Mon travail de thèse s’est focalisé sur l’étude fonctionnelle de deux méthyltransférases (MTases) de la structure coiffe des ARNs, les protéines nsp14 et nsp16, chez le coronavirus responsable du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV). Notre étude a démonté un processus de méthylation séquentiel. La coiffe est d’abord méthylée en position N7 par nsp14 formant la coiffe-0 (7mGpppN). La coiffe-0 est ensuite méthylée en position 2’OH du premier nucléotide de l’ARN par nsp16 stimulée par nsp10 formant une coiffe 1 (7mGpppN2’Om). De plus, nos résultats suggèrent un mécanisme de régulation allostérique de l’activité de nsp16 par nsp10. Nos résultats indiquent que l’interaction nsp10/nsp16 est régulée par la variation de concentration du SAM et/ou de SAH. Le SAM présent à une concentration physiologique, environ 100 µM dans les cellules, favorise l’assemblage du complexe nsp10/nsp16. La faible concentration intracellulaire du SAH produit accélère la dissociation du complexe nsp10/nsp16 permettant le « turnover » de la réaction enzymatique. Par ailleurs, nous avons cartographié les résidus essentiels au recrutement de l’ARN par nsp16. Les méthylations étudiées jouent un rôle important dans la réplication virale. Nous avons donc criblé des inhibiteurs des deux MTases nsp14 et nsp10/nsp16 respectivement à partir des chimiothèques « Prestwick » et « 2P2I3D ». En résumé, mon travail de thèse a décortiqué les bases moléculaires de méthylation de la coiffe chez le MERS-CoV et a permis d’identifier des inhibiteurs de MTases représentant un point de départ crucial pour le développement d’antiviraux contre les CoV. / My PhD work focused on the functional study of two cap RNA methyltransferases (MTases), nsp14 and nsp16, of the Middle-East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV). Our study demonstrates a sequential methylation process. The cap is first methylated at the N7 position by nsp14 forming a cap-0 (7mGpppN). It is next methylated at the 2’OH position of the first transcribed nucleotide by nsp16 stimulated by nsp10 forming a cap-1 (7mGpppN2’Om). Furthermore, our results suggest an allosteric regulation mechanism of the nsp16 activity by nsp10. Moreover, our results indicate that the nsp10/nsp16 interaction is regulated by the variation of SAM and/or SAH concentration. SAM present at physiologic concentration, around 100µM in cells, enhances the assembly of nsp10/nsp16. The weak intracellular concentration of SAH by-product speeds up the dissociation of nsp10/nsp16 allowing the enzymatic reaction turnover. In addition, we have mapped the essential residues for the recruitment of the RNA by nsp16. The methylations studied in this work play an important role for viral replication. We have therefore screened inhibitors of nsp14 and nsp10/nsp16 MTases respectively from chemical libraries « Prestwick » and « 2P2I3D ». In summary, my PhD work deciphers the molecular bases of cap RNA methylation of MERS-CoV and identifies MTase inhibitors that represent a crucial starting point for the development of antivirals against CoV.

En 2002, notre équipe a montré que la stimulation de cellules primaires cortico-surrénaliennes bovines en culture primaire par l'hormone hypophysaire ACTH induisait l'expression du VEGF de manière indépendante de sa transcription. En effet, en réponse à l'ACTH, l'expression du VEGF est régulée au niveau post-transcriptionnel par la stabilisation/déstabilisation de son transcrit via des séquences riches en AU (ARE) situées dans la région 3‘ non traduite (3'UTR) de son ARNm. Le laboratoire a mis en évidence une protéine, TIS11b, exprimée également en réponse à une stimulation des cellules par l'ACTH, mais de manière concomitante avec la phase de déstabilisation de l'ARNm du VEGF. TIS11b appartient à une famille de protéines déstabilisatrices des ARNm via les séquences ARE. L'interaction de TIS11b avec l'ARNm du VEGF a été confirmée par la suite, et le site de liaison de la protéine à l'ARNm a également été identifié.<br /><br />Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse était d'évaluer la possibilité d'utiliser les propriétés déstabilisatrices de TIS11b sur l'ARNm du VEGF pour une thérapie anti-angiogène et anti-tumorale. Pour cela, la protéine a été vectorisée par la fusion de petits peptides ou PTD (protein transduction domain, Tat issu du VIH ou les polyarginines R7 et R9) lui permettant de traverser les membranes et d'atteindre sa cible intracellulaire, l'ARNm du VEGF. Nous avons pu montrer dans cette étude que 100 nM de protéines de fusion Flag-Tat-, Flag-R7- et Flag-R9-TIS11b sont capables d'induire une diminution du taux d'ARNm du VEGF ainsi que de la production de la protéine VEGF, dans des cellules en culture après 24 h d'incubation. De plus, nous avons pu montrer que l'injection de 100 nM de la protéine de fusion Flag-R9-TIS11b dans la glande corticosurrénalienne de souris, induisait une diminution d'environ 50 % de l'expression du VEGF par cette glande et que cette diminution était maintenue à 48 h. Des résultats préliminaires encourageants d'inhibition de croissance tumorale ont été obtenus avec l'injection de cette protéine de fusion dans des tumeurs pré-établies chez la souris nude, et doivent être confirmés.<br /><br />L'ACTH étant une hormone qui active la voie de l'AMPc et de la protéine kinase A (PKA), le deuxième objectif de ma thèse était de caractériser la phosphorylation de TIS11b par la PKA en réponse à une stimulation par l'ACTH et d'étudier les conséquences de cette phosphorylation sur son activité déstabilisatrice des ARNm. Nous avons pu montrer pour la première fois, que la PKA phosphoryle la protéine TIS11b, in vitro, au niveau de la sérine 54. Un deuxième site de phosphorylation en réponse à une stimulation par l'ACTH, via probablement une autre kinase que la PKA, a été mis en évidence au niveau de la sérine 334. Il semblerait que la protéine TIS11b comporte un domaine d'activation et un domaine d'inhibition susceptibles d'être régulés en réponse à une stimulation par l'ACTH. L'attribution de ces domaines aux sérines 54 et 334 nécessite des expériences complémentaires.

Le syndrome de l'X fragile est la cause la plus fréquente de retard mental héréditaire. Ce syndrome est du à l'absence de la protéine FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein). FMRPest exprimée dans de nombreux tissus, et surtout dans les neurones et dans les spermatogonies. Elle possède un signal de localisation nucléaire (NLS), et un signal d'export nucléaire (NES), des motifs de liaison à l'ARN (deux domaines KH et une boîte RGG). La présence d'un NLS et d'un NES suggère que FMRP fasse la navette entre le noyau et le cytoplasme pour le transport de l'ARNm. Bien que la sublocalisation et le rôle de FMRP dans le noyau ne soient pas encore connus, dans le cytoplasme FMRP est associée aux polyribosomes faisant partie d'un complexe ribonucléoprotéique où elle interagit avec ses deux homologues FXR1P et FXR2P. Deux structures de liaison pour FMRP ont été identifiées et caractérisées: le "purine-quartet" et le « kissing complex». Plusieurs ARN ont été identifiés comme cibles potentielles de FMRP. Ces ARN sont derégulés chez les souris Fmr1 nulles, mais la signification fonctionnelle de l'interaction FMRP/ARN reste toujours partiellement connue. <br />L'objectif principal de ma thèse étant la compréhension du mécanisme d'action de FMRP sur ces ARN cibles, ce projet a été abordé en deux points principaux :<br />-Recherche de l'influence des protéines qui interagissent avec FMRP sur sa capacité (affinité) à se lier à l'ARN<br />-Recherche de nouvelles séquences/structures cibles de FMRP et analyse du rôle de l'interaction FMRP/ARN.<br />Nous avons pu montrer une interaction spécifique uniquement entre l'isoforme musculaire de FXR1P avec la structure de G-quartet. Cela nous a permis d'établir un rôle synergique et non compensatoire de FXR1P sur FMRP. <br />D'un autre côté, nous avons démontré l'interaction spécifique de FMRP avec une nouvelle structure présente dans l'ARNm de la Sod1 que nous avons appelé SSLIP (Sod1 Stem Loops Interacting with FMRP). La distribution de SSLIP sur les polyribosomes est altérée en absence de FMRP ce qui conduit à une faible expression de la protéine Sod1. En utilisant un système de gène rapporteur, nous avons montré que l'interaction FMRP/SSLIP favorise la traduction de la Sod1 ce qui nous a permis d'établir un nouveau mécanisme d'action de la protéine FMRP sur ces cibles ARN.

Les épines dendritiques sont des petites protubérances remarquablement dynamiques à la surface des dendrites, correspondant à la partie postsynaptique des synapses excitatrices. En réponse à l'activité neuronale, leur géométrie et leur composition biochimique changent, modulant ainsi la force synaptique. Entres autres, la synthèse locale de nouvelles protéines et une modification de la composition protéique membranaire assurent ces changements. Nous avons montré que la ribonucléoprotéine Sam68 régule la traduction de l'ARNm du facteur d'élongation de la traduction eEF1A ; et que TLS, d'ordinaire nucléaire, est localisée dans les dendrites, près des synapses. Nous avons montré que les mutants de CHMP2B (membre du complexe endosomial ESCRT III et mutée dans une maladie neurodégénérative) affectent la morphologie des épines dendritiques, leur taille est réduite, et diminuent la proportion des courants synaptiques de grande amplitude.

Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire du système immunitaire qui, lorsque sa production est déréglée, induit de nombreuses pathologies chez l’homme (cachexie, arthrite rhumatoïde, etc.) Outre une régulation transcriptionnelle de cette cytokine, il existe aussi une régulation post-transcriptionnelle permettant un contrôle affiné de sa production. Le laboratoire de Biologie du Gène étudie cette régulation post-transcriptionnelle faisant intervenir une séquence consensus dans l’ARNm appelée séquence AU-riche (ou ARE pour AU-rich element) et les protéines qui y sont impliquées. Généralement, les ARNm porteurs d’ARE codent pour des protéines dont l’expression est transitoire. Ces gènes requièrent un contrôle très précis de leur expression et c’est pourquoi, en plus d’être soumis à de nombreux contrôles transcriptionnels, la traduction et la stabilité de leurs ARNm sont très finement régulées. La réponse immune innée implique de nombreux ARNm de ce type. Jusqu’à présent, la fonction de la protéine TIAR dans la régulation de l’expression du TNF-α n’a pas été complètement élucidée. Outre le TNF-α, la participation à la réponse immune innée de nombreuses protéines encodées par des ARNm porteurs d’ARE pourrait conférer à la protéine TIAR un rôle de régulateur essentiel dans le contrôle de l’inflammation. Nous avons donc générés plusieurs lignées de macrophages RAW 264.7 surexprimant la protéine TIAR entière ou différents mutants de TIAR afin de déterminer, par une analyse globale par puces à ADN, les ARNm cibles de TIAR au cours de la réponse immune. Cette approche nous a permis de démontrer que la protéine TIAR exerce un contrôle sur le métabolisme de l’ARNm du TNF-α et de MKP-1 (MAP kinase phosphatase 1), une phosphatase majeure dans la voie de signalisation de la MAPK p38. Cette voie de signalisation joue un rôle essentiel dans la stabilisation et la traduction de nombreux ARNm porteurs d’ARE encodant des protéines de la réponse inflammatoire. D’autre part, nous avons voulu étudier in vivo la fonction de la protéine TIAR au cours de la réponse immune. Nous avons, dans ce but, généré des souris transgéniques surexprimant l’isoforme courte de la protéine TIAR. Si nous n’avons pas encore pu mesurer les effets d’une surexpression de TIAR sur la réponse inflammatoire chez ces souris, ces individus transgéniques ont révélé qu’une expression anormale de la protéine TIAR induit une létalité importante au cours du développement embryonnaire.

Le contrôle traductionnel est une étape critique de la régulation de l'expression des gènes impliqués dans le développement embryonnaire et de nombreux processus cellulaires. Au cours de l'initiation de la traduction chez les eucaryotes, le facteur eIF4E (eukaryotic Initiation Factor 4E) fixe la coiffe des ARNm et recrute la protéine eIF4G pour former le complexe d'initiation. L' interaction eIF4E/eIF4G est une étape clé de la régulation traductionnelle, faisant du site de liaison à eIF4E un lieu de compétition entre eIF4G, le répresseur général de la traduction 4E-BP et d'autres régulateurs appelés 4E-IPs (4E-interacting partners), qui partagent avec eIF4G un motif consensus de liaison à eIF4E. Longtemps considérée comme une protéine désordonnée, nous avons montré au cours de cette thèse que 4E-BP adopte en réalité une conformation repliée lorsqu'il se lie à eIF4E, impliquant une surface d'interaction plus importante. Ces résultats ont apporté un nouveau regard sur les interactions qui s'établissent entre eIF4E et ses partenaires, et ont fourni des informations cruciales pour l'établissement de nouvelles thérapies, notamment celles développées dans le cadre des cancers. Mon travail de thèse a également permis l'établissement d'un criblage de nouvelles 4E-IPs, basé sur une approche alliant analyses structurales, bioinformatiques et biochimiques. Parmi les 4E-IPs détectées, nous avons caractérisé la protéine Angel1, membre d'une famille de déadénylases. Ces résultats ont ouvert de nombreuses perspectives pour la compréhension du métabolisme des ARNm mais aussi celle des régulations traductionnelles spécifiques prenant pour cible moléculaire eIF4E

La FSH est une hormone clé dans la fonction de reproduction. La compréhension de ces mécanismes moléculaires est essentielle pour comprendre ses effets biologiques. Nous montrons ici pour la première fois que non seulement la FSH induit le recrutement de polysomes dans la cellule de Sertoli, mais qu’en plus, elle stimule la traduction de deux ARNm sélectivement, c-fos et vegfa. La p70S6K est impliquée dans ce mécanisme. La FSH active et induit le recrutement de la p70S6K sur la coiffe des ARNm où elle active ses cibles traductionnelles. Les β-arrestines, des protéines d’échafaudage qui régulent la signalisation du RFSH, semblent participer à l’activation de la p70S6K. La déplétion des β-arrestines augmente massivement le recrutement de la p70S6K à la coiffe et diminue son activité enzymatique. De plus, la p70S6K et les β-arrestines interagissent mais cette interaction ne semble pas modulée par la FSH. Nos résultats suggèrent que les β-arrestines séquestreraient la p70S6K inactive pour permettre son activation et son recrutement à la coiffe m7GTP en réponse à la FSH. Ce travail apporte de nouvelles connaissances sur le rôle de la FSH dans la traduction et les mécanismes de signalisation impliqués. / FSH is a key hormone of the reproductive function. A clear understanding of its molecular mechanism is essential to fully understand its biological effects. Here, we show for the first time that FSH not only enhances the assembly of polysomes but also stimulates the translation of at least two mRNA selectively, c-fos and vegfa, in Sertoli cells. p70S6K participates in this mechanism. FSH activates and enhaced p70S6K recruitment to the m7GTP cap structure of mRNA where this kinase phosphorylates its targets. β-arrestins, which are scaffolding proteins that regulate FSH signalling, seem to participate in p70S6K activation. Accordingly, β-arrestins depletion increased p70S6K recruitment to the cap and reduced its enzymatic activity. Importantly, p70S6K and β-arrestins interact but the interaction is not FSH-dependent. We assume that β-arrestins sequester inactive p70S6K to activate it locally and then p70S6K translocates to the cap in response to FSH. In conclusion, this work brings new knowledge about FSH function in translational control and the signaling mechanisms involved.

Environ un tiers des maladies humaines, héréditaires ou acquises, sont dues à la génération d’un codon stop prématuré (PTC). Le système de contrôle appelé dégradation des ARNm non-sens (NMD) permet de détecter puis de dégrader des ARNm contenant un PTC. Les facteurs principaux de la NMD : UPF1, UPF2 et UPF3 reconnaissent les PTCs en interagissant avec le complexe de terminaison de traduction contenant les ribosomes, les facteurs de terminaison eRF1, eRF3 et la protéine poly(A) binding (Pab1p en levure). Nous avons pu résoudre la structure d'un tel complexe en levure comprenant un ribosome en cours de traduction en présence d’un ARNt dans le site P et de facteurs de terminaisons dans le site A. Aucune densité n’a pu être observée pour Pab1p indiquant la flexibilité de l’interaction avec ce complexe. Nous avons aussi évalué l’impact des facteurs de la NMD sur la terminaison dans un système de traduction in vitro humain. UPF3B retarde la reconnaissance du codon stop et favorise la dissociation des sous-unités ribosomales. UPF2 abolit l’effet de UPF3B tandis que l’addition de UPF1 n’a pas d’influence dans la terminaison. Par in vivo et in vitro pulldowns, nous avons montré que UPF3B interagit avec eRF3a et UPF1 et pourrait constituer le lien manquant entre la terminaison et la NMD. Nos résultats illustrent la complexité des mécanismes de la terminaison et de la NMD. / Premature termination codons (PTCs) account for approximately one third of inherited and acquired diseases. A surveillance pathway called nonsense-mediated mRNA decay (NMD) detects and degrades PTC-containing transcripts. NMD core factors UPF1, UPF2 and UPF3 mediate the recognition of PTCs by associating with the terminating translation machinery composed of the ribosome, the release factors eRF1 and eRF3 and the poly(A) binding protein (Pab1p in yeast). Using electron cryo-microscopy, we solved such a complex in yeast and observed the translating ribosome, containing a P-site tRNA and an A-site density for the release factors but not for Pab1p indicating that Pab1p is flexibly bound. We also probed the function of NMD factors in mammalian termination using a reconstituted human in vitro translation system. Surprisingly, we found that UPF3B delayed stop codon recognition and promoted ribosomal dissociation. The addition of UPF2 could abolish UPF3B’s effect on translation termination. UPF1 had no influence in the termination process alone or in combination with UPF2. Using in vitro and in vivo pulldowns we found that UPF3B interacts with eRF3a and UPF1, indicating that UPF3B could be the missing link between termination and NMD. Our results point to a complex interplay between the NMD factors and the termination apparatus.

L'élimination des cellules tumorales par le système immunitaire repose sur la capacité des cellules dendritiques à correctement présenter l'antigène aux cellules effectrices. Nous avons donc développé une stratégie de vaccination thérapeutique basée sur des lipopolyplexes à ARNm (LPRs) : l'ARNm codant pour l'antigène est associé à un complexe de polylysine histidylée, et incorporé dans un liposome trimannosylé afin de mieux cibler les cellules dendritiques. En effet, les cellules dendritiques expriment largement les lectines de type C, qui sont des récepteurs reconnaissant principalement des résidus mannose. Dans le travail présenté ici, nous montrons que les LPR trimannosylés sont capables de fixer les cellules dendritiques humaines et murines. De manière très intéressante, nous montrons aussi que les LPR trimannosylés injectés chez la souris induisent le recrutement et l'activation de cellules dendritiques dans le ganglion drainant. De plus, quand les LPR trimannosylés vectorisent un ARNm codant pour l'antigène tumoral E7, ils sont capables d'induire une réponse T spécifique d'E7 au niveau systémique. Enfin, les LPRs trimannosylés permettent une réponse thérapeutique lorsqu'ils sont utilisés dans trois différents modèles de tumeurs : le modèle TC1 de carcinome exprimant E7, le modèle B16 de mélanome exprimant MART1 et le modèle EG7 de lymphome exprimant OVA. Cette stratégie apparaît donc prometteuse comme thérapie innovante anti-cancer. / Elimination of cancer cells requires an efficient cytotoxic immune response. In order to obtain such a response, antigens need to be uptaken by dendritic cells (DCs) and correctly presented to effector cells. We developed a strategy based on RNA lipopolyplexes (LPRs): antigenic mRNA is associated with a histidine-polylysine polyplexe and incorporated in a trimannosylated liposome to better target dendritic cells (DCs) in vivo, as DCs express several C-Type lectin receptors that preferentially bind to mannose. Here, we report that trimannosylated LPRs are efficient to target both human and murine DCs. Interestingly, in vivo experiments reveal that trimannosylated LPRs not only target DCs but also induce their recruitment and activation in draining lymph nodes. Furthermore, when combined with mRNA encoding E7 oncoprotein from HPV16, trimannnosylated LPRs trigger specific T-cell response against E7. Finally, when used as therapeutic vaccines in three different tumors models, LPRs promote curative therapeutic responses in E7-expressing TC1 tumor, in OVA-expressing EG7 lymphoma and in MART-1-expressing B16 melanoma, when combined with E7, OVA or MART-1 mRNA, respectively. Altogether, these results comfort us to considerate the use of this strategy for anti-cancer vaccine therapies.

Rôle du métabolisme post-transcriptionnel des ARNm dans la régulation de la dormance des semences d’Arabidopsis thaliana.Une étude physiologique nous a permis d'identifier l'influence de la température et de l'humidité relative (HR) lors du stockage des graines dormantes d’Arabidopsis. Après une levée de dormance atteinte en 7 semaines avec des cinétiques variables selon les conditions, on observe une induction de la dormance secondaire à faible HR et une perte progressive de la viabilité à forte HR. La levée et l’induction de la dormance sont associées à la régulation de gènes liés aux voies de l'acide abscissique et des gibbérellines. Nous avons étudié la dynamique d’association des ARNm aux polysomes et comparé la transcription et la traduction des graines dormantes et non dormantes au cours de l’imbibition. Nous montrons qu'il n'y a pas de corrélation entre transcriptome et traductome et que la régulation de la germination est principalement liée à la traduction. Ceci suppose un recrutement sélectif et dynamique des ARNm liés aux polysomes dans les graines dormantes et non dormantes. Certaines caractéristiques de la région 5'UTR des transcrits semble impliquées dans la sélection des ARNm traduits pendant la germination. Les phénotypes de mutants d’éléments du catabolisme des ARN montrent que la dormance est également associée à une dégradation sélective des ARNm. Les P-bodies (localisés dans des lignées YFP-DCP1) sont d’ailleurs en quantité plus importante dans les graines non-dormantes. La comparaison des transcriptomes des mutants vcs-8 et xrn4-5 a permis l'identification de plusieurs transcrits dégradés via VCS ou XRN4, dont le rôle sur la dormance a été confirmé par génétique inverse. Certains motifs spécifiques semblent être impliqués dans la sélection de transcrits pour leur dégradation. / Role of mRNA post-transcriptional metabolism in the regulation of Arabidopsis thaliana dormancy.A physiological study allowed us to reveal the effect of temperature and relative humidity (RH) during Arabidopsis seed storage. Seven weeks of after ripening lead to alleviation of dormancy with different kinetics according to the conditions. Longer storage induced an induction of secondary dormancy at low RH and progressive loss of viability at high RH. Dormancy release and induction of secondary dormancy were associated with induction or repression of key genes related to abscissic acid and gibberellins pathways. We have studied the dynamics of mRNAs association with polysomes and compared transcriptome and translatome of dormant and non-dormant seeds. There was no correlation between transcriptome and translatome and germination regulation is largely translational, implying a selective and dynamic recruitment of mRNAs to polysomes in both dormant and non-dormant seeds. Some identified 5'UTR features could play a role in this selective. Dormancy is also associated with mRNA decay as demonstrated by phenotyping mutants altered in mRNA metabolism. Moreover we have shown that P-bodies were more abundant in non-dormant seeds that in dormant ones. Transcriptome analysis of xrn4-5 and vcs-8 mutants allowed us to identify several transcripts degraded via VCS ou XRN4 proteins, having a role in dormancy. This role was confirmed by reverse genetics for some of them. Some specific motifs were identified as involved in mRNA decay selection.