall, this work provides an integrated view of the function, dynamics and multiplicity of PRC2 activity during the cell differentiation process, in the context of a developing organ. Our results highlight the role of PRC2s as major regulators of cell differentiation that provide both robustness and plasticity to the transcriptional programs underlying cell fate acquisition and identity maintenance.

La paroi végétale assure des fonctions biologiques majeures définissant la singularité des plantes ; elle est également à l'origine de multiples applications en tant que ressource agro-alimentaire, source de biomatériaux ou encore pour la production de biocarburants. Malgré cette importance fondamentale et pratique de la paroi végétale, la connaissance de sa biosynthèse apparaît à ce jour toujours très limitée. En effet, la faible abondance des glycosyltransférases (GTs) responsables de sa biosynthèse, l'absence de substrat spécifique et les difficultés à obtenir certains nucléotides-sucres nécessaires aux tests enzymatiques, a souvent rendu difficile les approches de biochimie classiques. Cependant, le séquençage de génomes (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Poplar populus), la création de banques de mutants d'insertion et la classification des activités glycosyltransférases dans la base de données CAZy (www.cazy.org) sont autant d'outils récents ayant permis des avancées significatives vers la compréhension de la biosynthèse de la paroi des végétaux. Le CERMAV a participé à ce type d'avancée en 2009, en publiant une liste de 24 gènes candidats, nommés « NGT » pour « Nouvelles GlycosylTransférases », présentant des signatures caractéristiques des glycosyltransférases. Afin de démontrer l'implication des gènes NGT dans les processus d'édification de la paroi végétale, nous avons développé une approche de génomique fonctionnelle, analysant en parallèle des lignées mutantes d'Arabidopsis altérées pour les gènes NGT et testant l'activité GT de ces protéines exprimées en systèmes hétérologues. Durant mes travaux de thèse j'ai pu caractériser 15 lignées mutantes à l'état homozygote pour 7 des 24 gènes NGT. Ces lignées homozygotes ont été criblées afin de rechercher un phénotype d'altération du développement ou de la composition en sucres de leur paroi qui soit corrélé à l'altération des gènes NGT. Ce travail de criblage a conduit à s'intéresser plus particulièrement aux mutants ngt1-1 et ngt1-2 altérés pour le gène NGT1 (At5g28910). La caractérisation des lignées mutantes ngt1-1 et ngt1-2 a permis de quantifier un phénotype de croissance foliaire réduit de 38%, par comparaison au développement des feuilles de la plante sauvage. Par ailleurs, la caractérisation biochimique de la paroi des mutants a révélé des réductions significatives et quantitatives de l'arabinose, du galactose et du rhamnose dans la paroi des mutants, ainsi que des modifications qualitatives marquées principalement des arabinanes. L'altération des arabinanes a d'ailleurs pu être confirmée par microscopie après immuno-marquage de sections d'hypocotyle de mutants à l'aide des anticorps monoclonaux LM6 et LM13 dirigés contre des épitopes α-1,5-arabinanes. Il a pu être montré également que la complémentation des mutants par une construction 35S::NGT1 permet de restaurer un phénotype sauvage à ces mutants. Par ailleurs, de façon à tester l'activité glycosyltransférase de la protéine NGT1, nous avons réalisé son expression en système hétérologue. A ce jour, malgré des résultats préliminaires encourageants, il n'a pas été possible de déterminer des conditions de tests permettant d'observer une activité glycosyltransférase suffisante et reproductible pour la protéine NGT1, que ce soit une activité fucosyltransférase (correspondant à la signature de la séquence du gène) ou bien une activité arabinosyltransférase (correspondant au phénotype biochimique des mutants ngt1). / The plant cell wall not only defines the unique biology of the plants but also have practical applications as feedstock for biomaterials and for the production of biofuels. Plant primary cell wall is mainly composed of cellulose, hemicelluloses and pectins. Significant progress has been made recently in identifying the enzymes involved in plant cell wall biosynthesis, but only a handful of those have been involved in pectin biosynthesis. With the aim of identifying new putative glycosyltransferases (GTs), in lab Hansen et al 2009 designed a bioinformatic strategy and identified a new group of 24 genes called “NGT” for (Novel Glycosyltransferase) which were considered “strong” candidates for putative glycosyltransferase activities. In order to determine the putative role of these NGT genes in plant cell wall biosynthesis, we designed a functional genomics strategy, analysing in parallel Arabidopsis T-DNA mutant lines and performing heterologous expression of candidate genes. I have characterized 15 homozygous mutant lines among the group of 24 putative NGT genes through PCR. We analysed the homozygous mutants for phenotypic alteration such as dwarfing or organ malformation and found that some of mutant lines have narrow leaves as compared to Wild type plants. In parallel I have carried out the cell wall chemical analysis of 12 homozygous mutant lines and did not get any strong difference in neutral monosaccharide composition. The detailed and complete analysis (chemical, expression and microscopic analysis) of all the above mentioned genes could have been time consuming and an overwhelming work, so I focused on At5g28910 (named NGT1) which harbours a fucosyltransferase peptide signature and on At5g14550 (named P), a gene belonging to the DUF266 gene family. Homozygous T-DNA mutant lines ngt1-1 and ngt1-2 lines were analyzed and showed a reduced growth phenotype (leaf area). Leaf area was quantified at various development stages using ImageJ, and showed a 38% reduction in mutants. Additionally, biochemical characterization of the cell wall was performed showing a reduction in neutral monosaccharide contents, like arabinose, rhamnose and galactose in mutant cell wall. Furthermore glycosyl linkage analysis of mutant lines ngt1-1 and ngt1-2 has shown that 5-Arabinofuranose (5-Araf) and 3,5-Arabinofuranose (3,5-Araf ) contents were decreased as compared to Wild type Col0 cell wall. These results were also confirmed by immunolabeling of stem cross section of mutant and wild type plants. The complementation of the mutant plants through Agrobacterium transformation resulted in the complete restoration of plant phenotype. Taken together, these data suggest that NGT1 could be an arabinosyltransferase. In order to characterize its biochemical activity, the NGT1 protein was heterologously expressed in Pichia pastoris. The recombinant protein was used to perform in vitro activity tests, but we were unable to demonstrate any neither fucosyltransferase (on the basis of peptide signature) nor arabinosyltransferase activity. In parallel to this study, I contributed to the heterologous expression and characterization of two biochemically characterized Arabidopsis GTs involved in xyloglucan synthesis: the fucosyltransferase (AtFUT1) and xylosyltransferase (AtXT1). I have successfully expressed a truncated and active form of AtFUT1, which represents an essential step for further structural studies that will be undertaken in the lab.

N-Acylethanolamines (NAEs) are fatty acid derivatives in plants that negatively influence seedling growth. N-Lauroylethanolamine (NAE 12:0), one type of NAE, inhibits root length, increases radial swelling of root tips and reduces root hair numbers in a dose dependent manner in Arabidopis thaliana L. (ecotype Columbia). A forward genetics approach was employed by screening a population of T-DNA “activation-tagged” developed by the Salk Institute lines for NAE resistance to identify potential genes involved in NAE signaling events in Arabidopsis thaliana L. (ecotype Columbia). Seeds of the activation tagged lines were grown at 0, 25, 30, 50, 75 and 100 µM N-lauroylethanolamime (NAE 12:0). Ten plants which displayed NAE tolerance (NRA) seedling phenotypes, compared with wildtype (Columbia, Col-0) seedlings were identified. I focused on one mutant line, identified as NRA 25, where the tolerance to NAE 12:0 appears to be mediated by a single dominant, nuclear gene. Thermal asymmetric interlaced (TAIL) PCR identified the location of the T-DNA insert as 3.86 kbp upstream of the locus At1g68510. Quantitative PCR indicated that the transcript level corresponding to At1g68510 is upregulated approximately 20 fold in the mutant relative to wildtype. To determine whether the NAE tolerance in NRA 25 is associated with overexpression of At1g68510 I created overexpressing lines of At1g68510 with and without GFP fusions behind the 2X35S CaMV promoter. As predicted, results with overexpressing lines of At1g68510 also exhibited enhanced resistance to NAE when compared with the wildtype. Confocal images of the fusion proteins suggest that GFP-At1g68510 is concentrated in the nucleus and this was confirmed by counterstaining with 4', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). Futhermore, At1g68510 overexpressing lines and NRA 25 line also exhibited tolerance to abscisic acid (ABA) during seedling germination. The findings suggests that At1g68510 overexpression mediates seedling tolerance to both ABA and NAE, a mechanism independent of fatty acid amide hydrolase in which its overexpression leads to NAE resistance but hypersensitivity to ABA. The next steps are to identify the association of At1g68510 with specific genomic regions or interacting proteins that may be additional components of NAE signaling in plants.

Les modifications de la chromatine jouent un rôle fondamental dans le contrôle de l’expression des gènes de stress et la mise en place d’une réponse physiologique appropriée en réponse aux signaux environnementaux. Les complexes répressifs polycomb (PRC pour Polycomb Repressive Complexes), PRC1 et PRC2 permettent la répression des gènes via le dépôt des marques H3K27me3 et H2AUb. Ce projet de thèse vise à explorer le rôle de la protéine LHP1, une sous-unité du complexe PRC1 chez Arabidopsis thaliana, dans la régulation de l’homéostasie de la marque H3K27me3 et des voies de signalisation activées par les stress. Nous avons utilisé une approche intégrative pour identifier les réponses immunitaires dé-régulées dans le mutant lhp1 ; mettant ainsi en évidence le rôle de la protéine LHP1 dans la répression de la branche dépendante de MYC2 de la signalisation par l’Acide Jasmonique et l’éthylène. La perte de la protéine LHP1 induit une baisse du niveau de la marque H3K27 me3 dans le corps des gènes ANAC019 et ANAC055, ce qui augmente leur expression et la dérégulation de leurs cible, conduisant ainsi à une résistance accrue aux pucerons, ainsi qu’à une sensibilité plus importante à l’ABA et à une meilleure tolérance à la sècheresse. D’autre part, l’activation de cette voie de signalisation dans le mutant lhp1 induit une baisse d’accumulation de l’Acide Salicylique (SA), due à la dé-régulation des gènes ICS1 et BSMT1, ainsi qu’à une sensibilité accrue au pathogène hémibiotrophe Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Afin de mieux comprendre la fonction moléculaire de LHP1, nous avons étudié son interaction génétique avec l’histone déméthylase REF6. Nous avons analysé des données de ChIP-seq menées dans les mutants lhp1 et ref6 ainsi que dans le double mutant à la lumière des phénotypes développementaux et physiologiques de ces lignées, mettant ainsi en évidence le rôle complexe de LHP1 dans l’homéostasie de la marque H3K27me3. D’après ces résultats, nous proposons que d’une part, LHP1 est requise pour le recrutement d’histone méthyltransférases sur certains gènes afin de permettre le dépôt de la marque, et que d’autre part, LHP1 protège d’autre loci de l’activité de déméthylases telles que REF6. Nous avons aussi étudié les mécanismes conduisant à une augmentation des niveaux de H3K27me3 sur certains gènes dans le mutant lhp1, et montrons que LHP1 réprime le gène MEA. L’expression ectopique de ce gène dans les tissus somatiques du mutant lhp1 est probablement responsable de l’hyper-méthylation de nombreux loci. Ce groupe de gènes hyper-méthylés dans le mutant lhp1 est enrichi en gènes annotés comme étant impliqués dans les réponses immunitaires, affectant ainsi la régulation transcriptionnelle des gènes de défense, ce qui contribue à la sensibilité accrue du mutant lhp1 aux pathogènes nécrotrophes. Ainsi, nous proposons que l’homéostasie de la marque H3K27me3 est essentielle au développement harmonieux ainsi qu’aux réponses immunitaires de la plante, et que LHP1 contribue au maintien de l’équilibre entre diverses voies de réponse au stress et les processus de croissance. / Chromatin modifications and regulation play a major role in the expression of stress-responsive genes and the instauration of appropriate physiological responses to environmental cues in plants. Polycomb Repressive Complexes (PRCs), PRC1 and PRC2,are involved in the repression of protein-coding genes through the deposition of H3K27me3 and H2Aub. This thesis project explores the role of LHP1, an Arabidopsis thaliana PRC1 protein, in the regulation of H3K27me3 homeostasis and stress-responsive signaling pathways. We used an integrative approach for the identification of immune related pathways de-regulated in the lhp1 mutant, finding that LHP1 is required for the repression of the MYC2 branch of jasmonic acid (JA)/ethylene (ET) pathway of immunity. Loss of LHP1 induces the reduction in H3K27me3 levels in the gene bodies of ANAC019 and ANAC055, leading to their up-regulation and the mis-regulation of their downstream targets, increasing aphid resistance, ABA sensitivity and drought tolerance in Arabidopsis.On the other hand, the up-regulation of this pathway in lhp1 reduces Salicylic Acid (SA) content caused by a de-regulation of ICS1 and BSMT1, as well as increased susceptibility to the hemibiotrophic pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.In order to deepen our comprehension of the molecular role of LHP1, we studied the genetic interaction between this histone reader and the REF6 demethylase. We integrated ChIP-seq, developmental and physiological data of the single lhp1 and ref6 mutants, as well as their respective double mutant, finding that LHP1 plays different roles in the regulation of H3K27me3 homeostasis. Based in on our results we propose that on the one hand, LHP1 is necessary for the recruitment of histone methyltransferases to certain genes to promote the deposition of H3K27me3, while in some other targets it protects this histone mark from the demethylase activity of REF6. We also addressed the phenomenon of H3K27me3 gain in lhp1, and we provide evidence for the role of LHP1 in the repression of MEA, a gene that is de-repressed in the lhp1 mutant and may contribute to the ectopic hyper-methylation of several loci. This set of hyper-methylatedloci in lhp1 is enriched in immune-related genes, impacting the transcriptional regulation of immune responses, a process that contributes to the increased lhp1 susceptibility to necrotrophic pathogens. Therefore, we propose that H3K27me3 homeostasis is a key phenomenon behind developmental and innate immune processes in Arabidopsis, and that LHP1 plays a role as a keeper of the trade-off between diverse stress signaling pathways but also between these and developmental programs.

A la lumière, l’activité carboxylase de la RuBisCO permet de fixer le CO2 inorganique en matière organique, sous forme de 3-phosphoglycérate (3-PGA), qui sera utilisé pour la biosynthèse de sucres, d’acides organiques et aminés, de la paroi végétale etc. Cependant, elle possède aussi une activité oxygénase qui produit du 3-PGA et du 2-phosphoglycolate. Ce dernier composé étant toxique, il est métabolisé en 3-PGA par le cycle photorespiratoire qui se déroule dans le chloroplaste, le peroxysome et la mitochondrie. Malgré une perte partielle en carbone et en azote, l’importance de la photorespiration pour les plantes est illustré par les phénotypes néfastes que les mutants d’enzymes photorespiratoires présentent dans l’air (comme un retard de croissance, la chlorose, et de la létalité) et qui sont absents en fort CO2. Ceci pourrait refléter des interactions étroites entre la photorespiration et le métabolisme primaire des plantes. Afin de mieux comprendre ces interactions et la mise en place des phénotypes photorespiratoires, des mutants pour la glycolate oxydase (GOX) et la glutamate:glyoxylate aminotransférase ont été caractérisés à travers plusieurs analyses complémentaires: des échanges gazeux, de la fluorescence chlorophyllienne, du marquage des métabolites avec du 13C, des dosages de métabolites, de cofacteurs, et de la RuBisCO. Les résultats montrent que, suite à un transfert de fort CO2 dans l’air, l’inhibition de la photosynthèse observée chez nos mutants est principalement due à un défaut du recyclage du carbone photorespiratoire qui diminue l’activité de la RuBisCO. Cette inhibition photosynthétique a un impact négatif sur la quantité de RuBisCO dans les feuilles de ces mutants par rapport aux plantes contrôles. De plus, lorsque l’inhibition de la photosynthèse est trop importante chez nos mutants photorespiratoires, la carence en carbone déclenche de la sénescence dans leurs feuilles âgées. En parallèle, une comparaison des paramètres cinétiques de la GOX d’A. thaliana (plante en C3) et de Z. mays (plante en C4) associée à la mesure d’effets isotopiques 13C et 2H a révélé que ces enzymes partageaient des paramètres Michaéliens équivalents pour le glycolate, ainsi qu’un mécanisme réactionnel identique mettant en jeu un transfert d’hydrure. / In the light, the RuBisCO carboxylase activity assimilates inorganic CO2 into organic compounds, via the production of 3-phosphoglycerate (3-PGA) that is used for the biosynthesis of sugars, organic and amino acids, plant cell walls etc. However, it also has an oxygenase activity that makes 3-PGA and 2-phosphoglycolate (2-PG). The toxic 2-PG is metabolized to 3-PGA by the photorespiratory cycle, which takes place in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. Despite a partial loss of carbon and nitrogen, the importance of photorespiration for growth can be seen by the negative phenotypes exhibited by photorespiratory enzyme mutants in air (i.e. slow growth, leaf chlorosis, and sometimes lethality), which are not observed under high CO2 conditions. This may reflect the metabolic interactions between photorespiration and plant primary metabolism. To better understand such interactions and the development of photorespiratory phenotypes, mutants for glycolate oxidase (GOX) and glutamate:glyoxylate aminotransferase have been characterized by several complementary methods: analysis of gas exchanges, chlorophyll fluorescence,13C-labeling of metabolites, measurements of metabolites, cofactors and RuBisCO levels. The results show that, after a high CO2-to-air transfer, the inhibition of photosynthesis in the mutants is mainly due to a defect in photorespiratory carbon recycling leading to a decreased RuBisCO activity. The inhibition of carbon assimilation negatively impacts mutant leaf RuBisCO content when compared to wild-type plants. In the mutants, when photosynthetic inhibition is too high, the resulting carbon starvation triggers the onset of senescence in their old leaves. In parallel to this work, a comparison of the kinetic parameters of GOX from A. thaliana (C3 plant) and Z. mays (C4 plant) coupled to measurements of 13C and 2H kinetic isotopic effects showed that these enzymes share similar Michaelian parameters for glycolate, and a similar hydride transfer reaction mechanism.