L'ARNr 5S est une partie intégrante du ribosome indispensable pour la synthèse des protéines. Cette fonction essentielle nécessite une régulation fine de l'expression des ARNr 5S en fonction des exigences cellulaires. L'ARNr 5S est codé par des gènes organisés en répétitions en tandem principalement situés dans les régions péricentromériques des chromosomes 3, 4 et 5 dans le génome Col-0 d'Arabidopsis thaliana. L’étude approfondie de l’organisation, la dynamique et la régulation épigénétique des gènes d’ARNr 5S reste cependant difficile du fait de l’absence d’assemblage de ces régions hautement répétées dans la séquence du génome d’Arabidopsis disponible dans TAIR10.Dans cette thèse, nous apportons de nouvelles informations sur les gènes d'ARNr 5S chez Arabidopsis. Nous avons confirmé les signatures d'ADN spécifiques par séquençage haut débit, identifié des polymorphismes spécifiques des régions chromosomiques portant des ADNr 5S et ainsi défini de nouvelles séquences de référence. Nous avons également étudié le statut épigénétique des gènes ARNr 5S, montrant que ces gènes sont globalement enrichis en marques répressives. Les loci situés sur les chromosomes 4 et 5 présentent également des modifications post-traductionnelles d’histones et des variants d’histone particuliers et caractéristiques d’une activité de transcription. Nous avons aussi montré que les loci d'ADNr 5S sont très dynamiques au sein de l'espèce Arabidopsis avec des variations entre différent écotypes du nombre de copies de gènes d’ARNr 5S et de l’importance relative de chaque cluster. En utilisant l'écotype Ler et des mutants spécifiques, nous montrons que le locus du chromosome 5 est une source majeure de réarrangements chromosomiques qui affectent l'organisation de la chromatine dans le noyau. Enfin, nous suggérons que des variations de l’état chromatinien des gènes d'ARNr 5S peuvent conduire à une différence de transcription dans les différents écotypes.Cette étude permet d’établir un rôle de l'organisation de la chromatine dans la régulation transcriptionnelle et l'organisation des gènes d'ARNr 5S. / 5S rRNA is an integral component of the ribosome and is essential for protein synthesis. 5S rRNA expression is therefore tightly regulated to suit the cellular requirements. 5S rRNA is encoded by gene arrays organized in tandem repeats mainly situated in the pericentromeric regions of chromosomes 3, 4 and 5 in the Arabidopsis thaliana Col-0 genome. Full genome assembly remains challenging in these highly repeated regions and impedes further investigation of their organization, dynamics and epigenetic regulation.In this thesis, we provide information on 5S rRNA genes in Arabidopsis thaliana. We confirmed specific DNA signatures by deep sequencing and define chromosome-specific polymorphisms and new reference sequences. We also studied the epigenetic status of the 5S rRNA genes showing that these genes are enriched in repressive marks whereas the loci on chromosome 4 and 5 also display peculiar histone modifications and variants characteristic of transcriptional activity. We report that 5S rDNA loci are highly dynamic within the Arabidopsis species with high level of variation in global copy number and cluster proportion between ecotypes. Using the Ler ecotype, in which reorganization events were recorded, and specific mutant backgrounds, we identified chromosome 5 rDNA locus as a major source of variation and observed altered chromatin organization in nuclear space as a consequence of 5S rDNA locus variation. Finally, we suggest that differences in chromatin states at the two main 5S rDNA loci can lead to differential usage of 5S rRNA genes indifferent ecotypes.The analysis provides evidence for a role of chromatin organization in transcriptional regulation and 5S rDNA organization.

No description available.

La cutine est un polymère d'acides gras oxydés et de glycérol propre aux plantes. Elle forme la matrice structurale de la cuticule qui recouvre l'épiderme des parties aériennes et joue un rôle vital pour les plantes en empêchant la dessiccation. La biosynthèse du polymère de cutine a été étudiée chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Des mutants perte-de-fonction pour la monooxygénase de type cytochrome P450 CYP77A4 ont été isolés. L'analyse de lignées transgéniques exprimant le gène rapporteur GUS sous le contrôle du promoteur de CYP77A4 a montré que le gène était exprimé essentiellement dans les organes floraux et les graines. L'analyse de la cutine dans divers organes a permis de démontrer que le gène était essentiel pour la synthèse d'un acide gras trihydroxylé en C18 présent dans les polyesters des embryons. Une méthode permettant la séparation de l'embryon et des téguments des graines en quantité suffisante pour analyser la cutine a été mise au point. Le profil de monomères des embryons mutants a montré que CYP77A4 est une époxygénase de la voie de biosynthèse des monomères de cutine en C18. L'étude de la physiologie des mutants a par ailleurs permis de démontrer que les acides gras trihydroxylés de la cuticule de l'embryon jouent un rôle important dans la germination de la graine en conditions de stress salin. Dans une deuxième étude, des mutants perte-de-fonction et des suexpresseurs pour le gène d'Arabidopsis BODYGUARD (BDG) codant une protéine de la superfamille des hydrolases à repliement α/β ont été caractérisés. L'analyse des polyesters dans ces lignées a permis de montrer que cette protéine jouait en fait un rôle dans la biosynthèse de la cutine. / Cutin is a polymer of oxidized fatty acids and glycerol specific to plants. It forms the structural matrix of the waxy cuticle covering the epidermis of the aerial parts and plays a vital role in plants by preventing desiccation. Biosynthesis of cutin polymer was studied in the model plant Arabidopsis thaliana. Mutant loss-of-function monooxygenase type cytochrome P450 CYP77A4 were isolated. The analysis of transgenic lines expressing the GUS reporter gene under the control of the promoter of CYP77A4 showed that the gene was expressed mainly in floral organs and seeds. The analysis of various organs in the cutin demonstrated that the gene was essential for the synthesis of a C18 trihydroxy polyesters present in seed polyesters (9,10,18-trihydroxyoctadecenoic acid). A method for the separation of the embryo and seed coat allowing to analyze embryo polyesters was developed. The trihydroxy C18 fatty acid was found to be the major cutin embryo monomer. Profile of cutin monomers in mutant embryos showed that CYP77A4 is an epoxygenase in the biosynthetic pathway of C18 cutin monomers. The study of the physiology of the mutants also showed that the trihydroxy- fatty acids of the embryo cuticle play an important role in the germination of the seed under conditions of salt stress. In a second study, mutant loss-of-function and overexpressors for the Arabidopsis gene BODYGUARD encoding a protein of the α / β hydrolase fold superfamily have been characterized. Analysis of polyesters in these lines showed that this protein, whose role in the formation of the cuticle was not understood, plays in fact a role in cutin biosynthesis.

Les plantes sont des organismes statiques et tributaires des ressources minérales présentes dans leur rhizosphère. La remobilisation des nutriments est un processus qui permet une économie nutritionnelle et un recyclage de macro- et micro - nutriments qui sont le plus souvent limitants. Le rôle du démantèlement des chloroplastes au cours de ce processus est très important pour le recyclage de l’azote, puisque ceux-ci contiennent la majeure partie des protéines foliaires. Bien que les protéines chloroplastiques soient une source essentielle pour le recyclage de l’azote foliaire, leur mécanisme de dégradation est mal connu. L’autophagie, a été proposée comme mécanisme participant au recyclage des nutriments, notamment en situation de carence ou de limitation en azote. L’autophagie, processus cellulaire de dégradation, représente un mécanisme de survie et d’adaptation, par le recyclage et l’élimination des protéines et organelles altérés.La détermination des flux d’azote, entre la rosette et les graines par l’utilisation du marquage à l’isotope stable 15N chez des mutants d’autophagie, nous a permis de montrer que l’autophagie est nécessaire à la remobilisation de l’azote. L’analyse fonctionnelle des mutants d’autophagie a permis de mettre en évidence de profondes perturbations métaboliques résultant dans l’élévation du rapport C/N. Les modifications métaboliques observées montre que les mutants d’autophagie ne présentent pas les signatures métaboliques habituellement retrouvées chez les plantes adaptées à la limitation en azote minéral, qu’ils accumulent au contraire les composés azotés et sont pauvres en ressources carbonées. Les investigations ont également révélé que l’autophagie est sélective envers certaines protéines. L’activité autophagique a été évaluée en fonction de différents niveaux d’expression d’AtTOR et à la suite de l’inhibition de son activité kinase. Ces résultats ont montré qu’AtTOR, senseur du statut nutritionnel, est un régulateur négatif de l’autophagie. L’autophagie est une étape clef du recyclage nutritionnel en réponse à une situation de stress telle que la limitation en azote. / Plants are static organisms dependent on minerals resources available in the rhizosphere. Nutrient recycling is a process allowing a nutritional economy and recycling of macro- and micro- nutrients, which are often limiting. The role of chloroplast dismantling during this process is very important for nitrogen recycling because chloroplasts contain the major part of foliar proteins. Albeit chloroplastic proteins are an essential source for foliar nitrogen recycling, their degradation process is not well understood. Autophagy has been proposed to participate in nutrients recycling, notably in nitrogen starvation or limitation. Autophagy, a cellular degradation process, represents a survival and an adaptation mechanism by recycling and eliminating defectives proteins and organelles.Based on nitrogen fluxes determination between the rosette and the seeds by using 15N labeling in autophagy (atg) mutants, the study has shown that autophagy is necessary for nitrogen remobilization. The functional analysis of atg mutants revealed deep metabolic perturbations resulting in elevated C/N ratio, marker of plant physiology status. The observed metabolic modifications are not the hallmarks of an adaptation to nitrogen limitation. Autophagy mutants indeed accumulate nitrogen compounds and present low carbohydrate contents. The investigations also revealed that autophagy is selective towards some proteins. Autophagic ativity has been evaluated function of different AtTOR expression levels and following AtTOR activity inhibition. Results have shown that AtTOR, a sensor of the nutritional status, is a negative regulator of autophagy. Autophagy is a key step for nitrogen recycling in response to stress situation like nitrogen limitation.

En phase somatique, plusieurs mécanismes de réparations de l’ADNinterviennent pour réparer les cassures double brin (CDB) de l’ADN. Enphase méiotique, les CDB de l’ADN engendrées de façon programmées parSpo11 sont réparées par la recombinaison homologue (RH) dont les acteursprincipaux sont Rad51 et Dmc1 aidés de Brca2. Chez Arabidopsis, en absencede Brca2, le déroulement méiotique est perturbé, les chromosomes nes’associent pas en bivalents, ils apparaissent emmêlés. Ainsi, en absencede Brca2, la recombinaison homologue pourrait ne plus être fonctionnelleet les anomalies chromosomiques observées pourraient être le résultat deréparations aberrantes des CDB de l’ADN effectuée par d’autres mécanismesde réparation de l’ADN. Nous avons montrés, chez Arabidopsis, que le Nonhomologous End Joining (NHEJ) et/ou le Single Strand Annealing (SSA),mécanismes de réparation des CDB de l’ADN en phase somatique,n’intervenaient pas en phase méiotique dans la formation des anomaliesobservées en absence de Brca2. Toujours dans l’hypothèse où ces figuresméiotiques soient le résultat de liaisons covalentes, nous avons regardési les ADN-ligases ne pourraient pas être impliquées. Ainsi, nous avons pumontrer que la Ligase 6, ADN-ligase spécifique des plantes, n’avait pas derôle dans les anomalies chromosomiques observées en méiose en absence deBrca2. D’ailleurs la Ligase 6 ne semble pas non plus intervenir dans lesfigures chromosomiques observées chez les mutants rad51 et mnd1. Le rôlede la Ligase 6 n’ayant pas été déterminé lorsque nous avons démarré cetravail, nous avons voulu identifier son le rôle en étudiant le mutantcorrespondant. Le mutant ligase 6 ne présente pas de sensibilité auxstress génotoxiques utilisés ce qui indique que la Ligase 6 ne semble pasintervenir dans la réparation de l’ADN. La mutation dans le gène LIGASE Iest létal à l’état homozygote, de plus nous avons pu observer uneségrégation anormale chez l’hétérozygote mutant pour le gène LIGASE I. Lalétalité du mutant ligase I a été contournée par l’utilisation d’unsystème ARNi pour éteindre l’expression du gène LIGASE I uniquement enméiose. Cependant, l’implication de la Ligase I, dans les anomaliesméiotiques observées en absence de Brca2 n’a pas pu être déterminée.Enfin, nous avons confirmé que, chez Arabidopsis, Xrcc4 avait un rôle dansle NHEJ via son interaction avec la Ligase IV et via la sensibilité dumutant xrcc4 à différents stress génotoxiques. En revanche, Xrcc4-like nesemble pas interagir avec les acteurs du complexe de ligation du NHEJ etle mutant ne présente pas de sensibilité aux stress génotoxique, indiquantque cette protéine n’est pas impliquée dans le NHEJ et plus généralementdans les mécanismes de réparation de l’ADN. / In somatic cells, several mechanisms are involved in the repair of DNAdouble strand breaks (DSB). In meiotic cells, programmed DSBs are causedby Spo11 and repaired by homologous recombination (HR), whose main playersare Rad51 and Dmc1 aided by Brca2. In Arabidopsis, in the absence ofBrca2, meiosis is disturbed, chromosomes do not organize into bivalents,they appear stuck and entangled together. Thus, in the absence of Brca2,HR may be no functional and the chromosomal anomalies we observecouldresult from the aberrant repair of the DNA DSBs due to other mechanisms ofDNA repair. We have shown in Arabidopsis that the homologous end joining(NHEJ) and/or Single Strand Annealing (SSA), mechanisms of DNA DSB repairthat are active in the somatic phase, were not involved in the formationof the meiotic anomalies observed in the absence of Brca2 in meioticcells. Still assuming that these figures are the result of meioticcovalent bond, we checked whether DNA ligases could be involved. Thus, wehave shown that 6 Ligase, DNA ligase specific plants, had no role in thechromosomal abnormalities observed in meiosis in the absence of Brca2.Besides the Ligase 6 does not seem to interfere with the meiotic figuresobserved in rad51 and mnd1 mutants. We wanted to identify the Ligase 6role in studying its mutant. Ligase 6 mutant did not show sensitivity togenotoxic stress. The Ligase 6 does not seem to be involved in DNA repair.The lethality of the ligase I mutant was bypassed with a RNAi constructaimed at extinguishing the gene expression of LIGASE I atmeiosis only.However, the involvement of Ligase I in the meiotic anomalies observed inthe absence of Brca2 could not be determined. Finally, we confirmed that,in Arabidopsis, Xrcc4 has a role in NHEJ through its interaction withligase IV and the sensitivity of the xrcc4 mutant to different genotoxicstress. In contrast, Xrcc4-like does not appear to interact with playersin the NHEJ ligation complex and the mutant shows no sensitivity togenotoxic stress. These result indicated that this protein is not involvedin NHEJ and, more generally in the mechanisms of DNA repair.

Fatty acid desaturase 2 (FAD2) enzymes are phosphatidylcholine desaturases occurring as integral membrane proteins in the endoplasmic reticulum membrane and convert monounsaturated oleic acid into polyunsaturated linoleic acid. The major objective of this research was to study the expression and function of two cotton FAD2 genes (the FAD2-3 and FAD2-4 genes) and their possible role in plant sensitivity to environmental stress, since plants may increase the polyunsaturated phospholipids in membranes under environmental stress events, such as low temperature and osmotic stress. Two FAD2 cDNA clones corresponding to the two FAD2 genes have been isolated from a cotton cDNA library, indicating both genes are truly expressed in cotton. Model yeast cells transformed with two cotton FAD2 genes were used to study the chilling sensitivity, ethanol tolerance, and growth rate of yeast cells. The expression patterns of the two FAD2 genes were analyzed by reverse transcription polymerase chain reactions (RT-PCR) and Western blot analyses in cotton plants under different treatment conditions. The coding regions of both FAD2 genes were inserted downstream from the CaMV 35S promoter in the pMDC gateway binary vector system. Five different FAD2/pMDC constructs were transformed into the Arabidopsis fad2 knockout mutant background, and multiple potential transgenic Arabidopsis plant lines harboring the cotton FAD2 genes were generated. The cotton FAD2 genes were amplified by the polymerase chain reaction (PCR) from the genomic DNAs isolated from the transgenic Arabidopsis T1 plant lines. Complementation of the putative transgenic Arabidopsis plants with the two cotton FAD2 genes was demonstrated by gas chromatography analyses of the fatty acid profiles of leaf tissues. The cellular localization of cotton FAD2-4 polypeptides with N-terminal green fluorescence protein (GFP) was visualized by confocal fluorescence microscopy. The phenotype of transgenic Arabidopsis plants transformed with the cotton FAD2-4 gene was compared to Arabidopsis knockout fad2 mutant plants and wild type Arabidopsis plants regarding their sensitivity to low temperature, and the size and height of the plants.

N-Acylethanolamines (NAEs) are endogenous plant lipids hydrolyzed by fatty acid amide hydrolase (FAAH). When wildtype Arabidopsis thaliana seeds were germinated and grown in exogenous NAE 12:0 (35 µM and above), growth was severely reduced in a concentration dependent manner. Wildtype A. thaliana seeds sown on exogenous abscisic acid (ABA) exhibited similar growth reduction to that seen with NAE treatment. AtFAAH knockouts grew and developed similarly to WT, but AtFAAH overexpressor lines show markedly enhanced sensitivity to ABA. When low levels of NAE and ABA, which have very little effect on growth alone, were combined, there was a dramatic reduction in seedling growth in all three genotypes, indicating a synergistic interaction between ABA and NAE. Notably, this synergistic arrest of seedling growth was partially reversed in the ABA insensitive (abi) mutant abi3-1, indicating that a functional ABA signaling pathway is required for the full synergistic effect. This synergistic growth arrest results in an increased accumulation of NAEs, but no concomitant increase in ABA levels. The combined NAE and ABA treatment induced a dose-dependent increase in ABI3 transcript levels, which was inversely related to growth. The ABA responsive genes AtHVA22B and RD29B also had increased expression in both NAE and ABA treatment. The abi3-1 mutant showed no expression of ABI3 and AtHVA22B, but RD29B expression remained similar to wildtype seedlings, suggesting an alternate mechanism for NAE and ABA interaction. Taken together, these data suggest that NAE metabolism acts through ABI3-dependent and independent pathways in the negative regulation of seedling development.

Chez Arabidopsis thaliana, les gènes d’ARNr 5S sont transcrits par l’ARN polymérase III qui fait intervenir plusieurs facteurs de transcription dont TFIIIA qui reconnaît spécifiquement le promoteur interne de ces gènes et permet ainsi le recrutement de l’ensemble du complexe de transcription. Le gène TFIIIA est composé de sept exons dont le troisième, résultant de l’exonisation d’une molécule d’ARNr 5S, est épissé de façon alternative produisant ainsi deux transcrits. Le transcrit ES, qui ne contient pas cet exon, code pour la protéine TFIIIA pleine longueur et fonctionnelle. Le transcrit EI, dans lequel l’exon « 5S-like » est maintenu, est reconnu et dégradé par la voie NMD (Non-Mediated Decay). L’exon « 5S-like » a, en effet, la particularité de contenir un codon stop prémature qui en fait une cible de la voie NMD. Lors de l’étude de l’expression des transcrits ES et EI ainsi que celle de l’accumulation de la protéine TFIIIA au cours du développement, nous avons montré que le taux de la protéine TFIIIA fonctionnelle est soumis à plusieurs niveaux de régulation. En effet, la production de la protéine TFIIIA pleine longueur est le résultat de la synthèse du transcrit ES et de sa traduction mais également de l’efficacité du clivage protéolytique de la protéine. Lors de la maturation de la graine, l’accumulation croissante de protéine TFIIIA résulte d’une augmentation des quantités de transcrits ES couplée à une diminution du clivage protéolytique. Dans les premiers jours du développement, la protéine TFIIIA n’est détectée qu’après le 4ème jour, suite à la diminution du clivage. Sa présence est corrélée au remodelage de la chromatine de l’ADNr 5S. La combinaison de ces deux mécanismes permet ainsi la production de TFIIIA et de son produit de transcription l’ARNr 5S en fonction des besoins de la plante. / In Arabidopsis thaliana, 5S rRNA genes are transcribed by RNA polymerase III. TFIIIA, specifically required for transcription of these genes, binds to the internal control region of the 5S rRNA genes and allows the assembly of the full transcription complex pol III. The TFIIIA gene consists of seven exons, the third of which results in the exonisation of one 5S rRNA molecule. This exon “5S-like” is alternatively skipped or included to produce either of two transcript isoforms. The ES transcript encodes the fully functional TFIIIA protein. The EI transcript, which contains the exon “5S-like”, is a target of the NMD pathway (Non-Mediated Decay). Indeed, the exon “5S-like” contains a premature stop codon, which is recognized by this RNA decay pathway. During the study of the ES and EI transcripts expression and the TFIIIA protein accumulation throughout the plant development, we show that TFIIIA functional protein levels are under control of many regulation steps. Actually the production of the full-length TFIIIA protein results from production and translation of the ES transcript but also from the proteolytic cleavage efficiency of TFIIIA protein. During the seed maturation, the strong accumulation of TFIIIA results from an increase in ES amounts and a proteolytic cleavage decrease. After the fourth day post-germination, TFIIIA protein is detected because the proteolytic cleavage decreases. TFIIIA presence is correlated with 5S rDNA chromatin reorganization. The combination of these two mechanisms allows TFIIIA production and its transcription product 5S rRNA according to the plants needs.

Le sujet de cette thèse est l’étude de la régulation de l’expression du facteur de transcription LEAFY COTYLEDON 2 (LEC2), qui est un, régulateur clé du développement de la graine d’Arabidospsis thaliana. La graine offre un mode de propagation et de protection des espèces végétales à graines, indispensable à leur survie. La graine est l’élément de base de l’agriculture, en tant que semence, et de l’alimentation humaine, aussi bien sous forme brute que sous forme transformée (farines, huiles…). Elle a aussi de très nombreuses applications industrielles dans l’industrie et les biocarburants. Le développement de la graine, comme beaucoup d’étapes nécessaires à la vie de la plante, est controlé par des phénomènes complexes, incluant des facteurs de transcription. LEC2, ainsi que 2 autres facteurs de transcription de type B3 (FUSCA 3 et ABI3) et un facteur à domaine de fixation CAAT (LEAFY COTYLEDON 1), sont les quatre facteurs clés du développement de la graine d’Arabidospsis thaliana, appelés AFLs (ABI3, FUS3, LEC1, 2). Les gènes AFLs s’expriment spécifiquement dans l’embryon et sont fortement réprimés dans les parties végétatives, par de multiples mécanismes impliquant, entre autre, des facteurs de transcription et des acteurs plus généraux modifiant la structure de la chromatine. Bien que la régulation de LEC2 ait déjà été largement étudiée, les mécanismes précis de répression ainsi que l’activation de ce gène, sont encore méconnus.Le travail présenté est basé sur un travail de délétion de promoteurs, qui a révélé l’existence de 3 boîtes de régulation, essentielles à une activité correcte du promoteur de LEC2. Deux boîtes, dont une correspondrait à une boîte de fixation de facteurs MADS et une à une boîte GAGA dans la séquence transcrite non traduite de LEC2, sont essentielles à l’activité du promoteur. La 3ème séquence, d’une longueur de 50pb, est nécessaire à la répression de LEC2 dans les parties végétatives par des mécanismes épigénétiques. La corrélation de la présence de cette boîte avec un enrichissement dans la marque H3K27me3 au locus nous a permis de rapprocher cette séquence de répression d’une PRE (Polycomb response element) de type végétal. / The aim of this work is to study the regulation of the transcription factor LEAFY COTYLEDON 2, which is a key regulator of seed developpement in Arabidopsis thaliana.Seeds have essential functions in the environnement for plant propagation and as embryo protective tools. Furthermore, numerous products issued from the agriculture or involved in human food (e.g. cereals, oil, flour) are based on seeds. Several industrial apllications depend, as well, on this organ such as oil production for human consumption, additives for some industrial processes, or biofuel synthesis.Seed developemental phases are dependant of a complex regulatory network composed in major part with transcription factors, that were found to be central components of plant evolution and domestication.LEC2, FUS3, ABI3 (three B3 type factors) and LEC1 (a CATT binding factor) are named AFL (ABI3, FUS3, LEC1, 2) genes, and are key regulators of Arabidopsis seed development. AFL genes are specifically expressed in embryo and repressed in vegetatives tissues. This repression has been principally studied in germinating seedlings and was shown to be caused by a set of transcription factors and chromatin structure modifiers.Beside the fact that LEC2 regulation has been extensively studied within the past few years, it was known that other mechanisms of repression and activation were still to be discovered. The work carried out on LEC2 presented here, mainly based on an extensive promoter deletion analysis, has allowed the discovery of three essential nucleotidic sequences necessary for a proper LEC2 promoter activity. The two first regulatory sequences are similar to a MADS box binding element and a GAGA binding site, and were found to be essentials for LEC2 promoter activity. The third sequence (named RLE for Repression of LEC2 Element) is 50bp long and lead to the repression of LEC2 promoter activity after onset of seed germination. A very strong correlation between RLE and the enrichment of H3K27me3 mark deposition at specific loci, suggests this sequence is the first PRE-like (Polycomb response element) element identified in plants.

O gene thi1 foi isolado a partir de uma biblioteca de cDNA de A. thaliana devido à sua capacidade de complementar mutantes de E. coli para rotas de reparo de DNA. O posterior seqüenciamento desse gene permitiu a identificação de similaridade com genes de fungos ativados em condições de estresse ou ativados na ausência de tiamina (vitamina B1). A síntese de tiamina é de grande importância já que na forma pirofosfatada é coenzima essencial para vários processos vitais das células. No presente estudo, foi realizada a caracterização funcional do gene thi1 utilizando-se, para tanto, linhagens de A. thaliana mutante e/ou com expressão diferencial desse gene. Foram analisados parâmetros biológicos como viabilidade de sementes, antioxidantes, danos no DNA, e atividade transcricional e traducional do gene thi1. Foi iniciado, também, o processo de padronização da quantificação de tiamina em plantas. Foi observado, para a linhagem mutante, menor viabilidade de sementes, maior produção de antioxidantes e maior quantidade de danos no DNA de cloroplastos. Quanto à atividade transcricional e traducional, foi observado que o gene thi1 apresenta um pico de expressão no período da tarde com um ritmo circadiano em potencial. Além disso, o acúmulo da proteína nos tecidos acompanha o perfil de expressão de RNAm thi1, o que sugere que o modo de regulação primária do gene é em nível transcricional. A análise comparativa de proteína por gel bi-dimensional entre as linhagens selvagem e mutante permitiu a identificação de quatro proteínas em maior quantidade na mutante, sendo duas identificadas por seqüenciamento: enolase e fosfoglicerato desidrogenase. Na análise de tiamina foi observado que a linhagem mutante acumula um composto, não identificado, que emite fluorescência no mesmo comprimento de onda que as tiaminas, sendo, provavelmente, um precursor do tiazol. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que THI1 defectivo acarretaria em desbalanço metabólico e, não necessariamente, que o gene thi1 estaria envolvido em dupla função. Em bactérias, entre os precursores de tiazol, estão a cisteína e o gliceraldeído 3-fosfato (G3P). O G3P em excesso seria deslocado para o ciclo de Calvin a fim de regenerar a ribulose 1,5-bisfosfato. Maior quantidade de G3P, maior taxa fotossintética, maior produção de ROS, maior produção de antioxidantes na mutante. A maior disponibilidade de G3P aumentaria o fluxo de glicólise e, consequentemente, de respiração mitocondrial, aumentando a taxa de ROS. A fosfoglicerato desidrogenase, em maior quantidade na mutante, está envolvida na síntese de cisteina que acarreta na produção de glutationa. A glutationa e a cisteína, por sua vez, atuariam induzindo o promotor da SOD, acarretando, então, na produção de mais antioxidantes. Todos esses antioxidantes estariam envolvidos na detoxificação de ROS presente em excesso na linhagem mutante, que levaria à menor viabilidade de sementes e maior quantidade de danos no DNA. Devido à grande quantidade de ROS, haveria superexpressão de enolase, envolvida no bloqueio da proliferação celular e, subsequentemente, em morte celular programada, o que explicaria o retardo no desenvolvimento da linhagem mutante / thi1 gene was previously isolated from A. thaliana cDNA library due to its capacity to complement mutant Escherichia coli defective in DNA repair. The late analyse of this gene showed its similarity with yeast genes activated under stress conditions or activated in the absence of thiamine. It means that THI1 has bifunctional activity, being involved in thiamine biosynthesis and repair/tolerance to DNA damage. The thiamine biosynthesis is important because its phosphorilated form is a coenzyme essential to several vital process at the cell. The repair/tolerance to DNA damage shows its importance because it is necessary to maintenance the genetic stability of the individual. In the present study, we report the functional characterization of thi1 gene using A. thaliana lines with differential expression of this gene. We analyzed the seed viability, the fresh weight of different lines, thi1 mRNA expression, the amount of protein produced and the expression in situ using the thi1-GUS construction in different conditions. Besides that we quantified free radicals in the wild-type (WT) and mutant lines and analysed the response of the mutant line, with defective THI1, to the production of antioxidant enzymes and non-enzimatics antioxidants. We also quantified DNA damage in chloroplast of WT and mutant lines and we did comparative proteomic analysis between and began the standardization of the thiamine quantification in plants. All these results together lead us up to a better understanding about THI1 activity at the cellular metabolism. Previous results suggested that besides thiamine synthesis, THI1 would be involved in repair/tolerance to DNA damage. Results obtained in this study strengthen the hypothesis of this another function of the thi1 gene. Considering that the mutant line does not produce a higher quantity of ROS, as indicated by hydrogen peroxide quantification, but shows more antioxidants and more DNA damage, probably the genetic material of this line is more susceptible to damage, showing that the defective THI1 protein could not protect it efficiently.