Les mécanismes moléculaires impliqués dans la fusion membranaire ont été amplement étudiés au cours des trente dernières années. Notre compréhension actuelle de ce phénomène est principalement basée sur des résultats obtenus par (1) le développement de modèles physiques décrivant la fusion des membranes biologiques, (2) l’étude mécanistique et structurale des protéines de fusion membranaire des virus à enveloppe et (3) l’étude des évènements de fusion intracellulaire médiés par les protéines SNARES dans les cellules eucaryotes. La découverte du complexe SNARE fut l’aboutissement de travaux interdisciplinaires qui ont exigés un large éventail de techniques tel que la génétique de la levure, l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la biochimie cellulaire, la biophysique expérimentale et l’imagerie. Tirant parti des paradigmes et techniques biophysiques qui ont émergés de ces études, nous avons examiné les fonctions et mécanismes de régulation des domaines « coiled-coil » dans les processus de fusion intracellulaire impliquant des protéines de la famille des Longin-SNAREs ou des Mitofusines, deux machineries protéiques de fusion dont le mode d’action exact reste encore peu clair. La conception exacte des mécanismes moléculaires de la fusion membranaire requiert la reconstitution in vitro des protéines de fusion dans un large spectre d’environnement membranaire avec des propriétés biophysiques définies et facilement modulables. Idéalement, ces systèmes membranaires devraient permettre à l’expérimentateur de contrôler la composition lipidique et protéique, ainsi que la topologie membranaire, afin de rendre compte de l’importante variabilité observée entre les différents compartiments de fusion cellulaire. La reconstitution dans des liposomes offre une incroyable flexibilité avec la possibilité de faire varier la plupart des paramètres clefs et de créer un environnement minimal dans lequel les facteurs solubles et/ou membranaires peuvent être ajoutés, seuls ou en combinaison, pour dévoiler leur rôle avec clarté. Nous avons mis au point des systèmes in vitro de reconstitution de protéines dans des plateformes membranaires artificielles pour nos deux systèmes d’études (les deux protéines Longin-SNAREs TI-VAMP et Sec 22b, ainsi que les domaines « coiled-coil » des Mitofusines) et nous avons réalisé des expériences biochimiques pour caractériser le mode d’action de ces protéines. L’objectif à long-terme de ce projet est de comparer les mécanismes moléculaires des machineries de fusion associés aux protéines SNAREs et Mitofusines, et ainsi de dévoiler des similitudes structurelles et fonctionnelles entre (1) leur protéines de fusion principales et (2) leur facteurs régulateurs. / The molecular mechanisms involved in membrane fusion have been extensively studied for the past thirty years. Our current understanding of this phenomenon is mainly based on results obtained by (i) the development of physical models describing the fusion of membranes, (ii) structural and mechanistic investigations on fusion proteins of enveloped viruses and (iii) studies of SNARE protein-mediated intracellular fusion events of eukaryotic cells. Discovery of the SNARE complex was the outcome of interdisciplinary works which involved a wide range of techniques including yeast genetics, electrophysiology, molecular biology, cell-free biochemistry, adhesion/fusion biophysics and imaging. Taking advantage of the paradigms and biophysical techniques that emerged from these studies, we investigated the function and regulation of coiled-coil domains in intracellular fusion processes involving Longin-SNAREs or Mitofusins, two fusion protein machineries whose exact mode of action still remains unclear. A comprehensive understanding of the molecular mechanisms of membrane fusion requires the in vitro reconstitution of fusion proteins into a wide variety of membrane environments with defined and tunable biophysical properties. Ideally, these membrane systems should allow the experimentalists to control the lipid and protein composition as well as the membrane topology, to account for the variability observed across cellular fusing compartments. Reconstitution into liposomes offers amazing flexibility with the capacity to vary most of these relevant parameters, and to create a minimal environment in which membrane and/or soluble factors can be added, one at a time or in combination, to reveal their role with clarity. We have set up the in vitro reconstitution of proteins into various artificial membrane platforms for both systems (the Longin-SNAREs TI-VAMP and Sec22b and the coiled-coil domains of Mitofusins) and performed biochemical assays to gain insight into how these proteins execute their functions. The long-term goal of this project is to compare the molecular mechanisms of SNARE and Mitofusin fusion machineries and thus reveal structural and functional similitudes between (i) their core fusion proteins, and (ii) their regulatory factors.

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la fusion membranaire ont été amplement étudiés au cours des trente dernières années. Notre compréhension actuelle de ce phénomène est principalement basée sur des résultats obtenus par (1) le développement de modèles physiques décrivant la fusion des membranes biologiques, (2) l’étude mécanistique et structurale des protéines de fusion membranaire des virus à enveloppe et (3) l’étude des évènements de fusion intracellulaire médiés par les protéines SNARES dans les cellules eucaryotes. La découverte du complexe SNARE fut l’aboutissement de travaux interdisciplinaires qui ont exigés un large éventail de techniques tel que la génétique de la levure, l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la biochimie cellulaire, la biophysique expérimentale et l’imagerie. Tirant parti des paradigmes et techniques biophysiques qui ont émergés de ces études, nous avons examiné les fonctions et mécanismes de régulation des domaines « coiled-coil » dans les processus de fusion intracellulaire impliquant des protéines de la famille des Longin-SNAREs ou des Mitofusines, deux machineries protéiques de fusion dont le mode d’action exact reste encore peu clair. La conception exacte des mécanismes moléculaires de la fusion membranaire requiert la reconstitution in vitro des protéines de fusion dans un large spectre d’environnement membranaire avec des propriétés biophysiques définies et facilement modulables. Idéalement, ces systèmes membranaires devraient permettre à l’expérimentateur de contrôler la composition lipidique et protéique, ainsi que la topologie membranaire, afin de rendre compte de l’importante variabilité observée entre les différents compartiments de fusion cellulaire. La reconstitution dans des liposomes offre une incroyable flexibilité avec la possibilité de faire varier la plupart des paramètres clefs et de créer un environnement minimal dans lequel les facteurs solubles et/ou membranaires peuvent être ajoutés, seuls ou en combinaison, pour dévoiler leur rôle avec clarté. Nous avons mis au point des systèmes in vitro de reconstitution de protéines dans des plateformes membranaires artificielles pour nos deux systèmes d’études (les deux protéines Longin-SNAREs TI-VAMP et Sec 22b, ainsi que les domaines « coiled-coil » des Mitofusines) et nous avons réalisé des expériences biochimiques pour caractériser le mode d’action de ces protéines. L’objectif à long-terme de ce projet est de comparer les mécanismes moléculaires des machineries de fusion associés aux protéines SNAREs et Mitofusines, et ainsi de dévoiler des similitudes structurelles et fonctionnelles entre (1) leur protéines de fusion principales et (2) leur facteurs régulateurs. / The molecular mechanisms involved in membrane fusion have been extensively studied for the past thirty years. Our current understanding of this phenomenon is mainly based on results obtained by (i) the development of physical models describing the fusion of membranes, (ii) structural and mechanistic investigations on fusion proteins of enveloped viruses and (iii) studies of SNARE protein-mediated intracellular fusion events of eukaryotic cells. Discovery of the SNARE complex was the outcome of interdisciplinary works which involved a wide range of techniques including yeast genetics, electrophysiology, molecular biology, cell-free biochemistry, adhesion/fusion biophysics and imaging. Taking advantage of the paradigms and biophysical techniques that emerged from these studies, we investigated the function and regulation of coiled-coil domains in intracellular fusion processes involving Longin-SNAREs or Mitofusins, two fusion protein machineries whose exact mode of action still remains unclear. A comprehensive understanding of the molecular mechanisms of membrane fusion requires the in vitro reconstitution of fusion proteins into a wide variety of membrane environments with defined and tunable biophysical properties. Ideally, these membrane systems should allow the experimentalists to control the lipid and protein composition as well as the membrane topology, to account for the variability observed across cellular fusing compartments. Reconstitution into liposomes offers amazing flexibility with the capacity to vary most of these relevant parameters, and to create a minimal environment in which membrane and/or soluble factors can be added, one at a time or in combination, to reveal their role with clarity. We have set up the in vitro reconstitution of proteins into various artificial membrane platforms for both systems (the Longin-SNAREs TI-VAMP and Sec22b and the coiled-coil domains of Mitofusins) and performed biochemical assays to gain insight into how these proteins execute their functions. The long-term goal of this project is to compare the molecular mechanisms of SNARE and Mitofusin fusion machineries and thus reveal structural and functional similitudes between (i) their core fusion proteins, and (ii) their regulatory factors.

Une hypothèse dominant actuellement les théories sur l’évolution des capacités syntaxiques est celle d’une spécificité humaine pour le traitement des grammaires supra-régulières. Cette hypothèse est supportée par les données comparatives actuellement disponibles, qui ne fournissent pas de démonstration non ambiguë de cette capacité chez une autre espèce. Dans cette thèse, nous avons adopté une nouvelle approche consistant à examiner si ces échecs pourraient découler de la difficulté que représente l'extraction de régularités non-adjacentes. Pour tester cette hypothèse, nous avons mené une série de quatre études chez le babouin de guinée (Papio papio) et l’humain. La première étude montre que les babouins requièrent une quantité d’exposition beaucoup plus importante que l’humain pour apprendre des associations non-adjacentes. Dans une seconde étude, les babouins ont pu généraliser des patterns basés sur une répétition adjacente ou non-adjacente d’un élément, mais ils se sont montrés davantage sensibles à ces premiers. Une troisième étude, corrélationnelle, révèle que les babouins se montrant sensibles aux régularités non-adjacentes ne sont pas ceux obtenant les meilleures performances pour l’apprentissage de dépendances adjacentes. Une dernière étude suggère que les babouins sont sensibles à une structure en miroir (impliquant des dépendances centrées-emboitées), mais pas à une structure en copie (à dépendances croisées). Ces résultats mettent au jour une importante continuité des capacités syntaxiques au sein de la lignée des primates, mais révèlent également des différences inter-spécifiques importantes dans les contraintes mnésiques pesant sur celles-ci. / A current dominant hypothesis on the evolution of syntactic abilities propose that the processing of supra-regular grammars is a unique human capacity. In support of this hypothesis, artificial grammar learning studies conducted so far do not provide unambiguous demonstration of this capacity in a non-human species. In this thesis, we adopted a new approach by studying cognitive prerequisites for supra-regular grammar processing. Our hypothesis was that these previous failures could be attributed to a bias in these species towards the exploitation of local regularities and difficulties for processing more distant relationships, rather than an inability to master supra-regular grammars. We conducted a series of experiments in Guinea baboons (Papio papio) and humans to assess this hypothesis. In a first experiment, we show that baboons need much more exposure than humans to learn non-adjacent associations. In a second study, we show that baboons can generalize patterns involving an adjacent or a non-adjacent repetition of an element, but that they are more sensitive to the former. A third, correlational, study reveal that baboons succeeding to extract non-adjacent regularities are not those showing the best performance in learning local ones. A last study suggest that baboons are sensitive to a mirror structure (involving center-embedded dependencies), but not to a copy structure (crossed dependencies). Overall, our results reveal a stronger continuity in grammar processing capacities within the primate order than previously thought, but also highlight important species differences in memory constraints.

Pour profiter des nombreux services offerts via Internet et "surfer" sur la toile comme quiconque, les personnes handicapées ont recours à des aides techniques. Des normes ont été établies pour assurer la compatibilité des sites web avec les aides techniques, et des lois ont été instaurées pour en imposer le respect. Néanmoins encore trop peu de sites web respectent ces normes et sont de ce fait inaccessibles aux personnes handicapées. Lors de ce travail, nous avons cherché à améliorer l'accessibilité du web aux personnes handicapées, en contribuant à l'adaptation "du" web (ou adaptation du contenu, c'est-à-dire en développant des outils pour aider les webmestres à rendre leur site accessible au regard des normes) ainsi qu'à l'adaptation "au" web (ou adaptation de l'utilisateur).

Résumé La plage du Clipon est une plage artificielle de 13 km de long, créée à partir des années 1960, suite à l'extension du Port de Dunkerque. Notre étude est basée sur une approche multi-échelle : une échelle temporelle s'étendant du demi-siècle à la période d'une marée, et l'échelle spatiale allant de l'analyse de la dynamique morphologique de l'ensemble de la plage (104 m) à l'examen des processus morphosédimentaires au niveau de formes élémentaires comme les barres intertidales (101 - 102 m). L'analyse à grande échelle concerne (1) les variations du trait de côte lors des différentes phases d'extension du port, et suite aux travaux d'extension à l'aide d'un suivi chronoséquentiel de photographies aériennes verticales, (2) l'évolution de la bathymétrie proche de la côte au cours des aménagements portuaires et suite à ces aménagements, ainsi que (3) la modélisation de la propagation des houles sur des bathymétries datant de différentes époques, ce qui a permis d'apprécier la variabilité dans le temps de l'impact potentiel des houles à la côte au fur et à mesure que les fonds se sont modifiés. Plusieurs campagnes de mesures hydrodynamiques, topométriques et de transport sédimentaire ont été effectuées de 2003 à 2007 dans le but de mieux comprendre la morphodynamique de la plage. Les données de houle et de courant obtenues sur l'estran et dans les petits-fonds ont été utilisées conjointement aux données météorologiques pour réaliser une analyse de l'hydrodynamique du système côtier. Cette analyse a mis en évidence la dominance des courants de flot, dirigés vers l'est, mais aussi l'existence d'un contre-courant associé à la présence de la jetée est de l'avant-port. Les résultats de l'analyse morphométrique de l'estran montrent une grande variabilité spatiale de la forme générale et de la largeur de la plage. A l'échelle annuelle, l'avant-plage proche subit une érosion pouvant atteindre 0,3 mètre par an. Le suivi mensuel des profils de plage a permis d'observer la réaction des différentes zones morphologiques de l'estran face aux conditions rencontrées pendant les campagnes de mesure : lissage de l'estran lors des périodes de forte énergie et développement et migration des barres vers le haut de plage par temps plus calme. L'analyse des transports sédimentaires potentiels montre un transport faible dirigé essentiellement vers l'est lors des périodes de temps calmes. Les transports les plus importants s'effectuent principalement lors de conditions de forte énergie, pendant lesquelles le vent peut fortement renforcer les courants tidaux et les courants de houle. Lors des conditions de fortes agitations de secteur nord, un courant d'undertow se met en place sur l'ensemble de la plage entraînant un déplacement des sédiments vers le bas de plage et l'avant-plage. L'ensemble des résultats recueillis permet de définir la plage du Clipon comme une cellule sédimentaire quasi-fermée montrant une tendance vers un bilan sédimentaire négatif.

Tous les organismes vivants convertissent leurs informations génétiques en protéines fonctionnelles par des mécanismes de transcription/traduction. Ces phénomènes fondamentaux de la biologie sont maintenant maitrisés au niveau biochimique, et il est possible par le biais de systèmes dits " cell free " de produire des protéines in vitro à partir de fragments d'ADN synthétiques. Ces systèmes minimaux d'expression génique représentent autant un outil fondamental pour la compréhension des mécanismes du vivant qu'une plateforme pour de nombreuses applications biotechnologiques. Néanmoins, le contrôle (déclenchement, régulation) de ces systèmes reste limité en comparaison de leurs analogues naturels. Dans cette thèse, j'explore tout d'abord des moyens de régulation de l'expression en système cell-free par voie métabolique, en étudiant l'influence de différents facteurs biochimiques ou énergétiques. Je m'intéresse ensuite à la mise en place d'un contrôle réversible en exploitant un couplage antibiotique/enzyme. Je montre également que l'inhibition produite par cet antibiotique peut être exploitée pour étudier les cinétiques de maturation des protéines fluorescentes. Enfin, je décris un protocole innovant de préparation de protéoliposomes géants fonctionnels permettant à la fois l'expression in situ de protéines membranaires eucaryotes et leur modification post-traductionnelle. Cette approche est appliquée en particulier pour la reconstitution de pores membranaires déclenchables par voie thermique ou enzymatique. / Throughout Transcription and Translation, every single living organism converts the genetic information it carries into functional proteins. These fundamental mechanisms are nowadays mastered up to their biochemical level, enabling us to produce in vitro proteins from synthetic DNA fragments, by the use of so called Cell-free systems. This minimalistic approach of gene expression represents both a tool to unravel biological mechanisms and a platform to develop new biotechnology applications. In spite of these credits, controlling these systems (triggering, regulation) is still scarcely achieved. The aim of the thesis is first of all to explore new means of metabolic regulation for gene expression in cell-free systems, by studying the influence on expression levels of biochemical and energetic factors. I then focus the research to establish a reversible control comprising the coupling of an enzyme and an antibiotic. Moreover, I demonstrate that the inhibition caused by this antibiotic can be used to study the maturation kinetics of fluorescent proteins. Finally, I describe an innovative, one-pot, protocol to prepare functional giant proteoliposomes, enabling simultaneously in situ expression of the eukaryotic membrane proteins and their post-translational modifications. This approach is then applied to reconstitute membranous pores triggered by thermal changes or specific enzymatic activity.

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la fusion membranaire ont été amplement étudiés au cours des trente dernières années. Notre compréhension actuelle de ce phénomène est principalement basée sur des résultats obtenus par (1) le développement de modèles physiques décrivant la fusion des membranes biologiques, (2) l’étude mécanistique et structurale des protéines de fusion membranaire des virus à enveloppe et (3) l’étude des évènements de fusion intracellulaire médiés par les protéines SNARES dans les cellules eucaryotes. La découverte du complexe SNARE fut l’aboutissement de travaux interdisciplinaires qui ont exigés un large éventail de techniques tel que la génétique de la levure, l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la biochimie cellulaire, la biophysique expérimentale et l’imagerie. Tirant parti des paradigmes et techniques biophysiques qui ont émergés de ces études, nous avons examiné les fonctions et mécanismes de régulation des domaines « coiled-coil » dans les processus de fusion intracellulaire impliquant des protéines de la famille des Longin-SNAREs ou des Mitofusines, deux machineries protéiques de fusion dont le mode d’action exact reste encore peu clair. La conception exacte des mécanismes moléculaires de la fusion membranaire requiert la reconstitution in vitro des protéines de fusion dans un large spectre d’environnement membranaire avec des propriétés biophysiques définies et facilement modulables. Idéalement, ces systèmes membranaires devraient permettre à l’expérimentateur de contrôler la composition lipidique et protéique, ainsi que la topologie membranaire, afin de rendre compte de l’importante variabilité observée entre les différents compartiments de fusion cellulaire. La reconstitution dans des liposomes offre une incroyable flexibilité avec la possibilité de faire varier la plupart des paramètres clefs et de créer un environnement minimal dans lequel les facteurs solubles et/ou membranaires peuvent être ajoutés, seuls ou en combinaison, pour dévoiler leur rôle avec clarté. Nous avons mis au point des systèmes in vitro de reconstitution de protéines dans des plateformes membranaires artificielles pour nos deux systèmes d’études (les deux protéines Longin-SNAREs TI-VAMP et Sec 22b, ainsi que les domaines « coiled-coil » des Mitofusines) et nous avons réalisé des expériences biochimiques pour caractériser le mode d’action de ces protéines. L’objectif à long-terme de ce projet est de comparer les mécanismes moléculaires des machineries de fusion associés aux protéines SNAREs et Mitofusines, et ainsi de dévoiler des similitudes structurelles et fonctionnelles entre (1) leur protéines de fusion principales et (2) leur facteurs régulateurs. / The molecular mechanisms involved in membrane fusion have been extensively studied for the past thirty years. Our current understanding of this phenomenon is mainly based on results obtained by (i) the development of physical models describing the fusion of membranes, (ii) structural and mechanistic investigations on fusion proteins of enveloped viruses and (iii) studies of SNARE protein-mediated intracellular fusion events of eukaryotic cells. Discovery of the SNARE complex was the outcome of interdisciplinary works which involved a wide range of techniques including yeast genetics, electrophysiology, molecular biology, cell-free biochemistry, adhesion/fusion biophysics and imaging. Taking advantage of the paradigms and biophysical techniques that emerged from these studies, we investigated the function and regulation of coiled-coil domains in intracellular fusion processes involving Longin-SNAREs or Mitofusins, two fusion protein machineries whose exact mode of action still remains unclear. A comprehensive understanding of the molecular mechanisms of membrane fusion requires the in vitro reconstitution of fusion proteins into a wide variety of membrane environments with defined and tunable biophysical properties. Ideally, these membrane systems should allow the experimentalists to control the lipid and protein composition as well as the membrane topology, to account for the variability observed across cellular fusing compartments. Reconstitution into liposomes offers amazing flexibility with the capacity to vary most of these relevant parameters, and to create a minimal environment in which membrane and/or soluble factors can be added, one at a time or in combination, to reveal their role with clarity. We have set up the in vitro reconstitution of proteins into various artificial membrane platforms for both systems (the Longin-SNAREs TI-VAMP and Sec22b and the coiled-coil domains of Mitofusins) and performed biochemical assays to gain insight into how these proteins execute their functions. The long-term goal of this project is to compare the molecular mechanisms of SNARE and Mitofusin fusion machineries and thus reveal structural and functional similitudes between (i) their core fusion proteins, and (ii) their regulatory factors.

Depuis la révolution industrielle, la chimie ne cesse de prospérer en développant des procédés de plus en plus performants souvent aux dépens de l’environnement. Dans le cadre du développement d’une chimie durable, des procédés catalytiques dans le domaine de la chimie d’oxydation sont mis en place en utilisant des métaux physiologiques et des oxydants doux. En combinant les avantages de la catalyse homogène et de la biocatalyse, de nouveaux catalyseurs bio-inspirés ont émergé, les métalloenzymes artificielles. Elles sont constituées d’un complexe inorganique, choisi en fonction de la réaction visée, qui est ancré au sein d’une protéine, qui apporte la sélectivité de la réaction. Au cours des travaux de cette thèse, de nouvelles métalloenzymes artificielles ont été créées par ancrage de divers complexes de Fe ou de Ru au sein de la protéine NikA. Dans un premier temps, l’hybride NikA/Ru-bpza a été synthétisé pour réaliser l’hydroxychloration d’alcènes en présence d’un iode hypervalent. Bien que d’excellentes propriétés catalytiques aient été obtenues, l’amélioration de la stabilité de ce type de catalyseurs, en particulier pour des réactions d’oxydation, reste un challenge important à relever pour leur utilisation au niveau industriel. Une des solutions originale est basée sur le développement de la catalyse hétérogène, en utilisant de cristaux de métalloenzymes artificielles grâce à la technologie CLEC (Cross-Linked Enzyme Crystals). Cette technologie permet, d’une part, d’améliorer la stabilité et la recyclabilité des catalyseurs, et d’autre part, d’élargir les conditions réactionnelles utilisées (solvants, pH, températures). Trois réactivités ont été développées à base de CLEC NikA/FeL : (i) la sulfoxydation de thioéthers, (ii) l’hydroxychloration d’alcènes en présence d’Oxone® et de chlore et (iii) la coupure oxydante d’alcènes par activation d’O2. Ces résultats ont permis d’explorer de nouvelles réactivités en chimie cascade soit en combinant les CLEC mis au point, soit en combinant différents catalyseurs homogènes. / Since the industrial revolution, chemistry has continually thriven by developing new efficient processes at the expense of the environment. As an example, oxidation reactions are performed under harsh conditions with the use of toxic oxidants. With the emergence of green chemistry, catalytic processes using physiological metals and soft oxidants are privileged. Combining the advantages of biocatalysis and homogeneous catalysis, the design of novel bioinspired catalysts, consisting on the synthesis of artificial enzymes has recently emerged. These hybrids are composed of an inorganic complex, driving the reactivity of the enzyme, inserted into a protein, which drives the reaction selectivity. The thesis described new developments in original artificial metalloenzymes, based on the use of the NikA protein and Fe or Ru catalysts. First, a new hybrid has been developed by anchoring the Ru-bpza complex to NikA to catalyze alkene hydroxychloration with hypervalent iodine. Although excellent catalytic efficiencies were obtained, the stability improvement remains a major challenge for the industrial use of these catalytic processes, especially when oxidation chemistry is concerned. One possible strategy is based on the development of heterogeneous catalysis, by using a crystal/solution version of the artificial metalloenzymes thank to the cross-linked enzyme crystals (CLEC) technology. On the one hand, this technology allows to increase the stability and the recyclability of the catalysts. On the other hand, catalysis can be performed under a various reactions conditions (organic solvent, temperature, pH). Three reactivities have been developed with NikA/FeL-CLEC catalysts: (i) thioether sulfoxidation with NaOCl, (ii) alkene hydroxychloration with Oxone® and chloride source and (iii) oxidative cleavage of alkenes by O2 activation. To go further, new reactivities in cascade reactions have been explored combining either NikA-based CLEC developed, or different homogenous catalysts.

La création de nouvelles fonctions basées sur la reconnaissance protéique et sur l'assemblage de domaines est un enjeu majeur en biotechnologie et est un moyen de comprendre les relations structures/fonctions des protéines engagées dans des processus d'interactions. Aujourd’hui, des bibliothèques de protéines artificielles obtenues par ingénierie peuvent être sources de protéines aux propriétés de reconnaissance analogues à celles des dérivés d’anticorps.L’équipe Modélisation et Ingénierie des Protéines a ainsi construit une banque de protéines à motifs structuraux répétés appelées « alphaReps ». Les alphaReps présentent des propriétés remarquables en termes de production et de stabilité. Contrairement à la plupart des anticorps et dérivés d’anticorps, elles peuvent même s’exprimer sous forme fonctionnelle dans le cytoplasme de cellules eucaryotes. De tels objets peuvent donc maintenant être utilisés comme des briques élémentaires en vue d’une ingénierie modulaire. Ainsi la construction de nouvelles fonctions de reconnaissance optimisées tant au niveau de la spécificité que de l’affinité sera possible en réarrangeant et/ou dupliquant ces briques élémentaires.Un premier volet de ce projet de thèse a consisté à construire puis étudier les propriétés biophysiques de protéines bidomaines basées sur les alphaReps afin de mieux comprendre les comportements adoptés par de telles constructions. Outre l’aspect fondamental de cette question, cette étude donnera « les règles » pour moduler de façon contrôlée les interactions entre ces protéines. Les résultats montrent qu'il est possible de créer de nouvelles fonctions par simple ajout d'un linker entre deux alphaReps : avidité, coopérativité, changement de conformation.Dans un second temps, l’objectif a été de développer, à partir des protéines bidomaines précédemment étudiées, de nouveaux biosenseurs basés sur le FRET (Förster Resonance Energy Transfer) pouvant être utilisés in vivo et in vitro. Cette deuxième partie présente deux biosenseurs avec des limites de détection de l'ordre du nanomolaire. Les alphaReps utilisées dans ces constructions pouvant être changées en fonction de la cible souhaitée, il s'agit ici d'une preuve de concept pouvant être généralisée à n'importe quelle cible.Enfin la dernière partie de cette thèse s'est portée sur la conception et l'étude de nouveaux biosenseurs génétiquement codables. Ces biosenseurs présentent notamment l’avantage d’être utilisables immédiatement après production et ne nécessitent donc plus d’étape de couplage chimique. Les résultats obtenus montrent que la création de tels biosenseurs est possible mais qu’une optimisation reste encore nécessaire pour améliorer leur spécificité, leur stabilité et leur capacité de détection. / The creation of new protein functions based on recognition and molecular assembly is not only a major goal in biotechnology but is also a means to understand the relation structure/function of proteins involved in interaction processes. Today, libraries of artificial proteins obtained by engineering can be a source of proteins with recognition properties similar to the properties of antibodies.The team Protein Engineering and Modeling has thus created a library of proteins with structural repeats called the “alphaReps”. The alphaReps present remarkable properties in terms of production and stability. Unlike most of the antibodies and their derivatives, they can even be expressed and functional in the cytoplasm of eukaryotic cells. Such objects can therefore be used as building bricks in modular engineering. The construction of new optimized recognition functions both in specificity and in affinity can then be possible by rearranging or duplicating these elementary bricks.The first part of this thesis project consisted in the construction and study of the biophysical properties of bidomain proteins based on alphaRep in order to have a better understanding of the behaviour of such constructions. Beside the fundamental aspect of this question, this study will give the “rules” to modulate the interactions between these proteins in a controlled way. The results show that it is possible to create new functions such as avidity, cooperativity, conformational change, simply by adding a linker between two alphaReps.In a second step, the goal was to develop, with the bidomain proteins previously studied, new biosensors based on the FRET (Förster Resonance Energy Transfer) which can be used in vivo and in vitro. This second part presents two biosensors with limits of detection in the nanomolar range. Since the alphaReps used in these constructions can be changed depending on the chosen target, it is a proof of concept which can be adapted to any desired target.Finally, the third part of this thesis focused on the development of genetically codable biosensors. These biosensors have the particular advantage of being usable directly after production and therefore no longer require a chemical coupling step. The results show that the development of such biosensors is worth considering but an optimization is still required in order to improve their specificity, their stability and their detection capacity.

Lors de l'irrigation des cultures de tomate produites en serre, une partie importante de l'eau enrichie en engrais est rejetée dans l'environnement afin de contrôler la conductivité électrique du milieu de culture et l'équilibre ionique de la solution du sol. Plusieurs contraintes limitent la réutilisation de cette eau, par exemple une surcharge de l'eau en ions sulfates (SO₄²⁻) et la présence d'agents pathogènes, comme Pythium ultimum ou Fusarium oxysporum. Les objectifs de cette recherche étaient de (1) réduire les SO₄²⁻ en présence d'ions nitrates (NO₃⁻), (2) éliminer les agents pathogènes P. ultimum et F. oxysporum présents dans l'effluent de serre, (3) évaluer l'effet suppresseur de ces eaux traitées envers la pourriture pythienne, (4) comparer la croissance de plants de tomate irrigués avec les eaux traitées par les marais, (5) comprendre l'effet de différents amendements de C dans les marais filtrants sur la diversité métabolique et phylogénétique des populations microbiennes, et finalement (6) évaluer la capacité de bioréacteurs passifs à réduire les SO₄²⁻en présence d'ions NO₃⁻ , et à éliminer les agents pathogènes P. ultimum et F. oxysporum. Nos résultats ont démontré l'importance de la quantité et de la qualité de la source exogène de carbone (C) pour réduire les ions NO₃⁻ et SO₄²⁻. Pour un enlèvement optimal de SO₄²⁻et de NO₃⁻ (99 %), l'apport de C exogène doit atteindre les seuils C :N = 3,4 et COD: SO₄²⁻= 0,36. D'autre part, les marais filtrants ont été performants (99,99 %) à réduire les agents pathogènes P. ultimum et F. oxysporum, notamment par l'adsorption de ceux-ci au biofilm formé et par la production d'enzymes extracellulaires par les microorganismes. Le traitement des effluents par les marais confère également à l'eau des propriétés suppressives envers la pourriture pythienne. La quantité et la qualité du contenu en carbone utilisé pour amender les AWs ont eu une forte incidence sur l'activité métabolique des microorganismes pour l'utilisation des sources de N, P et S. Finalement, l'utilisation de bioréacteurs passifs a montré, par une activité microbienne importante, une efficacité similaire aux marais filtrants pour réduire les ions sulfates en présence de nitrates. De plus, les bioréacteurs passifs ont été aussi performants que les marais pour éliminer les agents pathogènes étudiés. L'utilisation des marais filtrants et des bioréacteurs constitue une alternative durable pour le traitement des effluents de serre.